小鼠肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小鼠肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的方法包括步驟：1）從胎齡為13至15天的小鼠胚胎中分離肝臟；2）獲得肝臟的細胞懸液；3）將細胞在小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)，獲得單克?。?）將單克隆在明膠上進行傳代培養(yǎng)；5）獲得肝臟前體細胞。這種方法簡單易行、不受儀器限制、產(chǎn)量大、純度高，所獲得的肝臟前體細胞不具有致瘤性，且具有向肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞進行雙向分化的潛能。
【專利說明】小鼠肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞生物學領(lǐng)域，尤其涉及一種小鼠肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在肝臟再生及發(fā)育過程中，肝臟前體細胞發(fā)揮著非常重要的作用。肝臟前體細胞(hepatoblast)具有很強的自我更新能力，同時具有向肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞進行雙向分化的能力。它是研究肝臟發(fā)育及肝細胞分化的理想細胞來源。
[0003]這種細胞最早出現(xiàn)于小鼠胚胎肝臟發(fā)育的第8.5天，是由心臟中胚層誘導產(chǎn)生的，這一時期它主要表達甲胎蛋白(AFP)和白蛋白(ALB)。而在胚胎發(fā)育的第13.5天，這種具有雙向分化功能的細胞開始向肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞進行分化[Jung J等人，1999 ；Zhao R 等人，2005 ；Lemaigre F 等人，2004]。
[0004]截至目前，人們對肝臟前體細胞的分離進行了各種各樣的研究，主要的分離方法有突光活化細胞分選(fluorescence activated cell sorting, FACS)及磁性活化細胞分選(magnetic activated cell sorting, MACS)等方法。FACS方法主要是用通過特異性抗體識別細胞表面的分子標志物，然后通過流式細胞儀分選而得到所需要的肝臟前體細胞。目前報道的肝臟前體細胞的分子標志物主要有CD34、Thy-1、c_Kit、Dlk和E-cadherin等[Petersen BE 等人，2003 ;Wang X 等人，2003 ;Petersen BE 等人，1998 ;Crosby HA 等人，2001和Tanimizu N等人，2003]。FACS方法雖然特異性高，但分選步驟復雜、流程長，對細胞損傷大，嚴重影響細胞活力，不利于后續(xù)培養(yǎng)。后來人們又用到了 MACS這種改良的方法來分離肝臟前體細胞。它主要是利用肝臟前體細胞的各種分子標志物蛋白的單克隆抗體作為第一抗體與單細胞懸液孵育后，再與免疫磁珠(micro-beads)標記的第二抗體結(jié)合，這種特異性標記的細胞懸液流過特制的永久磁鐵的磁場時，被吸附在磁式分選柱內(nèi)，再將磁式分選柱移開磁場，從柱內(nèi)洗脫，進而分離得到肝臟前體細胞。MACS需要的設(shè)備簡單，能夠在超凈臺中操作，但進行多標記分選時需要分步進行，操作步驟相對復雜，同時存在一定比例的非特異性結(jié)合，影響分離細胞的純度。
[0005]小鼠肝臟前體細胞是肝臟發(fā)育及肝細胞分化研究中的理想工具，需求量大、對細胞的品質(zhì)要求高。因此，本領(lǐng)域仍需要一種操作簡單、不受儀器限制、細胞產(chǎn)量大且分離純度較高的改良方法來獲得肝臟前體細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，包括步驟:
[0007]I)從小鼠胚胎中分離肝臟；
[0008]2)獲得肝臟的細胞懸液；
