一種可再生的磁性固定化酶載體及其制備方法
【專利摘要】一種可再生的磁性固定化酶載體及其制備方法，屬于固定化酶【技術(shù)領(lǐng)域】。包括合成磁性Fe3O4納米顆粒；制備核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@TiO2磁性納米復(fù)合物；制備銳鈦礦型Fe3O4@TiO2納米復(fù)合物，對該納米復(fù)合物表面進行功能化修飾從而得到Fe3O4@TiO2固定化酶載體等步驟。本發(fā)明制備的固定化酶載體綜合了磁性材料、納米材料、TiO2及表面功能基團修飾的優(yōu)點，具有磁響應(yīng)性、可再生利用、高生物相容性、與目標酶分子共價鏈接、酶荷載量高及穩(wěn)定性好等優(yōu)點。此外，本方法工藝簡單，反應(yīng)條件易控制。本發(fā)明可為酶提供性能優(yōu)異的固定化載體，能有效降低酶大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用的成本，在固定化酶領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
【專利說明】一種可再生的磁性固定化酶載體及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于固定化酶【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種可再生的磁性固定化酶載體及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酶是一類生物催化劑，絕大多數(shù)酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)。與化學(xué)催化劑相比，酶具有專一性強、催化效率高、反應(yīng)條件溫和、活性可控等優(yōu)點。但是酶不穩(wěn)定，極易受外部壞環(huán)境影響而失去催化活性。另外，大多數(shù)酶為水溶性，導(dǎo)致其在催化反應(yīng)后不易與底物和產(chǎn)物分離，不僅影響產(chǎn)物的純度同時也使酶不能重復(fù)利用，這增加了酶在工農(nóng)業(yè)應(yīng)用中的成本。
[0003]固定化酶技術(shù)的出現(xiàn)為克服酶的上述缺點和為酶的大規(guī)模應(yīng)用提供了有效途徑，是酶工程最為活躍的研究領(lǐng)域之一。固定化酶技術(shù)是酶工程的一個重要分支，是指通過物理或/和化學(xué)方法，將水溶性酶固定在特定的載體上或?qū)⒚赶拗圃谝欢ǖ目臻g范圍內(nèi)從而限制酶分子的運動，但仍然允許酶發(fā)揮其催化功能且反應(yīng)后酶可重復(fù)使用的一種技術(shù)。與游離酶相比，固定化酶在保留水溶性酶優(yōu)點的同時，獲得了可重復(fù)利用、穩(wěn)定性好、活性提高、工藝簡單、可規(guī)?；瘧?yīng)用等優(yōu)點。
[0004]固定化酶載體及酶與載體的固定化工藝是固定化酶的兩個關(guān)鍵技術(shù)。載體材料的結(jié)構(gòu)和性能對固定化酶的性能有著巨大的影響。設(shè)計和開發(fā)性能優(yōu)異、符合特定需求的載體材料是目前固定化酶研究領(lǐng)域的一個重點和熱點。隨著材料科學(xué)和酶固定化技術(shù)的發(fā)展，固定化酶載體材料已從起初的天然高分子材料向無機材料、合成高分子材料及復(fù)合材料等方向發(fā)展。近年來，磁 性納米材料由于其自身的優(yōu)點，在生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)、催化等領(lǐng)域的應(yīng)用潛力越來越受到人們的關(guān)注。作為固定化酶載體，磁性納米材料不僅具有納米材料所特有的小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)和宏觀量子隧道效應(yīng)而且還具有磁響應(yīng)性，使固定化酶在外部磁場的作用下易從反應(yīng)體系中分離和回收；另外，也可以通過外磁場控制固定化酶在反應(yīng)體系中的運動方向，這可以用來提高酶的催化效率。目前，已有文獻和專利報道了磁性納米顆粒用作固定化酶的載體。相關(guān)酶包括乙醇脫氫酶、葡萄糖氧化酶、氯過氧化物酶等。酶與磁性納米粒子組裝構(gòu)建的固定化酶實現(xiàn)了反應(yīng)后，在外部磁場下酶從反應(yīng)體系中的快速分離，以及酶的循環(huán)利用。此外，相對于微米級的酶載體，納米材料由于其比表面積的增加具有更高的酶負載能力，從而有利于催化效率的提高。另一方面，以物理吸附方式固定化的酶，親和性不高，容易導(dǎo)致催化反應(yīng)或者循環(huán)催化過程中酶從載體上脫離，這樣就大大降低了酶的循環(huán)利用次數(shù)。另外，將酶通過共價方式直接與磁性納米粒子連接，容易導(dǎo)致酶的活性和穩(wěn)定性降低，同時在這種情況下磁性納米粒子之間很容易聚集，分散性差。
