小RNA的3’-5’-qPCR定量檢測技術(shù)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種小RNA的3’-5’-qPCR定量檢測技術(shù)，揭示了一種基于熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行從內(nèi)向外即3’→5’PCR，對(duì)小RNA進(jìn)行高特異性、高靈敏度以及低成本檢測和定量的方法。
【專利說明】小RNA的3’ -5’ -qPCR定量檢測技術(shù)
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】；更具體地，本發(fā)明涉及一種新的小RNA的3’ -5’ -qPCR定量檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002]小RNA包括內(nèi)源或外源導(dǎo)入的siRNA及內(nèi)源性microRNA、piRNA等，它們不編碼蛋白質(zhì)且高度保守并廣泛存在于各物種中。microRNA廣泛存在于各個(gè)物種并具有組織特異性表達(dá),長約21-25個(gè)核苷酸，由Dicer加工而成，主要功能是通過2_8核苷酸位置的種子序列與靶標(biāo)不完全互補(bǔ)配對(duì)，在翻譯水平抑制基因表達(dá)，一個(gè)microRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，可見microRNA參與多個(gè)信號(hào)通路的調(diào)控，在生理和各種病變過程中發(fā)揮作用。現(xiàn)在，大約50%已鑒定的人microRNA編碼基因被發(fā)現(xiàn)位于與腫瘤相關(guān)的染色體易斷裂區(qū)域，幾乎所有惡性腫瘤中都有發(fā)現(xiàn)microRNA異常表達(dá)或者發(fā)生突變。
[0003]2006年7月，Nature、Science等雜志幾乎同時(shí)報(bào)道了一類新的非編碼小RNA——piRNA。piRNA大約24-30個(gè)核苷酸長,它與Argonaute家族成員piwi蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。與microRNA不同，piRNA的形成不需要RNA酶Dicer的參與。它們存在于從果蠅到人的許多動(dòng)物的雌雄生殖細(xì)胞中。很大一部分的PiRNA與反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的序列有關(guān)，這說明PiRNA可能參與這些可移動(dòng)元件的沉默，從而維持生殖細(xì)胞基因組的完整。
[0004]siRNA也是一種小分子RNA,長度與microRNA類似,也由Dicer加工而成,不同的是siRNA主要通過與IE標(biāo)mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)來降解mRNA從而抑制翻譯。人們利用siRNA的生理功能，使之成為實(shí)驗(yàn)室中強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具，利用具有同源性的雙鏈RNA誘導(dǎo)序列特異的目標(biāo)基因的沉寂，迅速阻斷基因活性。雙鏈RNA對(duì)基因表達(dá)的阻斷作用被稱為RNA干預(yù)(RNA interference，RNAi)，雙鏈RNA經(jīng)酶切后會(huì)形成很多小片段，即為siRNA，這些小片段一旦與信使RNA (mRNA)中的同源序列互補(bǔ)結(jié)合，會(huì)導(dǎo)致mRNA失去功能，即不能翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，也就是使基因“沉默” 了?，F(xiàn)在仍在不斷涌現(xiàn)新的小RNA。
[0005]由于小RNA與其他編碼蛋白的基因不同，所以它的檢測和定量方法很難套用普通基因的檢測模式。首先，由于小RNA非常短且沒有poly(A)修飾，所以無法按照普通引物的設(shè)計(jì)要求去選擇合適的位置設(shè)計(jì)合適Tm值的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；其次，小RNA比如microRNA的一些家族成員非常相似，往往只有一兩個(gè)堿基的差別，所以小RNA的檢測對(duì)特異性的要求也很高；此外，小RNA長度太短，不足以摻入足夠的SYBR Green進(jìn)行熒光定量檢測；綜合小RNA檢測的各方面特點(diǎn)，它的有效檢測與定量方法大致需要滿足以下要求:(I)高特異性，能夠區(qū)分單堿基差別的小RNA ； (2)高敏感性，能夠進(jìn)行熒光定量PCR檢測；(3)可用于定量分析各種類型小RNA的表達(dá)水平；(4)比較容易操作，不需要一些一般實(shí)驗(yàn)室很難具備的試劑和儀器；(5)低成本。