[0009]3)將細胞在小鼠成纖 維細胞飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)，獲得單克??；
[0010]4)將單克隆在明膠上進行傳代培養(yǎng)；
[0011]5)獲得肝臟前體細胞。[0012]在一些實施方式中，小鼠胚胎的胎齡為13至15天。在優(yōu)選的實施方式中，小鼠胚胎的胎齡為13.5天(表示為E13.5)，此時分離的肝臟前體細胞在飼養(yǎng)層上形成的克隆較大，較典型規(guī)則，同時細胞呈規(guī)則的多邊形，易于挑取。
[0013]在一些實施方式中，可以通過任何公知方法制備小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層，如方馳華等人，2010 ;盧海等人，2012 ;楊恕玲等人，2005 ;黃奔等人，2005中描述的方法。還可以使用市售的小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層。
[0014]在一些實施方式中，將細胞在成纖維細胞飼養(yǎng)層上傳代1-2次，獲得細胞的單克隆。在一些實施方式中，經(jīng)過飼養(yǎng)層培養(yǎng)之后，挑取細胞的單克隆接種到明膠上繼續(xù)傳代2-3次，收獲大量的細胞單克隆。
[0015]本發(fā)明方法中所用的小鼠屬于哺乳綱(Mammalia)卩齒齒目(Rodentia)鼠科(Muridae)小鼠屬(Mus)。小鼠成熟早，繁殖力強。小鼠6_7周齡時性成熟，妊娠期為19-21天，一次排卵10-23個，每胎產(chǎn)仔數(shù)為8-15只，一年產(chǎn)仔胎數(shù)6-10胎。屬全年、多發(fā)情性動物，繁殖率很高。本發(fā)明的方法對于小鼠的具體品系或品種并沒有限制，只要其妊娠期為19-21天，任何品系或品種的小鼠均適用于本發(fā)明的方法。因此可以根據(jù)肝臟前體細胞的最終用途選擇適當?shù)男∈笃贩N，作為非限定性的實例，包括但不限于AKR、A/HeN、AL771、B10、BALB/c、BALB/CAnN、C3H、C3He、C3Hf、C3/H/HCN、C57L、C57BL、C57BL/6、C57BL/10、C57BL/6N、C57BL/KaLwN、C57BR、C58、C58/LWN、CBA/N、CBA/CaHN、DBA、DBA/2、DBA/1JN、D2/nSnN、LACA,L615、L6565、L7212、LS783、NZB/N、NZBXNZff, Rill、RF、RS615、SJL, STR/N、STAR/N、SffR,昆明種、津638、以及上述小鼠品種的雜交或衍生品種。在一些具體的實施方式中，小鼠是C57BL/6。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供一種細胞制品，其含有根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肝臟前體細胞。
[0017]在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明方法生產(chǎn)的肝臟前體細胞不表達可檢測水平的造血干細胞標志物。其中所述“不表達可檢測水平的造血干細胞標志物”是指就目前的科學技術(shù)水平而言，采用任何適當?shù)臋z測手段和判斷標準，不能檢測到造血干細胞標志物的表達，認為其表達為陰性。在一些實施方式中，代表性造血干細胞標志物選自:⑶45、⑶117和⑶34中的一種或多種。在一些具體的實施方式中，⑶45、⑶117和⑶34均不表達。
[0018]在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肝臟前體細胞中有90%以上為間充質(zhì)細胞標志物陽性。在一些具體的實施方式中，間充質(zhì)細胞標志物為CD44。
[0019]在一些實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法生產(chǎn)的肝臟前體細胞為肝臟前體細胞標志物陽性、和/或成熟膽管上皮細胞標志物陽性和/或成熟肝實質(zhì)細胞標志物陽性。
