一種新型重組蛋白及其制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種能用于預防和治療1型糖尿病的新型重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6×(IA2-P2)。通過基因操作，將1型糖尿病特異的一段抗原表位IA2-P2串聯(lián)6段，在C端加His標簽，再在N端加源于破傷風毒素的T輔助表位肽段以及源于膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白的B細胞表位肽段并融合到門冬酰胺酶的C端，形成一種新的重組蛋白和相應編碼基因。該基因在大腸桿菌中高效表達，生成的重組蛋白能分泌到周質(zhì)中并大部分保持有門冬酰胺酶活性，并能通過鎳柱層析分離法快速制備。重組蛋白將6個抗原表位IA2-P2肽呈現(xiàn)到門冬酰胺酶表面，增強了抗原表位IA2-P2的免疫原性，動物實驗結果顯示：新型重組蛋白具有顯著的降低STZ誘導的1型糖尿病雄性C57BL／6J小鼠空腹血糖的活性，具有防治1型糖尿病的作用。
【專利說明】一種新型重組蛋白及其制備和應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及DNA重組技術、蛋白分離純化技術及醫(yī)學相關領域。更具體地，本發(fā)明涉及重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的構建、表達及分離純化。在醫(yī)學領域中，本發(fā)明是一種重組蛋白，能用于預防和治療I型糖尿病。
【背景技術】
[0002]糖尿病(Diabetes mellitus，DM)是以胰島素相對或絕對不足為特征的代謝性疾病，胰島素相對或絕對不足引發(fā)高血糖，進而導致三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，最終影響患者正常生理功能并且引起并發(fā)癥。全球糖尿病患者與日俱增，預計2030年將達到4.39億。糖尿病帶來的危害，幾乎都來自它的并發(fā)癥。例如動脈粥樣硬化、糖尿病腎病、高血壓、糖尿病眼病、糖尿病足等己成為導致糖尿病致死、致殘的主要原因。
[0003]胰島素絕對缺乏為I型糖尿病，胰島素相對缺乏為2型糖尿病。I型糖尿病又名胰島素依賴型糖尿病(Typeldiabetes mellitus,T1DM)是由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的一種代謝異常綜合征。由于機體自身反應性免疫應答攻擊胰島β細胞，使其遭破壞、功能缺失，從而導致胰島素絕對缺乏所引起的糖尿病。由于β細胞具有產(chǎn)生胰島素和調(diào)節(jié)血糖的功能，β細胞群的毀壞最終導致了血糖的失調(diào)和高糖血癥的發(fā)生。TlDM是由T細胞介導的器官特異性自身免疫性疾病，自身免疫性疾病(autoimmune disease)是因機體免疫系統(tǒng)對自身成分發(fā)生免疫應答而導致的疾病狀態(tài)。通過一定的免疫途徑來誘導機體對致自身免疫性疾病自身抗原的耐受能有效預防自身免疫性疾病的發(fā)生。
[0004]P277肽是HSP60的437~460位的一段特異性多肽，共24個氨基酸，也是能與效應T細胞反應的抗原決定簇，是在TlDM中發(fā)揮作用的特異片段。DiaPep277目前以進入III期臨床研究。已有實驗研究發(fā)現(xiàn)按照國外DiaPep277相同的皮下給藥方式，用P277肽進行給藥，能引起血管內(nèi)皮細胞損傷，并誘發(fā)肌體產(chǎn)生抗體從而誘發(fā)嚴重的動脈粥樣硬化；并將P277分成Pl肽段(437~450)和P2肽段(448~460)兩部分，發(fā)現(xiàn)Pl多肽具有一定的促動脈粥樣硬化作用，而P2多肽卻沒有。經(jīng)過改構，選用胰島細胞特異抗原-胰島素相關蛋白(IA2)近膜區(qū)JM2的兩個線形B表位:IA2的626~630位(626FEYQD630)和IA2的621 ~628 位(621Hgdttfey628)，即用 621Hgdttfeyqd630 替換 P277 的 347 ~446 位肽段，合成多肽IA2-P2。實驗證明IA2-P2能有效的降低NOD小鼠糖尿病的發(fā)病率，增加小鼠的存活率。6X (IA2-P2)融合表達在HSP65后面的融合蛋白能對NOD小鼠產(chǎn)生治療糖尿病的療效，相對于單串的IA2-P2，六串可以起到加強免疫的效果。
[0005]門冬酰胺酶的抗癌作用早在1953年就被科學家發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過比較自然界中不同微生物產(chǎn)生的門冬酰胺酶之后，人們發(fā)現(xiàn)，由大腸桿菌(Escherichia coli)和菊歐文氏菌(Erwinia chrysanthemi)產(chǎn)生的酶具有最好的抗癌能力，除此之外，大腸桿菌產(chǎn)生的酶不僅效果好而且還容易做到大量生產(chǎn)，所以成為了目前門冬酰胺酶的主要來源。大腸桿菌內(nèi)有兩種L-門冬酰胺酶，一種是位于細胞質(zhì)中的低親和性L-門冬酰胺酶I (AnsA)，另一種是具有高親和性的分泌表達的L-門冬酰胺酶II (AnsB) ,Michael等通過寡聚核苷酸引物從大腸桿菌野生菌株中克隆得到AnsB。AnsB單體沒有催化天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨的活性，當單體聚合成四聚體、八聚體或者十二聚體形式時，才具有酶活性。
