免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開包括生物活性分子和連接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。該Fc結(jié)構(gòu)域是(i)IgG1、IgG2或IgG4，或(ii)IgG4和IgD的雜交人Fc結(jié)構(gòu)域。該雜交Fc用作生物活性分子的載體。
【專利說(shuō)明】免疫球蛋白融合蛋白
本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2008年5月30日、申請(qǐng)?zhí)枮?00880016313.9、題為“免疫球蛋白融合蛋白”的專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)?！炯夹g(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及雜交人Fe和免疫球蛋白融合蛋白，在其中雜交人Fe連接到生物活性分子。具體地，它涉及雜交人Fe，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亞類的組合或人IgD和IgG的組合；以及融合蛋白，在其中這種Fe經(jīng)共價(jià)鍵偶聯(lián)到生物活性分子。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]生物活性分子在治療上可以具有很大的優(yōu)勢(shì)。但是，它們作為治療劑可能具有缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈兙哂休^低的體內(nèi)穩(wěn)定性。它們具有較短的循環(huán)半衰期或血清半衰期，因?yàn)樗鼈儽换铙w內(nèi)各種酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循環(huán)半衰期。
[0004]已知:增加蛋白質(zhì)大小，通過(guò)阻止經(jīng)腎去除蛋白質(zhì)可以增加它的半衰期(Knauf等，J.Biol.Chem.1988.263 =15064-15070)。例如，已經(jīng)報(bào)道通過(guò)將活性蛋白偶聯(lián)到人白蛋白可增加蛋白質(zhì)穩(wěn)定性(Kinstler等,Pharm.Res.1995.12:1883-1888)。但是，由于活性蛋白至人白蛋白的偶聯(lián)只是略微增加它的滯留期，因此發(fā)展含有偶聯(lián)到人白蛋白的活性蛋白的有效藥物制劑不是有效方法。
[0005]其它報(bào)道的方法是調(diào)整蛋白質(zhì)的糖基化。在蛋白質(zhì)上增加糖基化和將唾液酸引入蛋白質(zhì)可防止肝中蛋白質(zhì)的降解。但是，蛋白質(zhì)糖基化的增加也導(dǎo)致了蛋白質(zhì)活性的降低。
[0006]為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)和防止經(jīng)腎的清除，將蛋白質(zhì)連接到聚乙二醇(PEG)。共價(jià)連接到PEG已經(jīng)被廣泛使用以遞送具有延長(zhǎng)的半衰期的藥物(Delgado等，1992.9 =249-304)。但是，已經(jīng)報(bào)道PEG連接到細(xì)胞因子或激素導(dǎo)致受體結(jié)合親和力的降低，原因在于該連接所引起的位阻。
[0007]最近，已經(jīng)研究和發(fā)展了使用免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)制備的融合蛋白。Ig是血液的主要成分。A Ig (human Ig’hlg)包括不同種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE (Roitt 等，“Immunology，，1989, Gower Medical Publishing, London, U.K.；New York,N.Y)。人IgGs可以進(jìn)一步分為各種亞型，其已知為人IgGl (hlgGl)、人IgG2 (hIgG2)、人IgG3 (hIgG3)和人 IgG4 (hIgG4)。
[0008]免疫球蛋白由四條多肽鏈組成，兩條重鏈和兩條輕鏈，它們經(jīng)過(guò)二硫鍵形成四聚體。每條鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。基于同種型(isotypes)，重鏈的恒定區(qū)進(jìn)一步地分成三個(gè)或四個(gè)區(qū)(CH1、CH2、CH3和CH4)?；贗g同種型，重鏈恒定區(qū)的Fe部分包括鉸合部、CH2、CH3和/或CH4結(jié)構(gòu)域。
[0009]關(guān)于血清半衰期，IgGl、IgG2和IgG4具有21天的長(zhǎng)半衰期，而其它免疫球蛋白具有小于一周的相對(duì)短的半衰期。融合到IgG的Fe部分的嵌合蛋白質(zhì)顯示增加的穩(wěn)定性和增加的血清半衰期(Capon等，Nature 1989.337:525-531)。生物活性蛋白已融合在CHl區(qū)域的N-端、Fe區(qū)域的N-端或IgG CH3區(qū)域的C-端。
[0010]在開始期，用細(xì)胞表面受體例如CD4(Capon等，Nature 1989.337:525-531)、TNFR (Mohler 等，J.1mmunology 1993.151: 1548-1561)、CTLA4 (Linsley 等，J.Exp.Med.1991.173:721-730)、CD86 (Morton 等，J.1mmunologyl996.156:1047-1054)的胞外結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生IgG融合蛋白。同時(shí)，存在幾種已融合到IgG結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞因子和生長(zhǎng)激素。但是，與用細(xì)胞表面受體的胞外結(jié)構(gòu)域的融合不同，與非融合細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子相比，用可溶性蛋白質(zhì)融合到IgG導(dǎo)致生物活性的降低。嵌合蛋白質(zhì)作為二聚體存在，其導(dǎo)致由于與它們的靶分子類似受體的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的兩種活性蛋白質(zhì)的存在。因此，這個(gè)問(wèn)題應(yīng)該被克服以產(chǎn)生有效的融合蛋白。
[0011]Fe融合技術(shù)的其它限制是存在不期望的免疫反應(yīng)。免疫球蛋白的Fe結(jié)構(gòu)域同時(shí)具有效應(yīng)子功能例如抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒反應(yīng)(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity, ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒(complement-dependentcytotoxicity,⑶C)。這種效應(yīng)子功能一般經(jīng)過(guò)Ig的Fe區(qū)域與在效應(yīng)細(xì)胞上FcRs的相互作用或經(jīng)過(guò)補(bǔ)體結(jié)合取得。因此，應(yīng)該進(jìn)行Fe的效應(yīng)子功能的阻斷以減少不期望的反應(yīng)例如細(xì)胞殺死、細(xì)胞因子釋放或炎癥。
