結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒，本發(fā)該擴(kuò)增體系包括通用—特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物，通用—特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250；通用引物是FluD5-Up，通用—特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物；本發(fā)明的擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒克服了不同引物需多種熒光標(biāo)記的不足，在同一個(gè)PCR反應(yīng)體系中檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星基因位點(diǎn)，結(jié)果直觀可靠，省時(shí)高效，可有效的對(duì)MSI基因位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)分析?！緦＠f明】結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種PCR擴(kuò)增體系，以及使用該擴(kuò)增體系的檢測(cè)產(chǎn)品，屬于生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]結(jié)直腸癌在國(guó)內(nèi)外發(fā)病率均逐漸升高，是嚴(yán)重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，研究發(fā)現(xiàn)基因組的不穩(wěn)定性在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中占重要的地位?；蚪M的不穩(wěn)定性包括染色體不穩(wěn)定性(chromosomalinstability,Cl)和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatelliteinstability,MSI)。以往對(duì)于結(jié)直腸癌的發(fā)病研究表明，染色體不穩(wěn)定(chromosomeinstability)為結(jié)直腸癌發(fā)病的主要原因，染色體不穩(wěn)定性指全部染色體數(shù)量的增加或減少速度加快。而近年的研究發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性為結(jié)直腸癌發(fā)病的另一重要機(jī)制。[0003]微衛(wèi)星又稱短串聯(lián)重復(fù)序列(Shorttandemrepeats,STRs)、簡(jiǎn)單重復(fù)順序(Simplesequencesrepeats,SSRs),由I~6個(gè)核苷酸組成,具有高度多態(tài)性,廣泛存在于原核及真核生物基因組中，特別是以二核苷酸重復(fù)序列即(CA/GT)n最為常見，η為重復(fù)次數(shù)，通常為15~60次。微衛(wèi)星從基因的結(jié)構(gòu)分析，重復(fù)序列位于啟動(dòng)子、基因編碼區(qū)、內(nèi)含子區(qū)域或內(nèi)含子與外顯子的交界區(qū)。微衛(wèi)星能自身特異性的結(jié)合蛋白質(zhì)或直接編碼蛋白質(zhì)，有的則可能參與染色單體的折疊及端粒的形成等。微衛(wèi)星通過改變DNA結(jié)構(gòu)或通過與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮基因調(diào)控作用，是一類新的、多態(tài)信息容量高的分子標(biāo)記。[0004]微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是指由于復(fù)制錯(cuò)誤(replicationerror,RER)引起的簡(jiǎn)單重復(fù)序列的增加或丟失。其發(fā)生主要是參與配對(duì)錯(cuò)誤修復(fù)的基因功能缺陷而產(chǎn)生一種缺陷蛋白質(zhì)，因而不能正常的校正復(fù)制錯(cuò)誤，從而引起微衛(wèi)星DNA的改變，使其不能正常地發(fā)揮調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞增殖及分化異常，促發(fā)惡性腫瘤形成。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MSI與結(jié)直腸癌、胃癌、子宮內(nèi)膜癌等腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。大約15%的結(jié)直腸癌中存在MSI現(xiàn)象，其中典型的遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌(hereditarynon-polyposiscolorectalcancer,HNPCC)患者90%以上為MSI瘤。MSI檢測(cè)對(duì)結(jié)直腸癌患者其意義重大。與無MSI的結(jié)直腸癌相比，攜帶有MSI的結(jié)直腸癌其預(yù)后較好，并且二者藥物反應(yīng)也不一樣。1997年Bethesda指導(dǎo)綱要推薦應(yīng)用5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)來進(jìn)行結(jié)直腸癌的檢測(cè)，即單堿基重復(fù)序列BAT-25和BAT-26、雙堿基重復(fù)序列D2S123、D5S346和D17S250，并對(duì)MSI作出了定義。比較腫瘤和匹配的正常DNA,5個(gè)位點(diǎn)中有2個(gè)或2個(gè)以上位點(diǎn)有重復(fù)序列長(zhǎng)度變化者為高度MSI(highfrequencyMSI,MS1-H),若只有I個(gè)位點(diǎn)有長(zhǎng)度變化者為低度MSI(loWfrequencyMSI，MSI_L)，無任何位點(diǎn)的變化稱為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellitestable,MSS)。[0005]在2011年關(guān)于結(jié)直腸癌篩查的NCCNGuidelines中，MSI已成為首要檢測(cè)項(xiàng)目。①M(fèi)SI檢測(cè)可用于HNPCC的篩查。超過90%的HNPCC患者腫瘤組織表現(xiàn)MSI，MSI在HNPCC中已經(jīng)成為的重要標(biāo)志物；當(dāng)高度懷疑HNPCC時(shí)，需檢測(cè)MSI。②MS1-H的結(jié)直腸癌患者預(yù)后良好的標(biāo)志物。MS1-H結(jié)腸癌患者生存期更長(zhǎng)，較少?gòu)?fù)發(fā)，被認(rèn)為是預(yù)后好的標(biāo)志之一。③MSI檢測(cè)可用于氟尿嘧啶類藥物的輔助療效預(yù)測(cè)。2009年ASCO會(huì)議報(bào)道，在接受5-FU輔助化療的II期和III期結(jié)腸癌患者中，MSI是獨(dú)立的預(yù)后因素?，F(xiàn)有技術(shù)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性一般可通過如下2種方法檢測(cè):1)PCR法:選定特異的引物，以自身正常組織作對(duì)照，在體外對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳，經(jīng)各種顯示系統(tǒng)(放射自顯影、銀染等)分析有無遷移率的改變。