一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌的制作方法
【專利摘要】一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌，涉及一株化能異養(yǎng)細(xì)菌。本發(fā)明提供了一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌，具有可同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的能力。一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌屬于假單胞菌X2（Pseudomonas?sp.X2），保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏日期為2013年8月5日，保藏號為CCTCC?NO：M?2013362。本發(fā)明的假單胞菌X2能夠同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的作用，應(yīng)用在污水處理系統(tǒng)中可替代多種細(xì)菌聯(lián)合代謝作用。
【專利說明】一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株化能異養(yǎng)細(xì)菌。
【背景技術(shù)】
[0002]許多工業(yè)行業(yè)在生產(chǎn)過程中大量使用含有硫、氮的有機(jī)原料，導(dǎo)致產(chǎn)生了大量含有硫氮的有機(jī)廢水，同時加上人們?nèi)粘Ｉ钪信欧诺纳钗鬯伯a(chǎn)生了大量的含氮污染物，這些污水如果未經(jīng)處理，直接排放到自然環(huán)境中，會對其產(chǎn)生諸多方面的危害，而生物處理技術(shù)具有運行成本低，無二次污染等優(yōu)點，在世界上受到廣泛應(yīng)用。
[0003]國內(nèi)外處理含硫、含氮廢水的方法過程中，通常利用多種細(xì)菌的聯(lián)合代謝作用。即利用異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，以有機(jī)物作為電子供體，硝酸根作為電子受體進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。在此過程中同時去除有機(jī)物和硝酸鹽。利用自養(yǎng)脫硫反硝化細(xì)菌，以硫化物作為電子供體，硝酸根作為電子受體進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。在此過程中同時去除硫化物和硝酸鹽。但是此處理方法依靠多種微生物協(xié)同作用，代謝過程復(fù)雜，微生物群落穩(wěn)定性差，耐沖擊性差，污水處理裝置穩(wěn)定運行非常困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一株化能異養(yǎng)細(xì)菌，具有可同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的能力。
[0005]本發(fā)明是一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌，它為Pseudomonassp.X2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏日期為2013年8月5日，保藏號為CCTCC NO:M2013362。
[0006]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2(假單胞菌X2)為革蘭氏陰性菌,呈桿狀,長為1.0~
1.5 μ m，寬為0.5~1.0 μ m，無芽孢，單級鞭毛，生長溫度范圍為10°C~40°C，生長pH值范圍為7~10 ;在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形突起，邊緣規(guī)則，四周透明無色，中心呈黃色，菌落直徑為1mm~2mm。
[0007]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)可利用酵母粉、淀粉或乙酸等作為碳源及利用硝酸根、銨離子作為氮源生長。
[0008]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)接觸酶陽性,氧化酶陽性,反硝化反應(yīng)陽性，硫化氫產(chǎn)生反應(yīng)陰性。
[0009]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2通過16S rDNA基因序列比對分析，與假單胞菌屬(Pseudomonas)的16SrDNA序列的同源性最高,相似性為95%,通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定假單胞菌X2屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),為Pseudomonassp.X2 (假單胞菌X2)菌株。
[0010]本發(fā)明Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)能夠快速代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽，Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)能夠在有氧條件下以有機(jī)物作為底物進(jìn)行呼吸獲得能量并生長；在無氧條件下以有機(jī)物和硫化物作為底物，以硝酸根作為電子受體進(jìn)行呼吸獲得能量并生長。生長環(huán)境和條件廣泛，有利于保持生物量。
[0011]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)應(yīng)用在污水處理系統(tǒng)中能夠同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽，能夠在6h內(nèi)代謝61.8%的有機(jī)碳，32.1%的硫化物和57.1%的硝酸鹽，在12h內(nèi)代謝73%的有機(jī)碳，83%的硫化物和99%的硝酸鹽，與現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)中多種細(xì)菌聯(lián)合代謝作用相比，簡化了代謝過程的復(fù)雜性，本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)對于含硫含氮廢水具有實際應(yīng)用價值；在微生物群落穩(wěn)定性和耐沖擊性方面，本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)成為優(yōu)勢菌群后使微生物群落穩(wěn)定性和耐沖擊性較現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)中多種細(xì)菌的高20%。