[0005]通過磁性納米粒子表面功能化修飾或構(gòu)建磁性納米復(fù)合材料(如具有半導(dǎo)體外殼的復(fù)合磁性納米顆粒、各種功能基團修飾的納米復(fù)合微球等）可以提高固定化酶在溶液中的分散性，同時有效提高共價固定化酶的穩(wěn)定性。Xin Gao等制備了二氧化硅包被的磁性納米粒子，共價連接內(nèi)酰胺酶后，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定性有了很大提高（Chem.Commun.，2003, 24，2998-2999) ;ffen Wang等合成了具有高分子外殼的磁性納米粒子作為過氧化物酶的載體，這種磁性酶載體在酶的活性和多次循環(huán)利用方面都有很大的優(yōu)越性(J. Am. Chem. Soc.，2009, 131，12892 - 12893)。于洪巍等發(fā)明了一種磁性共價固定化酶載體的制備方法（專利號：201110201473)，通過對磁性納米粒子表面的修飾，實現(xiàn)了載體與酶分子間的共價偶氮連接。
[0006]以上磁性納米復(fù)合材料載體具有顯著的優(yōu)點，但其不足也十分明顯，如這些載體的生物相容性有待進一步提高，而載體的生物相容性與固定化酶的活性直接相關(guān)；另一方面，當荷載的酶經(jīng)過多次循環(huán)催化反應(yīng)后活性會逐漸降低甚至失活，最終導(dǎo)致這些載體的棄用，而新載體的合成必然提高生產(chǎn)成本。
[0007]二氧化鈦（TiO2)是一種無毒、壞境友好的生物相容性材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。2012年，Wan Fu Ma等人利用磁性TiO2納米顆粒（Fe3O4OTiO2NPs)的TiO2能和磷酸化多肽的磷酸根基團非共價作用的特性，從生物樣本中富集和分離磷酸化多肽(ACS Nano, 2012, 6，3179-3188.)。另外，TiO2因具有優(yōu)異的光催化活性，被廣泛用于有機污染物和微生物的光降解（Chemical Reviews, 1995, 95, 735-758. ) 0因光催化引起的自清潔特性為TiO2載體材料的再生利用提供了一條非常簡單而有效的途徑。
[0008]本專利結(jié)合了磁性納米材料和TiO2的優(yōu)點，構(gòu)建了表面功能化的具核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物，該復(fù)合物載體具有磁響應(yīng)性、分散效果好、可再生利用、生物相同性好、及與酶共價連接、對酶荷載能力強等優(yōu)點，是一種理想的固定化酶載體，在固定化酶領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的是提供一種可再生的磁性固定化酶載體及其制備方法。本發(fā)明通過合成銳鈦礦型磁性Fe3O4OTiO2納米材料并對其進行功能化修飾，從而使該固定化酶載體具有磁響應(yīng)性、分散效果好、可再生性利用、高生物相容性、與酶共價連接、對酶荷載量高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，是一種理想的固定化酶載體，在固定化酶領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。
[0010]為了實現(xiàn)上述發(fā)明目標，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：
[0011](a)制備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0012]Fe3O4磁性納米顆粒通過溶劑熱或水熱方法合成。
[0013]溶劑熱方法JfFeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20和乙酸鈉按摩爾比1:9~1:11混合后分散于乙二醇中，F(xiàn)eCl3 · 6H20*Fe(N03)3 · 9H20在乙二醇溶液中的濃度范圍為O. I~
O.15mol/L ;然后將得到的黃色溶液在200~220°C條件下反應(yīng)8~12h ;
[0014]水熱方法:向O. I~O. 2mol/L的FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調(diào)至7. O~8. 0，加熱至60~80°C，過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，凝膠經(jīng)洗滌后重新分散于水中，再用NaOH溶液將pH值調(diào)至10.0~11. 0，然后將得到的溶液在200~220°C條件下水熱反應(yīng)6~8h ;
[0015]上面步驟中所述在溶劑中分散的方法為磁力攪拌、機械攪拌或超聲波方法。
[0016]將溶劑熱方法或水熱方法得到的溶液轉(zhuǎn)移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒（Fe3O4NPsX (b)制備核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2NPs)：
[0017]將步驟（a)制備的100~200mg Fe3O4NPs采用機械攪拌或超聲波方法分散到200~300mL的乙醇、乙晴和NH3 -H2O的混合溶液中，乙醇、乙晴和NH3 -H2O的體積比160~200:40:1，再加入2~3mL鈦酸四丁酯并攪拌I~2h ;然后用外磁場分離收集得到磁性的Fe3O4OTiO2膠體納米粒子，將膠體納米粒子用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而得到核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子(Fe3O4OTiO2NPs)；