[0006]門冬酰胺酶作為有效表位載體有許多優(yōu)點:(I)門冬酰胺酶活力測定的靈敏度高，如果呈現(xiàn)構象化表位的酶依然具有活力，這相當于構象化多肽己被酶標記，并且不影響多肽與抗體的結合活性。(2)門冬酰胺酶由四個相同亞基構成，因此一個酶分子上呈現(xiàn)有四個環(huán)狀多肽，能方便地設計“夾心法”等酶聯(lián)免疫測定方法。(3)在門冬酰胺酶PAGE電泳時還發(fā)現(xiàn)該酶有形成多聚分子的傾向，能形成二聚體、三聚體和四聚體蛋白，這種顆?；瘍A向有利于增強免疫原性。該酶在臨床應用中已經(jīng)顯示有很強的免疫原性，能用于發(fā)展疫苗。
(4)門冬酰胺酶是血中半衰期較長的藥物。若肌肉注射也能緩慢吸收。有足夠時間供抗原充分發(fā)揮免疫刺激作用。(5)門冬酰胺酶也有一個二硫鍵，能分泌到細胞周質(zhì)腔(periplasm)折疊，在周質(zhì)腔氧化環(huán)境中二硫鍵容易自發(fā)形成。(6)將抗原多肽通過T細胞表位肽段與門冬酰胺酶C端融合，在細菌中高效表達并分泌到細胞周質(zhì)腔中，這種基因工程菌在周質(zhì)腔中含大量表面呈現(xiàn)有抗原多肽的重組門冬酰胺酶，能夠直接用于發(fā)展活菌苗或滅活菌苗。
(7)門冬酰胺酶己經(jīng)在臨床上用于治療白血病和淋巴瘤，其安全性已經(jīng)得到驗證，用該酶作為呈現(xiàn)載體，開發(fā)用于人體的藥物，將是較為安全的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]發(fā)明目的:
[0008]本發(fā)明的一個目的是提供一種具有降血糖作用的新型重組蛋白。
[0009]本發(fā)明的另一個目的是提供生產(chǎn)該重組蛋白的方法。
[0010]本發(fā)明的再一個目的 是提供該重組蛋白的用途。
[0011]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種具有降血糖作用的新型重組蛋白，它是通過基因操作，將I型糖尿病特異的一段抗原表位IA2-P2串聯(lián)6段，在C端加His標簽，再在N端加源于破傷風毒素的T輔助表位肽段以及源于膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白的B細胞表位肽段并融合到門冬酰胺酶的C端，其形成的融合基因置于pET-28a載體T7啟動子的下游。這個重組的融合表達質(zhì)粒稱pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2) -His。TTP可誘發(fā)機體產(chǎn)生較強的免疫應答；CETPC可誘導機體產(chǎn)生抗CETP抗體。
[0012]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種具有降血糖作用的新型重組蛋白的制備方法。其特征在于，該方法包含步驟:
[0013](a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求4，5所述的質(zhì)粒載體及其工程菌。
[0014](b)從培養(yǎng)物中分離、純化出SEQ NO:1所示氨基酸序列的新型重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)。
[0015]在一優(yōu)選例中，本發(fā)明的方法中，所述的步驟(b)包括:
[0016]通過溶菌、離心、鎳柱親和層析等方法分離出蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)，透析除鹽并凍干。
[0017]在本發(fā)明的第三方面，通過連續(xù)5天低劑量STZ腹腔注射雄性C57BL / 6J小鼠(5周齡)造模，分別于6周齡、9周齡、12周齡用純化的重組蛋白鼻粘膜免疫造模小鼠，每月測定小鼠體內(nèi)血糖水平的變化?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0018]圖1 重組質(zhì)粒 pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2_P2)-His 構建原理示意圖
[0019]圖2AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His 基因測序圖
[0020]圖312 % SDS-PAGE電泳檢測重組菌經(jīng)乳糖誘導表達融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)結果
[0021]圖412 % SDS-PAGE電泳檢測重組菌經(jīng)鎳柱親和層析純化融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)結果
[0022]圖5多次鼻粘膜免疫AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)對I型糖尿病模型小鼠血糖的影響