[0012]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)在污水處理系統(tǒng)中經(jīng)過活性污泥定向馴化，Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)成為優(yōu)勢菌群，它具有同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的能力，所以使污水處理系統(tǒng)運行參數(shù)簡單，系統(tǒng)更加穩(wěn)定，經(jīng)高負(fù)荷污水沖擊后系統(tǒng)更容易恢復(fù)，具有更好的應(yīng)用前景。
[0013]本發(fā)明的Pseudomonas sp.X2屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏日期為2013年8月5日，保藏號為 CCTCC NO:M2013362o
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1是本發(fā)明假單胞菌X2的掃描電子顯微鏡圖像，放大倍數(shù)為25000倍；
[0015]圖2為通過假單胞菌X2和相近菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行同源性比對構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹圖。
【具體實施方式】
[0016]本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的任意組合。
[0017]【具體實施方式】一:本實施方式一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌，它為Pseudomonas sp.X2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏日期為2013年8月5日，保藏號為CCTCC NO:M2013362。
[0018]本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)為革蘭氏陰性菌,呈桿狀,長為1.0~1.5μm，寬為0.5~1.0μm，無芽孢，單級鞭毛，生長溫度范圍為10°C~40°C，生長PH值范圍為7~10 ;在LB固體培養(yǎng)基上菌落呈圓形突起，邊緣規(guī)則，四周透明無色，中心呈黃色，菌落直徑為1mm~2mm。
[0019]參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》第八版和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》對Pseudomonassp.X2 (假單胞菌X2)進(jìn)行生理生化鑒定:接觸酶陽性，氧化酶陽性，反硝化反應(yīng)陽性，硫化氫產(chǎn)生反應(yīng)陰性。
[0020]本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)能夠快速代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽，假單胞菌X2能夠在有氧條件下以有機(jī)物作為底物進(jìn)行呼吸獲得能量并生長；在無氧條件下以有機(jī)物和硫化物作為底物，以硝酸根作為電子受體進(jìn)行呼吸獲得能量并生長。生長環(huán)境和條件廣泛，有利于保持生物量。
[0021]本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)應(yīng)用在污水處理系統(tǒng)中能夠同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽，與現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)中多種細(xì)菌聯(lián)合代謝作用相比，簡化了代謝過程的復(fù)雜性；在微生物群落穩(wěn)定性和耐沖擊性方面，本發(fā)明的假單胞菌X2成為優(yōu)勢菌群后使微生物群落穩(wěn)定性和耐沖擊性較現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)中多種細(xì)菌的高20%。
[0022]本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)在污水處理系統(tǒng)中經(jīng)過活性污泥定向馴化，假單胞菌X2成為優(yōu)勢菌群，具有同時代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的能力，所以是污水處理系統(tǒng)運行參數(shù)簡單，系統(tǒng)更加穩(wěn)定，經(jīng)高負(fù)荷污水沖擊后，系統(tǒng)更容易恢復(fù)，具有更好的應(yīng)用前景。
[0023]本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)的最適生長溫度:30°C,最適生長pH:7~8
[0024]【具體實施方式】二:本實施方式的假單胞菌X2由活性污泥中篩選得到。篩選按以下步驟進(jìn)行:
[0025](I)菌懸液的制備:將從污水處理廠二次沉淀池中取出去的IOOmL活性污泥放入?yún)捬跗恐校傧騾捬跗恐屑尤胍后w培養(yǎng)基，在30°C的條件下，以120r/min預(yù)培養(yǎng)48h，得到菌懸液；
[0026]其中所述的液體培養(yǎng)基是按每IL液體培養(yǎng)基中含有0.75g Na2S, Ig KNO3, IgCH3COONa, Ig NH4Cl, 1.5g KH2PO4, 3g Na2HPO4,0.1g MgSO4 ；