[0018](c)制備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物：
[0019]將步驟（b)制得的IOOmg Fe3O4OTiO2NPs采用機械攪拌或超聲波方法分散于100~200mL、60~70%(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2~3mL的NH3 · H2O,然后將得到的懸浮液在160~180°C條件下水熱反應(yīng)18~24h，棕色的反應(yīng)產(chǎn)物用外磁場分離收集后用無水乙醇清洗3~5次，再用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而制備得到銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物；
[0020](d)制備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：
[0021]將步驟（c)制備的銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物采用機械攪拌或超聲波方法分散于I~2% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（APTMS)水溶液中，并攪拌2~5h ;利用外磁場分離收集得到APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物，然后將其再分散于含2~3% (v/v)戊二醛的水溶液中，經(jīng)室溫孵育I~3h后獲得本發(fā)明所述的乙醛化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體，乙醒化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體可直接用于酶的固定化。
[0022]載體對酶的荷載及荷載量的計算：
[0023]將需固定化的酶配制成溶液，并與載體按一定比例充分混合；酶與載體的固定化反應(yīng)介質(zhì)為pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩沖液，反應(yīng)條件為室溫下I~2h或4°C下18~24h。
[0024]載體對酶的荷載量按下述方法計算：將步驟（d)制備獲得的固定化酶載體加入到一定濃度的酶溶液中，在室溫下孵育4~6h ;每隔30~60min用紫外分光光度法或考馬斯亮藍法測酶蛋白濃度，根據(jù)加入固定化酶載體后酶蛋白溶液濃度的改變值計算出載體對酶的荷載量。
[0025]固定化酶活力的檢測：
[0026]采用游離酶常規(guī)活力檢測方法，測定各種固定化酶的活力。
[0027]載體的再生方法：
[0028]固定化酶經(jīng)過多輪催化反應(yīng)后，酶的活性必然會下降或喪失。荷載低活性或無活性固定化酶的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物在紫外燈下照射3~5h ;然后利用外磁場分離、收集，并用乙醇清洗，將殘留的乙醇在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全后可再次用于酶的固定化。
[0029]載體及固定化酶的保存方法：
[0030]空載體貯存在在4°C，含30~40%(v/v)的乙醇溶液中；使用前用pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗3~5次，每次利用外磁場分離收集，最后以pH=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩沖液置換原來的保存液。
[0031]與載體相連的固定化酶貯存在4°C，含0.05%~O. l%(w/v)NaN3、pH=7. 2~7· 4磷酸鹽緩沖液中；使用ρΗ=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩沖液清洗3~5次，每次利用外磁場分離收集，最后以ρΗ=7. 2~7. 4的磷酸鹽緩沖液置換原來的保存液。[0032]本發(fā)明由于采取了以上技術(shù)方案，使制備的固定化酶載體具有以下顯著的優(yōu)點：
[0033]步驟（a)所述述技術(shù)合成的Fe3O4納米顆粒核心為載體提供了磁性，為后續(xù)的分離、純化、收集提供了極大的便利。
[0034]步驟（b)所述技術(shù)合成的TiO2外殼為載體提供了高生物相容性以及可再生性。
[0035]步驟（C)所述技術(shù)合成的銳鈦礦型TiO2多孔外殼結(jié)構(gòu)為載體提供了更大的比表面積，從而可有效提聞載體荷載酶的能力。
[0036]步驟（d)所述技術(shù)可實現(xiàn)酶與載體的共價鏈接，從而獲得穩(wěn)定的固定化酶；提高了載體對酶的荷載能力；也是實現(xiàn)載體再生的前提。
[0037]步驟（g)所述技術(shù)可實現(xiàn)載體的再生利用。
【專利附圖】

【附圖說明】[0038]圖I :實施例I制備的磁性Fe3O4納米粒子的透射電鏡圖。如圖所示，所制備的Fe3O4為球形，納米粒子平均直徑大約200nm。