[0006]到目前為止，已有的小RNA檢測方法可以大致進(jìn)行如下歸類，基于小RNA捕獲手段來分，可以分為基于雜交的檢測技術(shù)、基于擴(kuò)增的檢測技術(shù)以及克隆檢測。雜交主要指Northern blots、原位雜交、基因芯片，擴(kuò)增方面主要指實(shí)時(shí)定量PCR和goldnanoparticle-1nitiated silver enhancement,克隆方面主要是類似于 miRAGE 的方法。這些方法中，Northern blots和原位雜交屬于低通量檢測方法，實(shí)時(shí)定量PCR和miRAGE通量中等，芯片技術(shù)為高通量檢測；并且熒光定量PCR和芯片技術(shù)屬于定量方法，Northernblots和原位雜交屬于半定量或者主要只用于檢測有無的方法。事實(shí)上，這些方法并非完美，各有固有的優(yōu)缺點(diǎn)，有的方法靈敏度和特異性不夠，有的方法成本過高。 [0007]大量的小RNA檢測技術(shù)不斷被開發(fā)出來，比如各種變化多樣的芯片，PCR技術(shù)，套索(padlock)和滾環(huán)復(fù)制方法，基于ELISA的分析技術(shù)，單分子檢測技術(shù)，基于SAGE的miRAGE技術(shù)，基于RNA引物的Klenow酶(RAKE)分析。第一個(gè)microRNA的發(fā)現(xiàn)就是通過Northern blots,到目前為止Northern blots仍然是小RNA檢測的黃金標(biāo)準(zhǔn)。但是Northern blots仍然具有劣勢，比如Northern blots使用同位素標(biāo)記使檢測非常敏感,但整個(gè)實(shí)驗(yàn)非常費(fèi)時(shí)。而且Northern blots不利于進(jìn)行大批量樣本以及多種小RNA的同時(shí)檢測。如果不使用昂貴的鎖核苷酸探針，Northern blots實(shí)驗(yàn)起始總RNA量約需要5_25 μ g。到目前為止，從已發(fā)表文章使用方法統(tǒng)計(jì)來看，使用最為廣泛的小RNA檢測和定量方法主要就是芯片技術(shù)和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)。在眾多的小RNA檢測方法中，芯片技術(shù)可以說是近乎完美的用于獲得小RNA表達(dá)譜的方法，因?yàn)槠渌姆椒ㄓ幸粋€(gè)共同的缺陷就是沒法進(jìn)行高通量全基因組分析。但芯片技術(shù)也有它固有的缺陷，首先芯片技術(shù)很難毫無偏倚的放大小RNA表達(dá)量信號(hào)，也就是說它的靈敏度不高；其次，芯片基于公司的研發(fā)，整個(gè)過程是需要時(shí)間的，而定制芯片的成本又非常高，所以芯片的方法不能用于新的小RNA以及其突變體的發(fā)現(xiàn)以及這些小RNA的檢測和定量。
[0008]所以，實(shí)時(shí)定量PCR雖沒有芯片那么高通量，但是確實(shí)是實(shí)驗(yàn)室最通用、最實(shí)用的檢測與定量方法。許多同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增和定量小RNA的qRT-PCR(quantitative real-timePCR)方法被推出，使用較多的是三種方法:
[0009]1.1nvitrogen 公司 Poly(A)加尾法:先在 microRNA 3’端加上 ploy (A),再用帶有adapter poly (T)引物作為逆轉(zhuǎn)錄引物獲得first strand cDNA,接著使用對(duì)應(yīng)adapter設(shè)計(jì)的通用正向引物以及microRNA特異反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。此方法成本較低，使用SYBRGreen染料即可,但僅由PCR步驟中的單條microRNA特異引物決定整個(gè)檢測方法的特異性，顯然不適用于相似度高的小RNA檢測。
[0010]2.ABI公司莖環(huán)法:采用帶有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的microRNA特異引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得first strand cDNA,同時(shí)由莖環(huán)結(jié)構(gòu)引入adapter,接著利用對(duì)應(yīng)adapter的通用正向引物、microRNA的特異反向引物并結(jié)合taqman探針進(jìn)行PCR反應(yīng)已經(jīng)突光定量檢測。此方法較Poly (A)加尾法檢測特異性有所提高，但是莖環(huán)引物設(shè)計(jì)方法復(fù)雜，Taqman探針成本頗聞。
[0011]3.Exiqon公司鎖核苷酸系統(tǒng):用帶有adapter的microRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物獲得first strand cDNA,接著用對(duì)應(yīng)adapter的通用正向引物以及帶有鎖核苷酸修飾的microRNA特異反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中鎖核苷酸修飾可以增加特異引物模版結(jié)合的穩(wěn)定性，提高引物Tm值。此方法在特異性方面有所改進(jìn)，也沒有莖環(huán)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的難度大，但是鎖核苷酸修飾成本高，并且可檢測的小RNA范圍局限于公司能夠提供的引物庫，這也是上面兩個(gè)方法共同的問題。
