一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量pcr試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括：（1）陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品；（2）陰性對(duì)照；（3）PCR反應(yīng)液；（4）ExTaq酶液；（5）探針溶液；（6）無(wú)菌水。本試劑盒對(duì)甘蔗赤條病菌的檢測(cè)有高度的特異性，與其他植物病菌無(wú)交叉反應(yīng)；檢測(cè)的靈敏度達(dá)100拷貝，可直接用于甘蔗植株、脫毒種苗等樣本的定量檢測(cè)甘蔗赤條病菌；利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)快速簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果可靠穩(wěn)定。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)植物病菌的PCR試劑盒，具體涉及一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，屬微生物檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]甘鹿赤條病(Sugarcane red stripe disease)是一種普遍發(fā)生的細(xì)菌性病害，幾乎在主要甘蔗種植國(guó)家均有發(fā)生，我國(guó)甘蔗赤條病在幾個(gè)種植甘蔗的省(區(qū))都有零星發(fā)生。甘鹿赤條病菌被認(rèn)為是紅條紋假單胞菌rubrilineans (Lee et al.)Stapp引起，其形態(tài)特征為無(wú)芽孢，呈桿狀，大小為0.7 X 1.6 μ m，有單根極生鞭毛，有薄莢膜，革蘭氏染色反應(yīng)為陰性。1992年Willems等將紅條紋假單胞菌重新命名為燕麥?zhǔn)伤峋帑渷喎N dii/orarazsubsp.A venae) 0 Zia-ul-Hussnain 等(2011)從巴基斯坦甘蔗赤條病株上分離得到了燕麥?zhǔn)伤峋帑渷喎N病菌，并對(duì)該病菌的菌體形態(tài)、培養(yǎng)性狀、生理生化反應(yīng)作了研究。燕麥?zhǔn)伤峋帑渷喎N病菌其寄主范圍除甘蔗外，還有水稻、玉米、鋪地黍等禾本科的一些植物。病害有葉條斑和頂腐兩種類(lèi)型。兩者可以單獨(dú)發(fā)生，亦可并發(fā)。在潮濕溫暖的條件下容易發(fā)病，而且病葉的傷痕表面常有細(xì)菌溢泌物，借助雨水和氣流傳播。患病的枯老蔗葉、病莖中的病原菌經(jīng)4個(gè)月后仍然有致病力。因此建立甘蔗赤條病菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)該病的防治起到十分關(guān)鍵的作用。
[0003]常用的檢測(cè)病菌的方法有生物學(xué)鑒定法、電鏡技術(shù)、酶聯(lián)免疫技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)等。生物學(xué)鑒定法耗時(shí)、且步驟繁瑣；電鏡技術(shù)需要植物組織切片，步驟繁瑣，且只能通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察判斷；酶聯(lián)免疫技術(shù)需要特異性的抗血清，且靈敏度不及分子檢測(cè)技術(shù)；基于PCR原理的分子生物學(xué)技術(shù)是一種靈敏度高、特異性強(qiáng)的快速檢測(cè)技術(shù)，在其它甘蔗病原物的檢測(cè)已得到廣泛應(yīng)用。目前，檢測(cè)甘蔗赤條病菌燕麥?zhǔn)伤峋帑渷喎N的熒光定量PCR試劑盒及其方法未見(jiàn)報(bào)道。
[0004]本發(fā)明在分離獲得甘蔗赤條病菌，克隆測(cè)序病菌基因組核糖體rDNA序列基礎(chǔ)上，選擇甘蔗赤條病菌16S-23S rDNA間隔區(qū)序列(ITS)，設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR檢測(cè)的引物及探針，通過(guò)對(duì)反應(yīng)體系的優(yōu)化，研制用于檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒及方法，為我國(guó)甘蔗科研、檢疫、質(zhì)檢等部門(mén)提供快速、靈敏、準(zhǔn)確的病害檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品和技術(shù)服務(wù)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明目的是提供一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒能快速準(zhǔn)確的對(duì)待測(cè)樣品的甘蔗赤條病菌進(jìn)行定量檢測(cè)。該試劑盒不僅可使用于目前市場(chǎng)上的所有類(lèi)型熒光定量PCR儀，而且能夠靈敏、特異的對(duì)甘蔗赤條病菌進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明采用Taqman探針建立熒光定量PCR檢測(cè)甘蔗赤條病菌試劑盒，通過(guò)制備病菌DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品同時(shí)檢測(cè)，得到待測(cè)樣品的初始病菌拷貝數(shù)，對(duì)病菌進(jìn)行定量檢測(cè)。