[0039]圖2 :實施例I制備的磁性Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物的透射電鏡圖。如圖所示，球狀Fe3O4納米粒子被多孔狀的外殼包圍，外殼與磁性核之間連接緊密而且連續(xù)。
[0040]圖3 :實施例5制備的磁性Fe3O4納米粒子的透射電鏡圖。如圖所示，所制備的Fe3O4為球形，納米粒子平均直徑大約170nm。
[0041]圖4 :實施例5制備的磁性Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物的透射電鏡圖。如圖所示，球狀Fe3O4納米粒子被多孔狀的外殼包圍，外殼與磁性核之間連接緊密而且連續(xù)。
[0042]圖：5 :實施例I制備的磁性Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物的拉曼光譜。如圖所示，在633nm激發(fā)線下，銳鈦礦型TiO2的三個特征振動模式清晰可見，表明多孔外殼是銳鈦礦型的Ti02。
[0043]圖6 :實施例I制備的磁性Fe3O4OTiO2固定化辣根過氧化物酶的拉曼光譜。如圖所示，在413nm激發(fā)線下，出現(xiàn)了辣根過氧化物酶的特征拉曼譜線，證明該酶已經(jīng)成功負載到Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物上。
【具體實施方式】
[0044]實施例I :一種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0045](a)制備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0046]Fe3O4磁性納米顆粒通過以下溶劑熱方法合成。在機械攪拌下將3. 24gFeCl3 ·6Η20、
10.44g乙酸鈉、溶解在120mL乙二醇溶液中；將得到的黃色溶液轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，在200°C反應(yīng)12h ;利用外磁場分離收集黑色的磁性顆粒；分離產(chǎn)物用無水乙醇清洗4次后再分離收集，并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0047](b)制備核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2NPs)：
[0048]將200mg步驟（a)制備的Fe3O4NPs加入到含180mL乙醇、40mL乙晴和ImL NH3 ·Η20的混合溶液中；通過超聲處理將Fe3O4NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL鈦酸四丁酯并機械攪拌2h ;用外磁場分離收集出磁性的合成產(chǎn)物Fe3O4OTiO2NPs膠體納米粒子；Fe304@TiO2NPs用無水乙醇清洗4次后再分離收集并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0049](c)制備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物：[0050]銳鈦礦型TiO2外殼是通過一種水熱方法合成。將200mg步驟（b )制備獲得的Fe3O4OTiO2NPs納米復(fù)合物通過超聲的方法分散在含67%(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2mLNH3 · H2O ;將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，在160°C反應(yīng)24h ?’然后將得到的棕色反應(yīng)產(chǎn)物(銳鈦礦型Fe3O4OTiO2)用外磁場收集；銳鈦礦型Fe3O4OTiO2用無水乙醇清洗4次后再分離收集，并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0051]Cd)制備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：
[0052]將步驟（C)制備的IOOmg銳鈦礦型Fe3O4OTiO2復(fù)合物用超聲的方法分散在200mL、1% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（APTMS)水溶液中，并機械攪拌2h ;利用外磁場分離收集APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物；將APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物分散在lmL、2. 5%(v/v)戊二醛的水溶液中，并在室溫孵育Ih后獲得乙醛化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體。
[0053](e)載體對辣根過氧化物酶的荷載：
[0054]將80mg乙醒化的Fe3O4OTiO2固定化酶載體與5mL、2mg/mL辣根過氧化物酶(EC1. 11. I. 7，Sigma)溶液充分混勻，室溫孵育4h ;每隔30min用紫外分光光度法測定不同時間點溶液的辣根過氧化物酶濃度，根據(jù)加入固定化酶載體后溶液酶蛋白濃度隨時間的變化曲線，計算載體對酶的最大荷載量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)室溫孵育I. 5h，載體對酶的荷載量達到最大值，裝載量為21±5mg/g，保留了 93±6%游離酶的活性。
