一種鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光pcr方法及引物組的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種吉富羅非魚魚種性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關(guān)基因AMH，該基因在雌雄魚中表達(dá)量存在顯著的差異。設(shè)計(jì)一對(duì)特異的實(shí)時(shí)熒光PCR引物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達(dá)量進(jìn)行比較來鑒定羅非魚魚種性別。本發(fā)明所建立的方法具有特異性強(qiáng)、可信度高，可應(yīng)用于羅非魚魚種階段的性別鑒定。
【專利說明】—種鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法及引物組
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】[0002]本發(fā)明涉及一種吉富羅非魚魚種性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，還涉及該方法所用的引物組，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0003]【背景技術(shù)】
[0004]吉富羅非魚屬于鱸形目、鱺魚科，羅非魚屬。由于它食性雜，耐低氧，生長(zhǎng)快，抗病力強(qiáng)，現(xiàn)已成為世界性的養(yǎng)殖魚類。在養(yǎng)殖過程中雌雄羅非魚生長(zhǎng)差異明顯，雄魚比雌魚生長(zhǎng)快，常常導(dǎo)致出池規(guī)格相差懸殊，從而降低了商品魚的質(zhì)量，減少了經(jīng)濟(jì)效益。因此開展吉富羅非魚性決定機(jī)制研究，探索吉富羅非魚全雄育種技術(shù)，對(duì)于羅非魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)和社會(huì)效應(yīng)。
[0005]在吉富羅非魚性別決定機(jī)制研究中，常常涉及到性別相關(guān)基因的克隆及其時(shí)空表達(dá)研究。在時(shí)空表達(dá)研究中，魚種階段是個(gè)關(guān)鍵期，這時(shí)性別已經(jīng)分化，但僅憑肉眼觀察很難分辨雌雄魚。通過乳酸醋酸地衣紅壓片法可區(qū)分雌雄魚，但該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的連貫性。因此迫切需要通過一種簡(jiǎn)便的方法來鑒定吉富羅非魚魚種階段的性別。
[0006]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關(guān)基因AMH，該基因在雌雄魚中表達(dá)量存在顯著的差異，設(shè)計(jì)一對(duì)特異的實(shí)時(shí)熒光PCR引物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達(dá)量進(jìn)行比較來鑒定吉富羅非魚魚種性別。
[0008]一種鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，包括如下步驟:
第1步、提取吉富羅非魚的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；
第2步、以吉富羅非魚的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；
第3步、通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法考察吉富羅非魚的AMH基因的相對(duì)表達(dá)量，如果魚種性腺中AMH表達(dá)量比成魚卵巢高10倍以上，魚種則為雄魚，如果小于或等于10倍，魚種則為雌魚；其中，
AMH 基因的正向引物的序列是:5’ -3’ GGAACGGGAACTGATACGAGATG(SEQ ID N0.1)，反向引物的序列是:5’ -3’ AGCAGGGTCTCGCTGGAGGA(SEQ ID N0.2)；
β -actin 基因的正向引物的序列是:5，-3，ATCCGTAAGGACCTGTACGCC(SEQ ID N0.3)，反向引物的序列是:5’ -3’ GTGGGGCAATGATCTTGATCTTC(SEQ ID N0.4)。
[0009]進(jìn)一步地，第2步中實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的程序可以是:94°C 3min,然后40個(gè)循環(huán)94°C 5s，62°C 20s，最后 72°C 3min，4°C保存。[0010]進(jìn)一步地，在第3步中，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行5倍系列稀釋，選取5個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，以Ct值為坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0011]有益效果:本研究通過選擇吉富羅非魚性別相關(guān)基因AMH，該基因在雌雄魚中表達(dá)量存在顯著的差異。設(shè)計(jì)一對(duì)特異的實(shí)時(shí)熒光PCR弓|物，通過和成魚卵巢AMH基因的表達(dá)量進(jìn)行比較來鑒定羅非魚魚種性別。本發(fā)明所建立的方法具有特異性強(qiáng)、可信度高，可應(yīng)用于羅非魚魚種階段的性別鑒定。
[0012]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是實(shí)施例第二部分中的AMH基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2是實(shí)施例第三部分中β -actin基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)曲線
【具體實(shí)施方式】
[0014]第一部分吉富羅非魚AMH基因的測(cè)序
吉富羅非魚血液基因組DNA提取，設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化，轉(zhuǎn)入載體，藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒測(cè)序，所設(shè)計(jì)的引物序列為:
正向:GCTGTGTGCATTTCAGGAGACA反向:TGTCTCCTGAAATGCACACAGC