[0020]在一些具體的實施方式中，肝臟前體細胞標志物選自:AFP和DLK中的一種或多種。其中87%以上的肝臟前體細胞為DLK陽性。在一些具體的實施方式中，成熟膽管上皮細胞標志物為CK-19。在一些具體的實施方式中，成熟肝實質(zhì)細胞標志物為ALB。
[0021]本發(fā)明中“陽性”是指就目前的科學技術(shù)水平而言，采用任何適當?shù)臋z測手段和判斷標準，可以檢測到標志物的表達，認為其為陽性。
[0022]本發(fā)明中按照公知方法確定小鼠的胎齡，例如雄性與雌性小鼠合籠后，通過陰栓觀察法、或者通過精子涂片法確定是否懷孕。在一些實施方式中，通過陰栓觀察法確定小鼠的胎齡，當出現(xiàn)陰栓即認為是妊娠第0.5天，即胎齡為0.5天?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0023]圖1.小鼠肝臟前體細胞的生產(chǎn)流程圖。
[0024]圖2A.肝臟前體細胞的基本形態(tài)，用相差顯微鏡觀察從不同發(fā)育時期胚胎肝臟中分離的肝臟前體細胞在飼養(yǎng)層上形成細胞克隆的情況(標尺為100 μ m)。
[0025]圖2B.肝臟前體細胞的基本形態(tài)，不同時期肝臟前前體細胞的基本形態(tài)(標尺為100 μm)。
[0026]圖3A.對肝臟前體細胞進行鑒定，免疫熒光檢測AFP的表達(標尺為100 μ m)。
[0027]圖3B.對肝臟前體細胞進行鑒定，免疫熒光檢測ALB的表達(標尺為100 μ m)。
[0028]圖3C.對肝臟前體細胞進行鑒定，免疫熒光檢測CK-19的表達(標尺為100 μ m)。
[0029]圖3D.流式細胞技術(shù)檢測造血干細胞的分子標志物(⑶4、⑶117、⑶34)、間充質(zhì)細胞的分子標志物(⑶44)及肝臟前體細胞的分子標志物(DLK)的表達情況。
[0030]圖3E.通過皮下成瘤實驗檢測所分離細胞(左側(cè))的成瘤能力。
[0031]圖4A.誘導肝臟前體細胞向成熟肝實質(zhì)細胞進行分化，通過相差顯微鏡觀察ODH誘導過程中肝臟前體細胞的形態(tài)變化(標尺為100 μ m)。其中W/0 ODH組未經(jīng)ODH誘導；W/ODH組經(jīng)過ODH誘導。
[0032]圖4B.過碘酸-希夫反應(PAS)檢測ODH誘導過程中糖原合成能力的改變(標尺為100 μ m)。其中W/0 ODH組未經(jīng)ODH誘導；W/0DH組經(jīng)過ODH誘導。
[0033]圖5A.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物AFP在mRNA水平的變化。
[0034]圖5B.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物DLK在mRNA水平的變化。
[0035]圖5C.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物ALB在mRNA水平的變化。
[0036]圖5D.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物TAT在mRNA水平的變化。
[0037]圖5E.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物G6Pase在mRNA水平的變化。
[0038]圖5F.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物TO在mRNA水平的變化。
[0039]圖5G.實時PCR檢測ODH誘導過程中分子標志物CPS在mRNA水平的變化。
[0040]圖6A.Western印跡檢測ODH誘導過程中分子標志物AFP在蛋白質(zhì)水平的變化。
[0041]圖6B.Western印跡檢測ODH誘導過程中分子標志物ALB在蛋白質(zhì)水平的變化。
[0042]圖6C.Western印跡檢測ODH誘導過程中分子標志物HNF4 α在蛋白質(zhì)水平的變化。
[0043]圖7Α.通過相差顯微鏡觀察未經(jīng)Matrigel誘導的肝臟前體細胞形態(tài)學的改變，W/0 Matrigel表示沒有加入Matrigel,經(jīng)過7天培養(yǎng)之后細胞不能形成典型的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)(標尺為100 μ m)。