[0012]總的來說，上述方法的基本思路第一步一般都是延伸使小RNA被延長以適合進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，主要的延伸方法有使用頸環(huán)結(jié)構(gòu)的引物或者帶Oligo dT的引物，這些方法要么靈敏度不夠，要么需要使用taqman探針或者鎖核苷酸修飾，并且引物需要多次嘗試和檢驗(yàn)才能找到最佳的引物以及反應(yīng)條件，昂貴的探針或者修飾和費(fèi)時(shí)的引物條件摸索使這些方法多數(shù)商業(yè)化了，并且公司研發(fā)的速度有限，很難讓大家及時(shí)購買到新近發(fā)現(xiàn)的小RNA檢測試劑盒，更不可能通過購買產(chǎn)品去快速檢測自己發(fā)現(xiàn)的小RNA 了。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]本發(fā)明的目的在于提供一種新的小RNA的3’ -5’ -qPCR定量檢測技術(shù)。
[0014]在本發(fā)明的第一方面，提供一種檢測待測樣品中的特定小RNA的方法，所述方法包括:
[0015](I)從待測樣品中提取總RNA (含小RNA)；
[0016](2)以(I)的總RNA為模板，用小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得包含cDNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；其中，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA的3’端互補(bǔ)；所述的無關(guān)序列與待測樣品基因組中任何核酸序列不發(fā)生互補(bǔ)；
[0017](3)以⑵的包含cDNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以小RNA特異正向引物(對(duì)應(yīng)于小RNA的5’端或cDNA的3’端)和特異反向引物(對(duì)應(yīng)于小RNA的3’端)進(jìn)行3’ 一 5’ PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；所述的小RNA特異正向引物的5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端互補(bǔ)；所述的小RNA特異反向引物其可以是小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物，或是針對(duì)待測小RNA特異性設(shè)計(jì)的引物；
[0018](4)分析(3)的PCR產(chǎn)物，獲得小RNA的存在情況及存在量。
[0019]在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的小RNA特異反向引物可以是小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的無關(guān)序列長度10_60bp ;較佳地15_50bp ;更佳地18-30bp ;較佳地，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端無關(guān)序列的核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示；所述的小RNA特異正向引物的5’端的無關(guān)序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所
/Jn ο
[0021]在另一優(yōu)選例中，調(diào)節(jié)所述的無關(guān)序列的GC含量，使小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物或小RNA特異正向引物的Tm值保持在60±3°C (較佳地60±2°C )左右，使引物適用于熒光定量PCR。
[0022]在另一優(yōu)選例中，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端5-9個(gè)(較佳地6_8個(gè))堿基與小RNA的3’端5-9個(gè)(較佳地6-8個(gè))堿基互補(bǔ)。
[0023]在另一優(yōu)選例中，所述的小RNA特異正向引物的3’端5-18個(gè)堿基(較佳地6_16個(gè))與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端5_18個(gè)堿基(較佳地6_16個(gè))互補(bǔ)。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品可以是動(dòng)物、植物、病毒等任何存在小RNA的生物；從樣本類型來看，所述的待測樣品可以是全血、血清、血漿、唾液、尿液、組織液原液、細(xì)