[0008]本發(fā)明提供了一種利用熒光定量PCR方法檢測(cè)甘蔗赤條病菌的引物對(duì)QPCR-F5、QPCR-R5和Taqman探針QPCR-P5，所述的引物對(duì)序列如下:
QPCR-F5:5’ -TCATCCTCCACCAACCAATA-3’，
QPCR-R5:5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA-3’ ；
Taqman探針QPCR-P5的序列如下:
5，-FAM-CACCAAAGCGGCTTCGCAAG-TAMRA-3，。
[0009]本發(fā)明還提供一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成:
Cl)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品:采用常規(guī)PCR擴(kuò)增含有16S-23S rDNA間隔區(qū)的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，I X 101° 拷貝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷凍保存；
(2)陰性對(duì)照:采用無(wú)甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對(duì)照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫?br> (3)PCR反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括5XPCR緩沖液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對(duì) QPCR-F5 和 QPCR-R5 各 2.0 μ L，共
11.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫?br> (4)Ex Taq酶:每個(gè)反應(yīng)體系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫?br> (5)探針溶液:Taqman探針QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無(wú)菌水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個(gè)反應(yīng)體系0.4 μ L, 50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)20 yL,_20°C保存?zhèn)溆?
(6)無(wú)菌水:2X10 mL/瓶。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果主要體現(xiàn)在:本試劑盒對(duì)甘蔗赤條病菌的檢測(cè)有高度的特異性，與其他甘蔗病菌無(wú)交叉反應(yīng)；檢測(cè)的靈敏度達(dá)100拷貝，可以在甘蔗田間樣品和脫毒種苗等樣本中檢測(cè)甘蔗赤條病菌；利用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)操作簡(jiǎn)單快速，從樣品病菌核酸提取至完成檢測(cè)，耗時(shí)2~3小時(shí)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1是甘蔗赤條病菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。圖中橫坐標(biāo)代表熒光定量PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，縱坐標(biāo)代表熒光信號(hào)強(qiáng)度，擴(kuò)增曲線(xiàn)分別是DNA標(biāo)準(zhǔn)品IX IO8拷貝/μ L、1 X IO7 拷貝 / μ L、1 X IO6 拷貝 / μ L、1 X IO5 拷貝 / μ L、1 X IO4 拷貝 / μ L、1 X IO3 拷貝/ μ L、I X IO2 和 I X IO1 拷貝 / μ Lo
[0012]圖2是甘蔗赤條病菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。橫坐標(biāo)χ代表標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)y代表PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)；y= -3.2167x+39.785 ;R代表相關(guān)系數(shù)，決定系數(shù) R2=0.9998。
【具體實(shí)施方式】
[0013]為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例加以說(shuō)明。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料如無(wú)特殊說(shuō)明均可從商業(yè)途徑獲得。
[0014]實(shí)施例1 一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括Taqman探針 QPCR-P5 和引物對(duì) QPCR-F5、QPCR-R5,其中 Taqman 探針 QPCR-P5 序列為 5’ -CACCAAAGCGGCTTCGCAAG _3 ’，探針的5 ’端和3 ’端分別采用熒光基團(tuán)FAM和TAMRA進(jìn)行修飾；引物對(duì) QPCR-F5 和 QPCR-R5 序列為 5’ - TCATCCTCCACCAACCAATA -3，和 5’ -TACCGGACCAACAACAAAGA -3’ ；該試劑盒包括下列試劑:
(I)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品:以 16S-F3 (5，-ACTGCGTGAAGTCGGAATC-3’)和 23S-R1(5’ -TCGGAATCTCGGTTGATG-3’)為引物，利用常規(guī)PCR方法擴(kuò)增獲得甘蔗赤條病菌16S-23SrDNA間隔區(qū)序列(ITS)片段，PCR產(chǎn)物純化后作為甘蔗赤條病菌DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品。用核酸蛋白分析儀測(cè)定PCR產(chǎn)物DNA濃度后，稀釋為100 ng/yL, PCR產(chǎn)物片段大小為1070 bp，根據(jù)公式計(jì)算DNA標(biāo)準(zhǔn)樣品的拷貝數(shù)為8.52X IO10拷貝/ μ L，并稀釋成標(biāo)準(zhǔn)樣品I X 101°拷貝/yL，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存。
[0015](2)陰性對(duì)照:采用無(wú)甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對(duì)照，用核酸蛋白分析儀測(cè)定提取的總DNA濃度，并稀釋成濃度為100 ng/yL作為陰性樣品，50 μ L/瓶，-20 1:冷凍保存?zhèn)溆谩?br> [0016](3)無(wú)菌水:2X 10 mL/瓶。
[0017](4)PCR 反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括 5XPCR 緩沖液 5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25 mmol MgCl2 2.0 μ L 以及濃度為 10 μ mol/L 的引物對(duì) QPCR-F5 和 QPCR-R5各 2.0 μ L,共11.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫?br> (5)Ex Taq酶:每個(gè)反應(yīng)體系包括5 U/μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫?br> (6)探針溶液:Taqman探針QPCR-P5采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無(wú)菌水稀釋,濃度為10 μ mol/L,每個(gè)反應(yīng)體系0.4 μ L, 50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)20 yL,_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0018]實(shí)施例2甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)應(yīng)用
I)標(biāo)準(zhǔn)品DNA稀釋:將甘蔗赤條病菌DNA標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)菌水按10倍稀釋成I X IO8~I X IO1拷貝/ y L的一系列DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
[0019]2)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程建立
以此稀釋后DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品處理重復(fù)3次。并以無(wú)甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片總DNA為陰性對(duì)照，以無(wú)菌水為空白對(duì)照。按上述試劑盒內(nèi)組分，熒光定量PCR反應(yīng)總體系為25 μ L，包括PCR反應(yīng)液11.5 μ L，反應(yīng)酶混合液0.5 μ L，探針溶液0.4μ L，標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA 1.0 μ L，無(wú)菌水補(bǔ)至25 μ L ;然后放于ABI公司7500定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)?95 V 15 S，60 V I min，40個(gè)循環(huán)，在60 1:進(jìn)行單點(diǎn)熒光檢測(cè)。獲得如圖1所示的擴(kuò)增曲線(xiàn)，然后繪制如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程。本實(shí)施例構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Υ=-3.2167χ+39.785，決定系數(shù)R2為0.9998，擴(kuò)增效率為104.58 %，滿(mǎn)足熒光定量PCR正常的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)要求。檢測(cè)靈敏度可10拷貝/μ L。將熒光定量PCR方法獲得產(chǎn)物用常規(guī)電泳檢測(cè)，只能檢測(cè)到IO4拷貝/ μ L，比常規(guī)的PCR檢測(cè)靈敏度至少高100倍。[0020]3)待測(cè)樣品DNA提取:采用CTAB法提取幾份待測(cè)甘蔗葉片DNA，在核酸蛋白分析儀上測(cè)定DNA的光吸收值，計(jì)算提取的DNA濃度，然后統(tǒng)一稀釋成100 ng/ μ L。