[0055](f)載體的再生方法：
[0056]荷載辣根過氧 化物酶的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物在紫外燈下照射4h ;然后利用外磁場分離、收集，并用乙醇清洗，將殘留的乙醇在60°C下?lián)]發(fā)完全；隨后的拉曼光譜和酶活力檢測顯示紫外線照射處理能有效的去除載體表面的辣根過氧化物酶；將紫外線處理后的載體再次進行步驟（d)和步驟（e)，載體對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變；對載體連續(xù)進行了 10次的再生處理，載體對對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變。
[0057](g)載體和固定化酶的保存：
[0058]將空載體在30%的乙醇溶液中，4°C條件下貯存12個月后載體對酶的荷載量沒有顯著改變，保留了 99%以上的荷載效率；將固定化酶在含0.05%(w/v)NaN3的磷酸鹽緩沖液(pH=7. 4)中，4°C條件下貯存6個月，固定化酶的活性沒有顯著改變，保留了 96%以上的酶活力。
[0059]實施例2 : —種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0060]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將制備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例2是將按實施例I步驟（a)~（d)制備的載體與漆酶相連來檢測載體對漆酶（EC1. 10. 3. 2，F(xiàn)luka)的荷載量和對酶活力的影響。結(jié)果顯示Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物載體對漆酶的裝載量為98±9mg/g,保留了 96 ±4%游離酶的活性。
[0061]實施例3 :—種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0062]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將制備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例3是將按實施例I步驟（a)~（d)制備的載體與乙醇脫氫酶（EC1. I. I. 1，Sigma)相連來檢測載體對乙醇脫氫酶的荷載量和對酶活力的影響。結(jié)果顯示Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物載體對乙醇脫氫酶的裝載量為105±6mg/g，保留了 93 ±5%游離酶的活性。
[0063]實施例4 :一種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0064]如同實例I的各步驟操作，不同的是實施例I的步驟（e)是將制備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對辣根過氧化物酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例4是將按實施例I步驟（a)~（d)制備的載體與β -葡萄糖苷酶（EC3. 2. I. 21，Sigma)相連來檢測載體對β_葡萄糖苷酶的荷載量和對酶活力的影響。結(jié)果顯示Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物載體對葡萄糖苷酶的裝載量為125±10mg/g，保留了 92±7%游離酶的活性。
[0065]實施例5 :—種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0066](a)制備 Fe3O4 磁性納米顆粒（Fe3O4NPs):
[0067]Fe3O4磁性納米顆粒通過水熱方法合成。向O. 15mol/L Fe (NO3) 3 ·9Η20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調(diào)至8. 0，加熱至70°C，經(jīng)過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，經(jīng)洗滌后采用機械攪拌的方法重新充分分散于水溶液中，再用NaOH溶液將pH值調(diào)至11.0，然后將以上溶液轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，在200°C反應(yīng)6h;將反應(yīng)完成后的溶液轉(zhuǎn)移到玻璃容器中，利用外磁場收集黑色的磁性顆粒；分離產(chǎn)物用無水乙醇清洗5次后再分離收集，并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0068](b)制備核殼結(jié)構(gòu)Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子（Fe3O4OTiO2)：