胞培養(yǎng)基等。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的小RNA包括10_50bp (或nt)的小RNA。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的待測樣品也可包含提純的短的DNA(如10_50bp或者nt的小DNA)。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的無關(guān)序列起到信號(hào)放大的作用。[0028]在另一優(yōu)選例中，當(dāng)多個(gè)特定小RNA之間存在兩個(gè)堿基以上的差異時(shí)，在一個(gè)系統(tǒng)中同時(shí)檢測多個(gè)特定小RNA。[0029]在另一優(yōu)選例中，小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物與小RNA特異反向引物序列相同。[0030]在另一優(yōu)選例中，利用3’末端存在錯(cuò)配時(shí)不能正確延伸的特點(diǎn)來區(qū)分小RNA的單喊基差異。[0031]在另一優(yōu)選例中，所述的3’ 一 5’PCR反應(yīng)是3’ 一 5’熒光定量PCR反應(yīng)；較佳地，采用SYBR熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR。[0032]在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測待測樣品中的特定小RNA的檢測試劑盒，包含以下組分:[0033](a)小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物，其5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA的3’端互補(bǔ)；[0034](b)小RNA特異正向引物，其5 ’端帶有無關(guān)序列，3 ’端與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端互補(bǔ)；[0035](C)小RNA特異反向引物。[0036]在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑或熒光定量PCR檢測試劑。[0037]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】[0038]圖1、本發(fā)明原理示意圖。[0039]圖2、Microarray檢測三種轉(zhuǎn)移潛能不同的細(xì)胞中microRNA的表達(dá)結(jié)果圖。[0040]圖3、qPCR驗(yàn)證圖2的microarray結(jié)果圖。[0041]圖4、比較大鼠胎鼠腦組織與腎臟組織let-7家族的表達(dá)結(jié)果圖。[0042]圖5、通過檢測僅有單堿基差別的合成的microRNA mimics來驗(yàn)證方法的特異性。
【具體實(shí)施方式】[0043]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，基于熒光定量PCR技術(shù)，提供了一種進(jìn)行從內(nèi)向外即3’一 5’PCR對(duì)小RNA進(jìn)行高特異性、高靈敏度以及低成本檢測和定量的方法，以及在此基礎(chǔ)上研發(fā)成的試劑盒。本發(fā)明可用于多種樣本類型中各種小RNA的表達(dá)量分析及臨床檢測。[0044]原理示意圖見說明書附圖一圖1。本發(fā)明所涉及的小RNA檢測方法，包括:提取總RNA(含小RNA)，用帶有無關(guān)序列的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化作用下合成cDNA ;然后，以帶有無關(guān)序列的小RNA特異正向引物和特異反向引物進(jìn)行從內(nèi)到外，從3’ 一 5’熒光定量PCR反應(yīng)，從而檢測小RNA的表達(dá)量。本發(fā)明的3’ -5’ -qPCR定量檢測技術(shù)，每一步PCR反應(yīng)，引物都是在模板的中間搭上，從3’到5’進(jìn)行擴(kuò)增，這樣就使得反應(yīng)非常的特異。[0045]應(yīng)用本發(fā)明的方法，檢測和定量結(jié)果特異性及準(zhǔn)確性高，這是由于每一步PCR反應(yīng)，引物都要進(jìn)行特異性識(shí)別。同時(shí)，無關(guān)序列不僅僅是為了平衡GC，而且是為了增加熒光定量PCR的時(shí)候的熒光強(qiáng)度，從而運(yùn)用低成本的、簡單的SYBR Green就能夠?qū)崿F(xiàn)。[0046]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的檢測方法通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):[0047]1.總RNA的提取
[0048]可以采用本領(lǐng)域常用的方法和試劑盒來進(jìn)行總RNA的提取。較佳地，所述的總RNA提取包括:A、樣品處理；B、RNA分離；C、RNA沉淀；D、RNA洗滌；E、RNA溶解；F、RNA濃度測定；G、RNA電泳檢測。
[0049]2.RNA的逆轉(zhuǎn)錄