【具體實施方式】
[0023]以下通過附圖及實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0024]本說明書中所提到的材料中:
[0025](I)宿主菌和質(zhì)粒
[0026]宿主菌Escherichia coli BL21是基因工程常用工程菌種，基因工程研究相關的實驗室一般都有保存。pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6XP277載體為本實驗室構建并保存。含有質(zhì)粒PGH-6X (IA2-P2)-His的Tg I甘油菌由上海希皮吉公司提供。
[0027](2)酶和試劑
[0028]分子克隆工具酶為Fermentas公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒均為上海生工生物工程有限公司；Ni Sepharose?6Fast Flow為GE公司；鏈脲佐菌素(STZ)為Sigma公司；血糖試紙及血糖儀均購自臺灣博士瓏。
[0029](3)培養(yǎng)基
[0030]LB 培養(yǎng)基，配方見參考文獻 Sambrook J, FristshE F, Maniatis T.MolecularCloning ；A Laboratory Manual2nd ed.NY:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。
[0031]本說明書所提及的方法中質(zhì)粒提取、PCR反應、內(nèi)切酶酶切、DNA片段的回收、連接和轉(zhuǎn)化大腸桿菌，這些都是基因工程研究領域的常規(guī)操作方法，具體參見Samtoook J，F(xiàn)ristshE F, Maniatis T.Molecular Cloning ；A Laboratory Manual2nd ed.NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989, pp.16-340。
[0032]實施例1:AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His 基因的克隆
[0033]用上海生工試劑盒，抽提質(zhì)粒pGH_6X (IA2-P2)_His。質(zhì)粒用Hind III和Nhe I酶切，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后用上海生工試劑盒回收目的基因6 X (IA2-P2)。
[0034]載體pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6XP277 同樣經(jīng)過試劑盒抽提、Hind III 和 NheI酶切以及試劑盒回收后，與目的基因6X (IA2-P2)用T4DNA連接酶4°C過夜連接，轉(zhuǎn)化至E.coli BL21感受態(tài)細胞后涂布到含50 μ g / ml卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37°C培養(yǎng)過夜。
[0035]挑取單菌落，過夜培養(yǎng)后試劑盒抽提質(zhì)粒pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)-His，用HindIII和Nhe I酶切，經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳初篩陽性克隆。
[0036]將陽性克隆送至生工生物測序公司進行測序，測序結果經(jīng)軟件比對，驗證了基因克隆的正確性(參見圖2)。[0037]實施例2:AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2_P2)-His基因在大腸桿菌中的表達及培養(yǎng)
[0038]重組表達菌以I %接種量在液體LB培養(yǎng)基中37°C振蕩過夜后，按1%的接種量轉(zhuǎn)接于新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)3h后加入終濃度為5mmol / L乳糖誘導表達，8h后收集菌體，留樣進行SDS-PAGE分析(參見圖3)。融合蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)在誘導后5h達到穩(wěn)定的最大表達量，相對分子質(zhì)量與理論值一致，并在胞內(nèi)主要以可溶形式表達，經(jīng)檢測具有門冬酰胺酶活性。
[0039]實施例3:重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)的分離純化
[0040]挑選高表達量菌株，接種于LB培養(yǎng)中，37°C過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入新鮮的液體LB培養(yǎng)基中，37°C擴大培養(yǎng)，選取最優(yōu)發(fā)酵條件獲得發(fā)酵菌體。8000r / min離心15min,用30ml Binding buffer重懸菌體。用超聲破碎法裂解細胞，時間15min。12000r /min離心15min,收集上清。