[0027](2)菌懸液梯度稀釋:在無菌操作條件下，取步驟(1)得到的菌懸液ImL加入到含有9mL無菌水的厭氧管中制成菌懸液的濃度為10_\再以同樣的方法進(jìn)行10倍的梯度稀釋，直至稀釋液的濃度為10_8為止；
[0028](3)靜止恒溫培養(yǎng):在無菌操作條件下，將步驟(2)中得到每一個稀釋倍數(shù)的菌懸液各取出1ml，分別放入含有固體培養(yǎng)基的厭氧管中，使菌懸液掛壁到厭氧管內(nèi)壁的固體培養(yǎng)基上，去除厭氧管中剩余的菌懸液后，得到含有菌懸液掛壁的厭氧管，將含有菌懸液掛壁的厭氧瓶放入培養(yǎng)箱，在30°C的條件下靜止恒溫培養(yǎng)72-96h，得到單菌落，觀察單菌落的大小和其特征形態(tài)；
[0029]其中所述的含有固體培養(yǎng)基的厭氧管，是按如下制備的:排出厭氧管中的空氣，在每支厭氧管中加入7ml凝固前的瓊脂固體培養(yǎng)基，蓋緊橡膠膠塞，在溫度為121°C的條件下滅菌15min，采用亨蓋特厭氧滾管方法制備含有固體培養(yǎng)基的厭氧管；
[0030]其中所述的瓊脂固體培養(yǎng)基是由步驟(1)所述的液體培養(yǎng)基和瓊脂配制而成，其中瓊脂與液體培養(yǎng)基的質(zhì)量體積比為15g:1L;
[0031](4)搖動恒溫培養(yǎng):在無菌操作條件下，將步驟(3)中得到的單菌落用接種針接入到已滅菌的液體培養(yǎng)基中，在恒溫空氣浴搖床中，在溫度為30°C、搖床轉(zhuǎn)速為120r/min的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；
[0032](5)重復(fù)培養(yǎng):在無菌操作條件下，取步驟(4)得到的0D600值為I~1.5菌懸液ImL加入到含有9mL無菌水的厭氧管中制成菌懸液的濃度為10-1，再以同樣的方法進(jìn)行10倍的梯度稀釋，直至稀釋液的濃度為10_8為止，再重復(fù)步驟(3)和步驟(4)，直至瓊脂固體培養(yǎng)基上生長的所有單菌落的形態(tài)特征為:呈圓形突起，邊緣規(guī)則，四周透明無色，中心呈黃色，即得假單胞菌X2。
[0033]對篩選得到的假單胞菌X2進(jìn)行分子鑒定，按以下步驟進(jìn)行:
[0034](I)利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取假單胞菌X2純培養(yǎng)的總DNA，采用細(xì)菌16SrDNA通用引物F27、R1492，以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。然后利用膠回收試劑盒(購買自天根生化科技有限公司)回收純化PCR產(chǎn)物，之后進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆子菌落，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后委托華大基因公司測序。
[0035]假單胞菌X2的16S rRNA基因序列長度為1411bp，其序列提交至GenBank，以確定菌株的種屬關(guān)系。同源性分析結(jié)果表明，該序列與假單胞菌屬(Pseudomonas)的16S rDNA序列的同源性最高，相似性為95%，通過結(jié)合菌體形態(tài)特征、生長條件、生理生化鑒定結(jié)果確定假單胞菌X2屬于假單胞菌屬(Pseudomonas),為Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)菌株。
[0036]PCR引物購買自華大基因公司，其他試劑購自寶生物工程有限公司。
[0037]對本實施方式的Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)進(jìn)行功能驗證:
[0038]Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)代謝有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的功效檢測,具體方法如下:
[0039]①用蒸餾水配制功效檢測培養(yǎng)基，所述的功效檢測培養(yǎng)基是按每IL功效檢測培養(yǎng)基中含有 0.75g Na2S, Ig KNO3, Ig CH3COONa, Ig NH4Cl, 1.5g KH2PO4, 3g Na2HPO4,0.1gMgSO4 ；
[0040]②取步驟①配置的功效檢測培養(yǎng)基200mL放入?yún)捬跗恐?，將厭氧瓶中的氧氣排空后，?2rC，15min條件下將含功效檢測培養(yǎng)基的厭氧瓶進(jìn)行滅菌，得到滅菌后的含功效檢測培養(yǎng)基的厭氧瓶；
[0041 ] ③將培養(yǎng)到0D600值為I~1.5的菌懸液5mL加入到步驟②得到的含功效檢測培養(yǎng)基的厭氧瓶中，再將其在30°C，1`20r/min條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)0h、6h和12h后，用DionexICS-3000型離子色譜儀測定Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)所生長的培養(yǎng)基中有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的變化，其中Dionex ICS-3000型離子色譜儀的工作參數(shù)為:采用1nPacAG4A AS4A_SC4mm 分析柱,淋洗液成分為 1.8mmol/L Na2C03> 1.7mmoI/LNaHCO3,流速為 Icm3/min ;得到表1:
[0042]表1為培養(yǎng)0h、6h和12h后Pseudomonas sp.X2 (假單胞菌X2)菌所生長的培養(yǎng)
基中有機(jī)物、硫化物和硝酸鹽的變化
[0043]
【權(quán)利要求】
1.一株同步代謝硫化物和硝酸鹽的兼性化能異養(yǎng)細(xì)菌，其特征在于它為Pseudomonassp.X2，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址是湖北省武漢市武昌珞珈山，保藏日期為2013年8月5日，保藏號為 CCTCC NO:M2013362。
【文檔編號】C12R1/38GK103555633SQ201310551914
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】王愛杰, 譚文勃, 陳川, 遠(yuǎn)野, 黃聰 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)