[0050]以包含無關(guān)序列的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，如需同時(shí)檢測多種小RNA，可以同時(shí)加入幾種特異性的逆轉(zhuǎn)錄引物，從而擴(kuò)增從相應(yīng)小RNA的第一鏈cDNA，此步驟可使小RNA延長序列。延長的序列長度視無關(guān)序列的長度而定，作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的無關(guān)序列長度10-60bp ;較佳地15-50bp ;更佳地18-30bp。所述的無關(guān)序列起到信號(hào)放大的作用。作為本發(fā)明的更優(yōu)選方式，還通過調(diào)節(jié)所述的無關(guān)序列的GC含量，使小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物或小RNA特異正向引物的Tm值保持在60±3°C (較佳地60±2°C)左右，使引物適用于熒光定量PCR。
[0051]3.熒光定量PCR檢測
[0052]以包含有無關(guān)序列的小RNA的特異正向引物和反向引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測樣本中各種小RNA的含量。此步驟可以使小RNA進(jìn)一步延長，從而有利于實(shí)施小RNA熒光定量PCR檢測。此定量方法可以比較不同樣本中相同小RNA的表達(dá)量水平；如需比較不同小RNA在相同樣本的表達(dá)水平，則可以通過實(shí)驗(yàn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得不同小RNA引物的擴(kuò)增效率，從而進(jìn)行不同小RNA的表達(dá)量比較。
[0053]逆轉(zhuǎn)錄階段以及PCR階段進(jìn)行兩次應(yīng)用無關(guān)序列來延長microRNA擴(kuò)增產(chǎn)物的長度，有利于進(jìn)行小RNA的PCR鑒定以及熒光定`量檢測。兩個(gè)階段可以應(yīng)用相同的無關(guān)序列或不同的無關(guān)序列；較佳地應(yīng)用不同的無關(guān)序列。通過特異逆轉(zhuǎn)錄引物在逆轉(zhuǎn)錄步驟即提高檢測的特異性。通過特異正向引物和特異反向引物在PCR步驟中的每一步提高檢測的特異性。
[0054]所述的PCR采用的是從外向里(3’ 一 5’ )延伸的方式，比傳統(tǒng)從里向外的延伸方
式特異性更高。
[0055]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，熒光定量PCR采用SYBR熒光染料，特異性地?fù)饺隓NA雙鏈發(fā)射熒光信號(hào)，可不需使用昂貴的TaqMan熒光探針或者鎖核苷酸技術(shù)，大大降低實(shí)驗(yàn)成本。
[0056]基于本發(fā)明的新方法，本發(fā)明還涉及一種檢測待測樣品中的特定小RNA的檢測試劑盒，包含以下組分:(a)小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物，其5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA的3’端互補(bǔ)；(b)小RNA特異正向引物，其5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端互補(bǔ)；(c)小RNA特異反向引物，其可以是小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物，或是針對(duì)待測小RNA特異性設(shè)計(jì)的引物。較佳地，所述的試劑盒中還包括:所述的試劑盒中還包括:逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑或熒光定量PCR檢測試劑；更佳地還包括說明應(yīng)用上述試劑進(jìn)行小RNA檢測的使用說明書。
[0057]所述的試劑盒應(yīng)用于進(jìn)行小RNA檢測以及表達(dá)水平分析以用于基礎(chǔ)研究和/或臨床應(yīng)用。
[0058]本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于:
[0059]1.本發(fā)明的方法具有高度特異性，通過特異的逆轉(zhuǎn)錄引物、正向引物和反向引物從內(nèi)向外進(jìn)行PCR反應(yīng)，可以區(qū)分兩個(gè)甚至一個(gè)家族的高度同源的小RNA，甚至可以精確到區(qū)分單個(gè)堿基差異的小RNA ；
[0060]2.本發(fā)明的方法具有超高的定量線性范圍和高度的檢測靈敏度，檢測的范圍可以從幾個(gè)拷貝到幾萬個(gè)拷貝；
[0061]3.樣品消耗少，10pg-5 μ g的總RNA均適合實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，如果是提取的小RNA，則需要的RNA量則更少；
[0062]4.使用范圍廣，各種生物中提取的總RNA、細(xì)胞裂解物、細(xì)胞培養(yǎng)上清中的RNA都可作為樣本用于小RNA的定量檢測；