[0006]2)基因檢測(cè)，即對(duì)相關(guān)的DNA直接進(jìn)行測(cè)序。但因進(jìn)行基因檢測(cè)價(jià)格昂貴，所需試驗(yàn)條件較高，在臨床應(yīng)用尚未普及。[0007]PCR法已成為目前常用檢測(cè)方法并已被證明是最有效的初篩手段。但普通PCR分管檢測(cè)五個(gè)微衛(wèi)星基因，產(chǎn)物做凝膠電泳的方法，存在操作繁瑣、成本高等諸多缺陷。[0008]中國(guó)專利201110152226.X公開了一種腫瘤細(xì)胞微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)的復(fù)合擴(kuò)增體系及檢測(cè)試劑盒，選取了8個(gè)準(zhǔn)單態(tài)性單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27、CAT-25)對(duì)MSI進(jìn)行PCR多重?cái)U(kuò)增檢測(cè)，為有效區(qū)分采用了3種熒光標(biāo)記物。而進(jìn)行多種熒光標(biāo)記在成本控制及操作性等方面存在諸多的不足，加入性別決定位點(diǎn)對(duì)于防止實(shí)驗(yàn)操作員混淆樣本方面的作用也是非常的有限。[0009]鑒于上述情況，提供一種改良的、便捷的、高靈敏度MSI檢測(cè)產(chǎn)品勢(shì)在必行?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0010]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種具有特定核苷酸序列的通用一特異嵌合引物組合，可以有效地減弱引物間的競(jìng)爭(zhēng)與干擾因素，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性和靈敏度高的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系及其檢測(cè)試劑盒，該擴(kuò)增體系可以實(shí)現(xiàn)在一個(gè)PCR體系內(nèi)采用單熒光標(biāo)記一次檢測(cè)5個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)`。[0011]本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題提出的一種技術(shù)方案是:一種結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，包括通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物；所述通用一特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250;所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物是Up-BAT25、Up_BAT26、Up_D2S123、Up-D5S346和Up-D17S250，相應(yīng)的反向引物是BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R；所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物；所述通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的核苷酸序列如下:【權(quán)利要求】1.一種結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:包括通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的混合物；所述通用一特異嵌合引物對(duì)分別針對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)BAT25、BAT26、D2S123、D5S346和D17S250;所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的正向引物是Up-BAT25、Up_BAT26、Up_D2S123、Up-D5S346和Up-D17S250，相應(yīng)的反向引物是BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R；所述通用引物是FluD5-Up，所述通用一特異嵌合引物對(duì)中的各個(gè)正向引物5’端設(shè)有FluD5-Up的序列，所述FluD5-Up為熒光標(biāo)記引物；所述通用一特異嵌合引物對(duì)和通用引物的核苷酸序列如下:2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物FluD5-Up的濃度是0.?μΜ~0.25μΜ。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物Up-BAT25的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I:25至I:15;所述引物Up_BAT26、Up-D2S123和Up-D5S346的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為I:50至I:30;所述引物Up-D17S250的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為1:5至1:3;所述引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123-R、D5S346-R和D17S250-R的濃度與引物FluD5-Up的濃度的比值為10:9至5:3。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:所述引物FluD5-Up的濃度是0.2μΜ，引物Up_BAT250.01PM、Up-BAT26、Up_D2S123和Up_D5S346的濃度都是0.005μΜ，引物Up-D17S25O的濃度是0.05μΜ，引物BAT25-R、BAT26-R、D2S123_R、D5S346-R和D17S250-R的濃度都是0.25μΜ。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:所述FluD5-Up的熒光標(biāo)記為Cy5、Cy3或FAM。6.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:所述擴(kuò)增體系的總體積為10μ1~20μ1。7.根據(jù)權(quán)利要求1至4之一所述的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性擴(kuò)增體系，其特征在于:還包括PCR緩沖液、1.5mM~2mM的Mg2+、0.2mM的dNTP、0.4U~0.6U的熱啟動(dòng)酶和10ng~200ng的DNA模板。8.—種釆用如權(quán)利要求1所述的擴(kuò)`增體系的結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒?！疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK103555843SQ201310541466【公開日】2014年2月5日申請(qǐng)日期:2013年11月5日優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日【發(fā)明者】趙新泰,王明申請(qǐng)人:上海賽安生物醫(yī)藥科技有限公司