[0069]將200mg步驟（a)制備的Fe3O4NPs加入到含180mT,乙醇、40mL乙晴和ImL NH3 ·3Η20的混合溶液中；通過超聲處理將Fe3O4NPs在上述溶液中充分分散；加入2mL鈦酸四丁酯并機械攪拌2h ;用外磁場分離出磁性的合成產(chǎn)物Fe3O4OTiO2膠體納米粒子；Fe304@Ti02NPS用無水乙醇清洗5次后再分離收集，并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0070](c)制備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物：
[0071]銳鈦礦型TiO2外殼是通過一種水熱方法合成。將200mg步驟（b)制備獲得的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物通過超聲的方法分散在含60%(v/v)乙醇的水溶液中，然后加入2mLNH3 · H2O ;將上述懸浮液轉(zhuǎn)移到有聚四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼反應(yīng)釜中，在160°C反應(yīng)24h ?’然后棕色的反應(yīng)產(chǎn)物(銳鈦礦型Fe3O4OTiO2)用外磁場收集；銳鈦礦型Fe3O4OTiO2用無水乙醇清洗5次后再分離收集，并放置在60°C條件下?lián)]發(fā)完全以備用。
[0072](d)制備Fe3O4OTiO2固定化酶載體：：
[0073]將步驟（C)制備的IOOmg銳鈦礦型Fe3O4OTiO2復(fù)合物用超聲的方法分散在200mL、l%(w/w) 3-氨基丙基-三甲氧基硅烷（APTMS)水溶液中，并機械攪拌2h ;利用外磁場分離、收集APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物；將APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物分散在lmL、2. 5% (v/v)戊二醛的水溶液中，并在室溫孵育Ih后獲得乙醛化的固定化酶載體。
[0074](e)載體對辣根過氧化物酶的荷載：
[0075]將70mg乙醛化Fe3O4OTiO2固定化酶載體與5mL的2mg/mL辣根過氧化物酶(EC1. 11. I. 7，Sigma)溶液充分混勻，室溫孵育4h ;每隔30min用紫外分光光度法測定不同時間點溶液的辣根過氧化物酶濃度，根據(jù)加入固定化酶載體后溶液酶蛋白濃度隨時間的變化曲線，計算載體對酶的最大荷載量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)室溫孵育I. 5h，載體對酶的荷載量達到最大值，裝載量為22±4mg/g，保留了 94±5%游離酶的活性。
[0076](f)載體的再生方法：[0077]荷載辣根過氧化物酶的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物在紫外燈下照射5h ;然后利用外磁場分離、收集，并用乙醇清洗，將殘留的乙醇在室溫下?lián)]發(fā)完全；隨后的拉曼光譜和酶活力檢測顯示紫外線照射處理能有效的去除載體表面的辣根過氧化物酶；將紫外線處理后的載體再次進行步驟（d)和步驟（e)，載體對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變；對載體連續(xù)進行了 10次的再生處理，載體對對酶的荷載量和酶的活力沒有顯著改變。
[0078](g)載體和固定化酶的保存：
[0079]將空載體在30% (v/v)的乙醇溶液中，4°C條件下貯存10個月后載體對酶的荷載量沒有顯著改變，保留了 97%以上的荷載效率；將固定化酶在含O. l%(w/v)NaN3的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4)中，4°C條件下貯存6個月，固定化酶的活性沒有顯著改變，保留了 96%以上的酶活力。
[0080]實施例6 : —種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0081]如同實例5的各步驟操作，不同的是實施例5的步驟（e)是將制備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例6是將按實施例I步驟（a)~（d)制備的載體與漆酶（EC1. 10. 3. 2，F(xiàn)luka)相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響。結(jié)果顯示Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物載體對漆酶的裝載量為87±6mg/g,保留了95 ±7%游離酶的活性。
[0082]實施例7 : —種可再生磁性固定化酶載體的制備方法，
[0083]如同實例5的各步驟操作，不同的是實施例5的步驟（e)是將制備的載體與辣根過氧化物酶相連來檢測載體對 酶的荷載量和對酶活力的影響，而實施例7是將按實施例I步驟（a)~（d)制備的載體與β -葡萄糖苷酶（EC3. 2. I. 21，Sigma)相連來檢測載體對酶的荷載量和對酶活力的影響。結(jié)果顯示Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物載體對β-葡萄糖苷酶的裝載量為141±9mg/g，保留了 90 ±5%游離酶的活性。