用此方法克隆所得吉富羅非魚AMH基因含內(nèi)含子的部分序列為(SEQ ID N0.5):GCTGTGTGCATTTCAGGAGACACACAGTACGTACTCCTGACAGGAAAATCATCAGAGGGGAGTGTTAACGACAGGTGGCATATTACGGCACAGACAAAACTGCCTCATATGA^-1^a ta tea tcttcttcattttatt tcccca tctctggtteattgtgtaccctacttacattt`cctcteattgia^-AGCAAAACCTAAAAAGCATCTTGATTGGTGAAAAATCAGGAAGTAACATCAGCACGAGTCCACTTCTACTTTTCTCCGGGGGAACGGGAACTGATACGAGrtcaccccegctttctttc tgc tgaca t tcac tgtcgt c a gaga egege tcagc 11 tggt ttttatttt tgc 11 tcccagK\^\GCTTCAGGCTCGCCCCCGGCATCTCTGCAAACCTCCTTCCTTTGTGAGATGAATCGCTTGCTGGGTGCTGTGCTCCCTCAGGAACACTTCGCGTCCCCTCCACTTCCTCTGGACTCCTTACAGTCTCTGCCTCCCCTCTCGCTTGGCTTATCCTCCAGCGAGACCCTGCTGGCAGTAATGATCAACTCCACAGCTCCCACAGTCTTTGGCTTCACGAGTTGGGGCTCCGTGTTGCCGGTGTGGCACGGAGAGCTAGCCCTGTCTGCTGCAATGTTAGAGGAGCTCAGACAGAGACTCGACCAGACTTTGGTGCAAATGACAGAAATAATCAGAGAGGAATAGGTTTCACCGGGAGCCAAGGAGAGCCTGGGGAGGCTCAAAGAACTGAGTGCATTACAGGAGAAAGA
其中，大寫字母為外顯子，小寫字母為內(nèi)含子，下劃線為real tim PCR引物設(shè)計(jì)時(shí)采用的序列。PCR 擴(kuò)增的反應(yīng)條件為:95°C 3min ; [30 循環(huán) 94°C 30s、57°C 30s、72°C lmin]；72°C延長(zhǎng)8min ;4°C度保存。
[0015]然后根據(jù)該基因序列設(shè)計(jì)正向和反向?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增引物。
[0016]第二部分吉富羅非魚AMH基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取吉富羅非魚成魚卵巢，參照說明書，用Trizol裂解法抽提總RNA。用1 μ g總RNA，以O(shè)igo dT Primer 和 Random 6 mers 為引物(Takara,大連)，根據(jù) M-MLV (Takara,大連)使用說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)總體積為10 μ 1。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行5倍系列梯度稀釋，選取選取5°飛_4共5個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，引物見表1。以Ct值為坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y==-0.2874X+10.30，其相關(guān)系數(shù)為 r2=0.973，如圖 1。
[0017]表1實(shí)驗(yàn)中的實(shí)時(shí)熒光PCR引物
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，包括如下步驟:第1步、提取吉富羅非魚的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA ；第2步、以吉富羅非魚的AMH基因的正向和反向引物、以及β-actin管家基因的正向和反向引物，對(duì)反轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；第3步、通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定吉富羅非魚的AMH基因的相對(duì)表達(dá)量，如果魚種性腺中AMH表達(dá)量比成魚卵巢高10倍以上，魚種則為雄魚，如果小于或等于10倍，魚種則為雌魚；其中，AMH基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.1所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.2所示；β-actin基因的正向引物的序列如SEQ ID N0.3所示，反向引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于:所述的第2步中實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增的程序是:94°C 3min,然后40個(gè)循環(huán)94°C 5s，62°C 20s,最后 72°C 3min，4°C 保存。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鑒別吉富羅非魚性別的實(shí)時(shí)熒光PCR方法，其特征在于:所述的在第3步中，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的標(biāo)準(zhǔn)曲線是以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，進(jìn)行5倍系列稀釋，選取5個(gè)濃度梯度進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，以Ct值為坐標(biāo)，以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，獲得相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4.一種鑒別吉富羅非魚性別的引物組，其特征在于:所述的引物組的一對(duì)正向和反向引物的序列如SEQ ID N0.1~2所示。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103667449SQ201310548365
【公開日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】唐永凱, 李建林, 李紅霞, 俞菊華, 徐跑 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心