[0044]圖7B.誘導肝臟前體細胞向膽管上皮細胞進行分化，通過相差顯微鏡觀察Matrigel誘導過程中肝臟前體細胞形態(tài)學的改變,W/Matrigel表示加入有Matrigel (標尺為 100 μ m)。
[0045]圖8.通過免疫熒光檢測CK-18、CK_19及GGT在Matrigel誘導過程中的表達變化，ff/0 Matrigel表示沒有加入Matrigel的組；W/Matrigel表示加入Matrigel的組(標尺為100 μm)。
[0046]圖9A.通過實時PCR檢測Matrigel誘導過程中分子標志物AFP在mRNA水平的表達變化。
[0047]圖9B.通過實時PCR檢測Matrigel誘導過程中分子標志物DLK在mRNA水平的表達變化。
[0048]圖9C.通過實時PCR檢測Matrigel誘導過程中分子標志物CK-7在mRNA水平的
表達變化。
[0049]圖9D.通過實時PCR檢測Matrigel誘導過程中分子標志物CK-18在mRNA水平的
表達變化。
[0050]圖9E.通過實時PCR檢測Matrigel誘導過程中分子標志物CK-19在mRNA水平的表達變化(圖9A至9E中，ff/0 Matrigel表示沒有加入Matrigel的組；W/Matrigel表示加A Matrigel 的組)。
【具體實施方式】
[0051]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不意味著用于限制本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，實驗材料均購自常規(guī)生化試劑商。本發(fā)明的實驗方案得到了首都醫(yī)科大學實驗動物倫理審查委員會的批準，并按照《GB14925-2010實驗動物:環(huán)境及設(shè)施》和《GB14924.3-2001實驗動物:小鼠大鼠配合飼料》等國家和行業(yè)標準中的要求進行動物操作。
[0052]實施例1:從小鼠胚胎中分離肝臟
[0053]1.將不同妊娠期(胎齡E9.5-E16.5)的孕鼠(C57BL/6)進行深度麻醉之后，通過頸椎脫臼的方法處死。用手術(shù)剪剖 開腹部取出含有胎鼠的子宮，放入冰上預冷的PBS中。
[0054]2.用眼科鑷從子宮中分離出胎鼠，并將其放入冷的PBS中。
[0055]3.通過體視顯微鏡，從胎鼠中分離出不同時期的胚肝，并剔除掉周圍的內(nèi)臟組織。胚胎肝臟與周圍組織相比成粉紅色，較其它周圍內(nèi)臟組織(白色)易于區(qū)分。
[0056]實施例2:制備肝臟的單細胞懸液
[0057]將實施例1分離的胚胎肝臟用剪刀剪碎，再通過肝消化液(含有0.25g/100ml胰酶的EDTA溶液，即將0.25g胰酶和0.025gEDTA加入到100ml PBS中制備而成)進行消化，使其分散成單細胞懸液。
[0058]實施例3:細胞的培養(yǎng)
[0059]1.將分散的單細胞懸液(其中的細胞稱為PO代細胞)接種到經(jīng)Y射線處理(滅菌處理)小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層(mouse embryo fibroblast, MEF,貨號為MUIEF-01002)上，并在肝臟前體細胞培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。其中肝臟前體細胞培養(yǎng)基的配方為補充有10% (v/V)胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100 μ M非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素、28.6 μ M beta-巰基乙醇的DMEM培養(yǎng)基。將細胞在含有5%C02和95%空氣的37°C孵箱中進行培養(yǎng)，每兩天換一次液。經(jīng)過7天培養(yǎng)之后，其上能長出很多規(guī)則的細胞的單克隆(稱為Pl代)。