[0041]菌體裂解液的上清液用0.45 μ m濾膜過濾確保澄清，用鎳親和層析柱純化，同時樣品及Binding buffer中加適量NaCl。相關操作過程參照GE公司提供的操作指南進行。具體過程如下:轉(zhuǎn)移樹脂到柱子，待完全沉淀后，用雙蒸水洗滌鎳親和層析柱，并防止下一步Ni2+沉淀；用dd H20洗漆，除盡基質(zhì)中的空氣；10X柱體積的Binding buffer平衡一上樣一IOX柱體積的Binding buffer洗漆，收集流出液一Elution buffer洗脫一得到重組蛋白 AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)(參見圖 4)。
[0042]實施例4 =STZ誘導I型糖尿病TlDM模型
[0043]選用5周齡雄性C57BL / 6J小鼠，隨機分組，用0.1M pH4.4檸檬酸鹽緩沖液配置STZ (濃度為4mg / ml)，按40mg / kg劑量腹腔注射，每日I次，連續(xù)注射5次。第一次造模前禁食12h，之后造模前禁食4h。
[0044]實施例5:AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)重組蛋白的降血糖作用
[0045]將實施例4得到的造模成功的TlDM模型小鼠隨機分為3組，分別為PBS鼻粘膜免疫對照組、AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)鼻粘膜免疫實驗組和HSP65-6 X (IA2-P2)鼻粘膜免疫實驗組，每組各 10 只。AnsB-TTP-CETPC-6 X (IA2-P2)和 HSP65-6X (IA2-P2)都用 PBS溶解并配置成濃度為5 μ g/μ I的蛋白溶液。分別鼻粘膜免疫對應的蛋白20μ I /只(PBS對照組20 μl PBS /只)。以后每隔3周加強免疫一次，共進行2次加強免疫。造模前和造模后各測一次血糖、體重，此后一個月檢測一次血糖、體重。測定血糖前禁食8h，斷尾采血。
[0046]結果顯示，與PBS鼻粘膜免疫對照組相比，AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)鼻粘膜免疫實驗組能顯著降低STZ誘導的TlDM模型鼠的血糖濃度(P〈0.05)，也優(yōu)于以HSP65呈遞的HSP65-6X (IA2-P2)鼻粘膜免疫實驗組(參見圖5)。
[0047]除上述事實外，本發(fā)明還可以有其他實施方式，凡采用等同替換或等效變換性的技術方案，均落于本發(fā)明要求的保護范圍。
【權利要求】
1.一種新型重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)，其特征在于它包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的新型重組蛋白，其特征在于它包含SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
3.一種載體，其特征在于:它含權利要求2所述的核苷酸序列及權利要求1所述的重組方法:通過基因操作，將I型糖尿病特異的一段抗原表位IA2-P2串聯(lián)6段，在C端加His標簽，再在N端加源于破傷風毒素的T輔助表位肽段以及源于膽固醇脂轉(zhuǎn)移蛋白的B細胞表位肽段并融合到門冬酰胺酶的C端，其形成的融合基因置于pET-28a載體T7啟動子的下游。這個重組的融合表達質(zhì)粒稱pET-28a-AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2) -His，表達產(chǎn)物具有門冬酰胺酶活性。
4.一種基因工程菌，其特征在于含有權利要求3所述的載體。
5.一種新型重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的制備方法，其特征在于該方法包含步驟: (I)在適合的表達條件下，培養(yǎng)權利要求4所述的宿主菌。 (II)通過溶菌、鎳柱親和層析方法，分離出AnsB-TTP-CETPC-6X(IA2-P2)重組蛋白，形成權利要求1所示的AnsB-TTP-CETPC-6X (IA2-P2)的氨基酸序列。
6.根據(jù)權利要求1所述的新型重組蛋白AnsB-TTP-CETPC-6X(IA2-P2)的門冬酰胺酶活性，且具有顯著的降低STZ誘導的I型糖尿病模型雄性C57BL / 6J小鼠空腹血糖的活性，有望用于治療I型糖尿病。
7.根據(jù)權利要求1所述得到的新型重組蛋白，其特征在于可與藥物活性成分組合制成藥物組合物。
8.根據(jù)權利要求7所述所述的藥物活性成分物質(zhì)為胰島素、雙胍類、磺脲類；其中雙胍類包括苯乙雙胍、丁二胍、二甲雙胍；磺脲類藥物包括列苯脲、米克胰、格列齊特、克糖利、格列波脲、格列喹酮、糖適平、美吡達、糖腎平。
【文檔編號】C12R1/19GK103554270SQ201310545262
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權日:2013年11月7日
【發(fā)明者】李泰明, 張若洋, 韓萌萌, 李蘋蘋, 王岐信, 焦琳方, 王全逸, 劉俊, 伍欣曄 申請人:中國藥科大學