[0063]5.平臺(tái)簡單，價(jià)格實(shí)惠，整個(gè)檢測過程所涉及到的試劑、耗材以及儀器均屬于實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配置，試劑、引物等價(jià)格均不昂貴。
[0064]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計(jì)算。
[0065]實(shí)施例1、RNA的提取
[0066]1、RNA 抽提
[0067](I)使用 mirVana? miRNA Isolation Kit 抽提
[0068]利用該試劑盒可以抽提總RNA(包括完整的小RNA)，也可以將小于200nt的小RNA單獨(dú)抽提出來?？傔^程參照試劑盒配套protocol。
[0069](2)使用 Trizol 抽提` RNA
[0070]常規(guī)的RNA抽提方法提取。
[0071]3、RNA 檢測
[0072](I)抽完 RNA 后首先拿 nanodrop 檢測 RNA 純度。DNA、RNA 的 A260/A280、A260/A230比值均需在2.0左右為最好，同時(shí)記錄好濃度。
[0073](2)跑膠鑒定RNA質(zhì)量。使用RNA專用上樣緩沖液跑膠，抽提較好的RNA可以看到明顯的兩條核糖體帶。
[0074](3)需反復(fù)使用的RNA建議分裝凍于_80°C。
[0075]4、RNA 除 DNA
[0076]為避免DNA的影響，需使用DNase I除去DNA。本發(fā)明使用Premega的試劑盒，并有自帶Protocol,實(shí)驗(yàn)大致過程如下:
[0077](I)溶于水或者 TE 的 RNA 1- 8 μ I
[0078]RQl RNase-Free DNase 10Χ Reaction Buffer I μ I
[0079]RQl RNase-Free DNase Iu/μ g RNA
[0080]Nuclease-free 水加至 10 μ I
[0081](2)配好后在 37°C 放置 30min ；
[0082](3)加入 I μ I RQl DNase Stop Solution 終止上面的反應(yīng)；
[0083](4) 65 °C, IOmin 使 DNase 失活。
[0084]對(duì)于在總RNA中含量較少的小RNA，此步驟3、4替換成酚氯仿抽提，用IOul左右的RNase free的水稀釋，可獲得較濃縮的RNA，然后在后一步逆轉(zhuǎn)錄過程中，如果使用invitrogen的逆轉(zhuǎn)錄酶，可以進(jìn)行最多5ug的RNA的逆轉(zhuǎn)錄。
[0085]實(shí)施例2、逆轉(zhuǎn)錄
[0086]根據(jù)試劑盒(Invitrogen)配套protocol計(jì)算好自己要加入的RNA以及各種引物的體積。一般情況羅列如下:
[0087](l)micro RNA特異性引物(GSP (特異反轉(zhuǎn)錄引物))0.2 μ I/小RNA [0088]總RNA IOpg - 5 μ g ( —般 200ng 左右)
[0089]RNAase Free Water 補(bǔ)水至 13 μ I
[0090](2) 65°C進(jìn)行5min，立即放在冰上Imin
[0091](3)5X First-Strand Buffer 4 μ I
[0092]0.1M DTT I μ I
[0093]RNaseOUT I μ I
[0094]SuperScript? III RT I μ I
[0095](4)采用55°C進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄70°C ；
[0096](5) 15min 失活酶；
[0097](6) cDNA最好稀釋10倍以后再進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。
[0098]針對(duì)micro RNA特異性引物,本發(fā)明進(jìn)行了特殊設(shè)計(jì),如果經(jīng)過一次逆轉(zhuǎn)錄相同時(shí)檢測基因表達(dá)和特定的小RNA，可以在加入microRNA反轉(zhuǎn)錄引物的同時(shí)，再加上常規(guī)的random和oligod(T)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,這樣的cDNA在后面的Q-PCR步驟中，貝U可以檢測樣品中小RNA的表達(dá)，同時(shí)能檢測其他普通基因的表達(dá)。
[0099]如果需同時(shí)在一管逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中檢測2種或以上小RNA，并且這些小RNA的相似度不高，則可以在此步驟逆轉(zhuǎn)錄中，加入針對(duì)多個(gè)小RNA的特異性引物。
[0100]實(shí)施例3、PCR反應(yīng)
[0101]用小RNA對(duì)應(yīng)的正向引物、反向引物進(jìn)行PCR反應(yīng)。其中反向引物可以與microRNA特異性引物相同。但如果用于區(qū)別類似let-7家族那種，只有少數(shù)堿基差別的小RNA，則逆轉(zhuǎn)錄引物與PCR的反向引物也不同。通過各自不同的逆轉(zhuǎn)錄引物、正向引物、反向引物來達(dá)到區(qū)分少量堿基差別的小RNA。