[0060]將細胞的單克隆挑取后接種到新的飼養(yǎng)層和肝臟前體細胞培養(yǎng)基上面繼續(xù)擴大培養(yǎng)，在飼養(yǎng)層細胞上面就能長出大量的細胞的克隆，得到P2代細胞。
[0061]挑取單克隆并接種到鋪有0.1%明膠(即將0.1g明膠粉加入100mlPBS中)的多孔板上面繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)過2-3次傳代(即獲得P4-P5代)。作為一個實例，從每個Pl代胚胎肝臟細胞單克隆傳代至P4代時，能獲得I X IO6至2X IO6個肝臟前體細胞。這些細胞可以進行下面的流式鑒定、免疫熒光等試驗。
[0062]實施例4:肝臟前體細胞形態(tài)學觀察
[0063]從胚胎發(fā)育早期、中期和晚期的肝臟中分別分離了肝臟前體細胞。
[0064]如圖2A所示，在胚胎肝臟發(fā)育早期分離的肝臟前體細胞，如E10.5天，其在飼養(yǎng)層上面形成的克隆較小，數(shù)目較少，不利于挑取。而在胚胎肝臟發(fā)育晚期分離的肝臟前體細胞，如E16.5天，其在飼養(yǎng)層上形成的克隆，細胞形狀不規(guī)則，含有血細胞，成纖維細胞等很多雜細胞。而在胚胎發(fā)育的中期(13-15天)，尤其是E13.5天分離的肝臟前體細胞，其在飼養(yǎng)層上形成的克隆較大，較典型規(guī)則，同時細胞呈規(guī)則的多邊形，易于挑取。因此優(yōu)選采用E13.5胎齡的小鼠進行。
[0065]將從E13.5天胚肝中獲得的肝臟前體細胞(即PO代)在飼養(yǎng)層細胞上面?zhèn)鞔?_2次，其能形成典型的克隆(Pl或P2代)，這一時期(P1-P2代)細胞邊緣明亮，細胞呈規(guī)則的多邊形(圖2B)。然而，從P3代開始，這些細胞形狀變得不規(guī)則，成典型的掌狀形態(tài)，同時也不能形成典型的克隆(圖2B，P3、P4、P6代)。因此，優(yōu)選采用P1-P2代的細胞從飼養(yǎng)層轉(zhuǎn)移到明膠上進行擴增。
[0066]接下來從細胞狀態(tài)良好的Pl或P2代開始，將這些細胞接種到鋪有0.1%明膠的多孔板上，每隔2-3天傳代一次。發(fā)現(xiàn)隨著細胞的傳代，細胞分枝逐漸減少，細胞核質(zhì)比降低，細胞變得扁平，生長速度減慢。因此，在明膠上優(yōu)選傳代1-5次，更優(yōu)選傳代2-3次。
[0067]實施例5:肝臟前體細胞的標志物鑒定
[0068]對通過實施例3生產(chǎn)的細胞進行了一系列的鑒定。通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，其能夠表達肝臟前體細胞的分子標`志物甲胎蛋白(AFP)(圖3A)、成熟肝實質(zhì)細胞的分子標志物白蛋白(ALB)(圖3B)以及成熟膽管上皮細胞的分子標志物角蛋白(CK-19)(圖3C)。
[0069]同時又通過流式細胞分析的方法檢測了細胞表面的分子標志物，可見這種細胞不能表達造血干細胞的分子標志物，如⑶45、⑶117及⑶34。能夠明顯表達間充質(zhì)細胞的分子標志物⑶44，同時其陽性細胞數(shù)能達到90%以上。而對于肝臟前體細胞的分子標志物DLK，這種細胞也有較強的表達，其陽性細胞數(shù)能到達87%以上(圖3D)。
[0070]這說明本發(fā)明生產(chǎn)的肝臟前體細胞具有很高的純度，它能同時表達間充質(zhì)細胞及肝臟前體細胞的標志物。
[0071]實施例6:皮下致瘤能力檢測
[0072]接下來還對生產(chǎn)的肝臟前體細胞進行了皮下致瘤能力的檢測。將5X IO6的肝臟前體細胞和肝腫瘤細胞H印G2注射到無胸腺BALB/c裸鼠的背部，飼養(yǎng)4周之后發(fā)現(xiàn)，在裸鼠背部HepG2細胞能形成明顯的瘤體，而分離的肝臟前體細胞不能形成瘤體(圖3E)。這說明本發(fā)明生產(chǎn)的肝臟前體細胞不具有致瘤性。通過本發(fā)明方法在E13.5天胚胎肝臟中獲得的這種細胞具有肝臟前體細胞的特性，同時不具有致瘤性。
[0073]實施例7:雙向分化能力檢測
[0074]肝臟前體細胞具有向成熟肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞進行雙向分化的潛能[Zorn等人，2008]，因此也對所獲得的肝臟前體細胞進行了雙向誘導。