【權(quán)利要求】
1.一種可再生的磁性固定化酶載體的制備方法，其步驟如下： (a)制備Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs； (b)制備核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子Fe3O4OTiO2NPs： 將步驟（a)制備的100~200mg Fe3O4NPs分散于200~300mL的乙醇、乙晴和NH3 ·Η20的混合溶液中，乙醇、乙晴和NH3 · H2O的體積比160~200:40:1，再加入2~3mL鈦酸四丁酯并攪拌I~2h ;然后用外磁場分離收集得到磁性的Fe3O4OTiO2膠體納米粒子，將膠體納米粒子用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而得到核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4OTiO2磁性膠體納米粒子Fe3O4OTiO2NPs ； (c)制備銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物： 將步驟（b)制得的IOOmg Fe3O4OTiO2NPs分散于100~200mL、60~70%(v/v)乙醇的水溶液中，加入2~3mL的NH3 · H2O,然后將得到的懸浮液在160~180°C條件下水熱反應(yīng)18~24h，棕色的反應(yīng)產(chǎn)物用外磁場分離收集后用無水乙醇清洗3~5次，再用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而制備得到銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物； (d)制備Fe3O4OTiO2固定化酶載體： 將步驟（c)制備的銳鈦礦型Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物分散于I~2% (w/w)的3-氨基丙基-三甲氧基硅烷APTMS水溶液中，并攪拌2~5h ;利用外磁場分離收集得到APTMS-功能化的Fe3O4OTiO2納米復(fù)合物，然后將其再分散于含2~3% (v/v)戊二醛的水溶液中，經(jīng)室溫孵育I~3h后獲得Fe3O4OTiO2可再生磁性固定化酶載體。
2.如權(quán)利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的制備方法，其特征在于：Fe3O4磁性納米顆粒通過溶劑熱方法合成，是將FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20和乙酸鈉按摩爾比1:9~1:11混合后分散于乙二醇中，F(xiàn)eCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20在乙二醇溶液中的濃度范圍為O. I~O. 15mol/L ;然后將得到的黃色溶液在200~220°C條件下反應(yīng)8~12h，再將得到的溶液轉(zhuǎn)移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗3~5次，再利用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs15
3.如權(quán)利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的制備方法，其特征在于=Fe3O4磁性納米顆粒通過水熱方法合成，是向O. I~O. 2mol/L的FeCl3 · 6H20或Fe (NO3) 3 · 9H20的水溶液緩慢加入NaOH溶液，將溶液的pH值調(diào)至7. O~8. 0，加熱至60~.80°C，過濾分離得到Fe (OH) 3凝膠，凝膠經(jīng)洗滌后重新分散于水中，再用NaOH溶液將pH值調(diào)至10.0~11. 0，然后將得到的溶液在200~220°C條件下水熱反應(yīng)6~8h ;再將得到的溶液轉(zhuǎn)移到玻璃容器中，用外磁場分離收集得到黑色磁性顆粒；將磁性顆粒用無水乙醇清洗.3~5次，再利用外磁場分離收集并放置在20~60°C條件下?lián)]發(fā)完全，從而得到Fe3O4磁性納米顆粒Fe3O4NPs15
4.如權(quán)利要求2或3所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的制備方法，其特征在于：分散的方法為磁力攪拌、超聲波方法或機械攪拌分散。
5.如權(quán)利要求1所述的一種可再生的磁性固定化酶載體的制備方法，其特征在于：分散的方法為機械攪拌或超聲波方法。
6.一種可再生的磁性固定化酶載體，其特征在于：由權(quán)利要求1、2、3或5所述的方法制備得到。
7. —種可再生的磁性固定化酶載體，其特征在于：由權(quán)利要求4所述的方法制備得到。
【文檔編號】C12N11/14GK103525805SQ201310544114
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月5日
【發(fā)明者】蔡林君, 陳雷, 趙冰 申請人:吉林大學(xué)