[0102]主要以sybrgreen qPCR操作為例,普通PCR操作類似qRNA。
[0103](I)在PCR管中混合下面試劑。對(duì)于多個(gè)反應(yīng)，強(qiáng)烈建議減少移液誤差。
[0104]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測待測樣品中的特定小RNA的方法，其特征在于:所述方法包括: (1)從待測樣品中提取總RNA； (2)以(I)的總RNA為模板，用小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得包含cDNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；其中，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA的3’端互補(bǔ)；所述的無關(guān)序列與待測樣品基因組中任何核酸序列不發(fā)生互補(bǔ)； (3)以⑵的包含cDNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，以小RNA特異正向引物和特異反向引物進(jìn)行3 ’ 一 5 ’ PCR反應(yīng)，獲得PCR產(chǎn)物；所述的小RNA特異正向引物的5 ’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端互補(bǔ)； (4)分析(3)的PCR產(chǎn)物，獲得小RNA的存在情況及存在量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的無關(guān)序列長度10-60bp;較佳地15-50bp ;更佳地18-30bp ;較佳地，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的5’端無關(guān)序列的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示；所述的小RNA特異正向引物的5’端的無關(guān)序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:2 所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，調(diào)節(jié)所述的無關(guān)序列的GC含量，使小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物或小RNA特異正向引物的Tm值保持在60 ± 3 °C左右，使引物適用于熒光定量PCR。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物的3’端5-9個(gè)堿基與小RNA的3’端5-9個(gè)堿基互補(bǔ)。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的小RNA特異正向引物的3’端5-18個(gè)堿基與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端5_18個(gè)堿基互補(bǔ)。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，當(dāng)多個(gè)特定小RNA之間存在兩個(gè)堿基以上的差異時(shí)，在一個(gè)系統(tǒng)中同時(shí)檢測多個(gè)特定小RNA。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物與小RNA特異反向引物序列相同。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，利用3’末端存在錯(cuò)配時(shí)不能正確延伸的特點(diǎn)來區(qū)分小RNA的單堿基差異。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3’一 5’ PCR反應(yīng)是3’ 一 5’熒光定量PCR反應(yīng)；較佳地，采用SYBR熒光染料進(jìn)行熒光定量PCR。
10.一種檢測待測樣品中的特定小RNA的檢測試劑盒，其特征在于，包含以下組分: (a)小RNA特異逆轉(zhuǎn)錄引物，其5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA的3’端互補(bǔ)； (b)小RNA特異正向引物，其5’端帶有無關(guān)序列，3’端與小RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA的3’端互補(bǔ)； (c)小RNA特異反向引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103555848SQ201310553552
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】于文強(qiáng), 肖敏, 趙麗萍 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)