[0075]1.向肝實質(zhì)細胞方向的分化
[0076]首先對這種細胞向成熟肝實質(zhì)細胞方向進行了誘導。有文獻報道指出制瘤素M(OSM)、地塞米松(DEX)和干細胞生長因子(HGF)聯(lián)合作用(簡稱ODH)能夠誘導肝臟前體細胞形成成熟的肝實質(zhì)細胞[Zhang W等人，2012]。因此用OSM (10ng/ml )、DEX (IOOnM)及HGF (20ng/ml)聯(lián)合誘導7天之后，檢測肝臟前體細胞的成熟情況。如圖4A所示，經(jīng)過ODH誘導7天之后，肝臟前體細胞的形態(tài)變得較為規(guī)則，部分細胞出現(xiàn)雙核結(jié)構(gòu)(圖4A第七天有兩張圖，其中W/0 ODH組未經(jīng)ODH誘導；W/0DH組表示經(jīng)過ODH誘導)。
[0077]同時還檢測了經(jīng)ODH誘導后肝臟前體細胞功能的改變。通過過碘酸-希夫反應檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ODH誘導7天之后，肝臟前體細胞合成糖原的能力明顯增強(圖4B)(圖4B第七天有兩張圖，其中W/0 ODH組未經(jīng)ODH誘導；W/0DH組代表經(jīng)過ODH誘導)。
[0078]另外通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過ODH誘導7天之后，肝臟前體細胞的分子標志物AFP、DLK在mRNA水平表達明顯降低(圖5A-圖5B);而成熟肝實質(zhì)細胞的分子標志物ALB,TAT (酪氨酸氨基移換酶)、G6Pase (葡萄糖_6_磷酸酶)、T0 (色氨酸2、3雙加氧酶)及CPS (氨甲酰磷酸合成酶)在mRNA水平的表達明顯的增高(圖5C-圖5G)。
[0079]同時還通過western印跡檢測了在發(fā)育過程中幾種重要分子標志物在蛋白質(zhì)水平的表達變化。經(jīng)過ODH誘導7天之后，AFP在蛋白質(zhì)水平明顯降低(圖6A)，而ALB、HNF4在蛋白質(zhì)水平明顯增高(圖6B、圖6C)。
[0080]因此通過上述實驗表明，從E13.5天小鼠肝臟生產(chǎn)的肝臟前體細胞具有向成熟肝實質(zhì)細胞進行分化的能力。
[0081]2.向膽管上皮細胞方向的分化
[0082]通過Matrigel對獲得的肝臟前體細胞向膽管上皮細胞進行了誘導。經(jīng)過I天誘導后發(fā)現(xiàn)肝臟前體細胞表面出現(xiàn)了很多分枝狀的結(jié)構(gòu)；誘導3天之后細胞核質(zhì)比降低，樹枝狀的分枝伸長；而誘導7天之后，部分細胞能形成較規(guī)則的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)(圖7B，W/Matrigel表示加入Matrigel的組)。圖7A為對照組實驗,W/0 Matrigel表示沒有加入Matrigel的組，經(jīng)過7天培養(yǎng)之后細胞不能形成典型的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)。
[0083]通過免疫熒光檢測了膽管上皮細胞的分子標志物CK-18及GGT (半乳糖羥賴氨酰葡糖基轉(zhuǎn)移酶)。發(fā)現(xiàn)誘導7之后，上述標志物在這些細胞中表達明顯增加，尤其在網(wǎng)格狀區(qū)域更為明顯(圖8, ff/0 Matrigel表示沒有加入Matrigel的組；W/Matrigel表示加入Matrigel 的組)。
[0084]而通過實時定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Matrigel誘導7天之后，肝臟前體細胞的分子標志物AFP及Dlk在mRNA水平明顯降低(圖9A、圖9B);而膽管上皮細胞的分子標志物CK-7、CK-18及CK-19在mRNA水平表達明顯增高(圖9C-圖9E)。
[0085]因此通過上述實驗表明，獲得的肝臟前體細胞也具有向膽管上皮細胞進行分化的能力。
[0086]小結(jié):