[0021 ] 4)熒光定量PCR擴(kuò)增:以待測(cè)樣品的RNA為模板，熒光定量PCR反應(yīng)總體系和擴(kuò)增程序同上述標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程建立。在ABI公司7500定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得待測(cè)樣品的甘蔗赤條病菌標(biāo)準(zhǔn)品熒光定量PCR的動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)。將待測(cè)樣品的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程轉(zhuǎn)化成初始病菌分子拷貝數(shù)，即一個(gè)分子拷貝數(shù)代表一個(gè)甘蔗赤條病菌，從而定量分析甘蔗樣品中感染甘蔗赤條病菌的數(shù)量，結(jié)果如表1所示。檢測(cè)結(jié)果表明，具有典型甘蔗赤條病癥狀的福農(nóng)38號(hào)、福農(nóng)1110這2個(gè)田間樣品證實(shí)感染了甘蔗赤條病菌，病菌含量達(dá)IO5拷貝/ μ L ;沒(méi)有甘蔗赤條病癥狀的新臺(tái)糖25、德宏06-24這2個(gè)田間樣品沒(méi)有檢測(cè)出甘蔗赤條病菌。為了進(jìn)一步證實(shí)福農(nóng)38號(hào)、福農(nóng)1110感染的病菌是否為甘蔗赤條病菌，我們將熒光定量PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測(cè)序，核苷酸序列提交http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov/比對(duì),結(jié)果證實(shí)是甘鹿赤條病菌,屬于燕麥曬酸菌燕麥亞種avenaesubsp.ΑνθΩ3θ\本發(fā)明建立的檢測(cè)甘鹿赤條病菌突光定量PCR方法具有很好的重復(fù)性，同一樣品的Ct值變異系數(shù)小于I %。
[0022]利用本發(fā)明的Taqman探針熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，可以準(zhǔn)確快速的得到樣品的甘蔗赤條病菌初始拷貝數(shù)，可以應(yīng)用于甘蔗田間樣品檢測(cè)、脫毒種苗質(zhì)量監(jiān)控和甘蔗抗性鑒定。
[0023]表1待測(cè)樣品Ct值及穩(wěn)定性
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，包括Taqman探針QPCR-P5和引物對(duì)QPCR-F5、QPCR-R5，其中 Taqman 探針 QPCR-P5 序列為 5，-CACCATCACGAAATCAATGCAGCA-3，，探針的5’端和3’端分別采用熒光基團(tuán)FAM和TAMRA進(jìn)行修飾；引物對(duì)QPCR-F5和QPCR-R55序列為 5’ -CGGGAAACCCATAATACCAC-3’ 和 5’ -GTCGAITTCTGCTGGTGAGA-3 ’。
2.一種用于甘蔗赤條病菌的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于該試劑盒由下列試劑組成: Cl)陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品:采用常規(guī)PCR擴(kuò)增含有16S-23S rDNA間隔區(qū)的DNA作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，I X 101° 拷貝 / μ L，50 μ L/ 瓶，-20°C冷凍保存； (2)陰性對(duì)照:采用無(wú)甘蔗赤條病菌感染的甘蔗葉片組織，提取葉片總DNA為陰性對(duì)照，100 ng/ μ L，50 μ L/瓶，-20 °C冷凍保存?zhèn)溆茫? (3)PCR反應(yīng)液:每個(gè)反應(yīng)包括5XPCR緩沖液5.0 μ LUO mmol dNTPs 0.5 μ L、25mmol MgCl2 2.0 μ L，以及權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，濃度為10 μ mol/L的QPCR-F5和0卩0?-1?5各2.0 μ L，共11.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)575 μ L, -20 °C保存?zhèn)溆茫? (4)ExTaq酶:每個(gè)反應(yīng)體系包括5 U/ μ L Ex Taq酶0.5 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)25μ L, _20°C保存?zhèn)溆茫? (5)探針溶液:如權(quán)利要求1所述的Taqman探針QPCR-P5，采用5’-FAM和3’ -TAMRA修飾，合成后采用無(wú)菌水稀釋?zhuān)瑵舛葹?0 μ mol/L，每個(gè)反應(yīng)體系0.4 μ L，50個(gè)反應(yīng)體系共計(jì)20 μ L，_20°C保存?zhèn)溆茫? (6)無(wú)菌水:2X10 m L/瓶。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103555844SQ201310548336
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】高三基, 葛丹鳳, 付衛(wèi)林, 吳小斌, 林藝華, 孫生仁, 陳如凱, 傅華英 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)