[0087]本發(fā)明從E13.5天的小鼠胚肝中分離肝臟前體細胞，并將其在MEF飼養(yǎng)層上培養(yǎng)，并隨后對單克隆擴大化培養(yǎng)，進而得到大量的能夠進行實驗研究的肝臟前體細胞。這種方法相比流式分選的方法，具有產(chǎn)量高、造價低、簡便易行、不受儀器限制等優(yōu)點。同時對獲得的肝臟前體細胞進行了一系列的鑒定，發(fā)現(xiàn)其具有肝臟前體細胞的特性，不具有致瘤性，同時還具有向肝實質(zhì)細胞和膽管上皮細胞進行雙向分化的功能。為進一步研究肝臟的發(fā)育及肝細胞的分化提供了一個很好的平臺。[0088]參考文獻
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【權(quán)利要求】
1.一種肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，包括步驟: 1)從小鼠胚胎中分離肝臟； 2)獲得肝臟的細胞懸液； 3)將細胞在小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層上進行傳代培養(yǎng)，獲得單克??； 4)將單克隆在明膠上進行傳代培養(yǎng)； 5)獲得肝臟前體細胞； 其中，所述小鼠胚胎的胎齡為13至15天。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，其中小鼠胚胎的胎齡為13.5天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，其中所述小鼠為妊娠期為19-21天的小鼠，優(yōu)選所述小鼠選自:AKR、A/HeN、AL771、B10、BALB/c、BALB/CAnN、C3H、C3He、C3Hf、C3/H/HCN、C57L、C57BL、C57BL/6、C57BL/10、C57BL/6N、C57BL/KaLwN、C57BR、C58、C58/LWN、CBA/N、CBA/CaHN、DBA、DBA/2、DBA/1JN、D2/nSnN、LACA, L615、L6565、L7212、LS783、NZB/N、NZBXNZff, Rill、RF、RS615、SJL, STR/N、STAR/N、SWR、昆明種、津 638 以及上述品種的雜交或衍生品種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，步驟3)中所述傳代為傳代1-2次，優(yōu)選2次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肝臟前體細胞的生產(chǎn)方法，步驟4)中所述傳代為傳代1-5次，優(yōu)選2-3次。
6.一種細胞制品，其含有根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述方法生產(chǎn)的肝臟前體細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞制品，其中所述肝臟前體細胞不表達可檢測水平的造血干細胞標志物，優(yōu)選所述造血干細胞標志物選自:⑶45、⑶117和⑶34中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞制品，其中所述肝臟前體細胞的90%以上為間充質(zhì)細胞標志物陽性，優(yōu)選所述間充質(zhì)細胞標志物為CD44。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞制品，其中所述肝臟前體細胞為肝臟前體細胞標志物陽性、和/或成熟膽管上皮細胞標志物陽性和/或成熟肝實質(zhì)細胞標志物陽性， 優(yōu)選所述肝臟前體細胞標志物選自:AFP和DLK中的一種或多種； 優(yōu)選所述成熟膽管上皮細胞標志物為CK-19 ； 優(yōu)選所述成熟肝實質(zhì)細胞標志物為ALB。
【文檔編號】C12N5/071GK103589681SQ201310553216
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】安威, 孫廣永, 董凌月 申請人:首都醫(yī)科大學