[0012]發(fā)明公開 技術(shù)問(wèn)題
[0013]總的說(shuō)來(lái)，有對(duì)具有生物活性的最小損失和具有不期望的免疫反應(yīng)的最小風(fēng)險(xiǎn)的改良Fe融合蛋白的需求。
[0014]
技術(shù)方案
[0015]本發(fā)明提供雜交Fe (雜合Fe)，其源于人IgG亞類的組合或人IgD和IgG的組合。當(dāng)雜交Fe連接到生物活性分子時(shí)，雜交Fe有效增加了生物活性分子的血清半衰期，以及當(dāng)編碼Fe-多肽融合蛋白的核苷酸被表達(dá)時(shí)，增加了多肽的表達(dá)水平。
[0016]本發(fā)明同時(shí)提供在其中雜交Fe連接到生物活性分子的雜交Fe融合多肽。該融合蛋白有時(shí)稱為“生物活性分子-Fe融合蛋白”或簡(jiǎn)稱為“融合蛋白”。該融合蛋白可以具有Fe和生物活性分子之間的連接體。Fe可以在其N-端偶聯(lián)到生物活性分子的C-端。
[0017]可通過(guò)如下步驟產(chǎn)生融合蛋白:構(gòu)建編碼和能夠表達(dá)融合蛋白的核苷酸；在宿主細(xì)胞中表達(dá)它；和收獲融合蛋白?？蛇x地，該融合蛋白可以通過(guò)表達(dá)編碼Fe的核苷酸，并以常規(guī)方式將它連接到生物活性分子而產(chǎn)生。
[0018]根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式的多肽可以用下式表示:
[0019]N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/
[0020]其中N'是多妝的N-端和C'是多妝的C-端；
[0021]Zl表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[0022]Y表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[0023]Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基的至少N-端部分或在SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基的至少一部分；[0024]Z3表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的118-223、SEQ ID N0:12的114-219,SEQ ID NO:24的165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸殘基的至少C-端部分；
[0025]Z4表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的224-330、SEQ ID NO: 12的220-326,SEQ ID NO:24的271-377或SEQ ID NO:13的221-327位置的氨基酸殘基的至少N-端部分以及
[0026]P是O或I的整數(shù)，
[0027]其中Z2和Z3氨基酸殘基總數(shù)是在80和140之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。
[0028]Zl可以是氨基酸序列，其包括來(lái)自于SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸殘基C-端側(cè)的5到9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或者來(lái)自于SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸殘基C-端側(cè)的5-9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，Zl可以是IgGlCHl結(jié)構(gòu)域(SEQID NO:11)或IgD CHl結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:14)的5、6、7、8或9個(gè)C-端氨基酸殘基。
[0029]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸殘基。Zl可以是由SEQ ID N0:11的90-98的位置或SEQ ID NO:14的90-98的位置5到9個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO: 11的90到98氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的90到98的氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0030]Y可以是氨基酸序列，其包括來(lái)自于SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的C-端側(cè)的5個(gè)或更多個(gè)、或 10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或來(lái)自于SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸殘基C-端側(cè)的10個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的153到162位置的氨基酸殘基、SEQIDNO:14的143到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基。
[0031]Z2可以是氨基酸序列，其包括來(lái)自于SEQ ID NO:12 (hIgG2)的111到147位置的氨基酸殘基的N-端側(cè)的4到37個(gè)或6-30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，或來(lái)自于SEQ ID NO:14(hIgD)的163到199位置的氨基酸殘基的N-端側(cè)的6_30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，Z2可以是人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的6個(gè)N-端氨基酸殘基或人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的8
個(gè)N-端氨基酸殘基。
[0032]Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是80和140之間。在一個(gè)實(shí)施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是90和120之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是105和115之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)是108。在更一個(gè)實(shí)施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)是109。
[0033]Z4可以是氨基酸序列，其包括來(lái)自于SEQ ID NO:11 (hlgGl)的224-330、SEQ IDNO:12(hIgG2)的 220-326、SEQ ID NO:24(hIgG3)的 271-377 或 SEQ ID NO:13(hIgG4)的221到327位置的氨基酸殘基的90或更多個(gè)、或100或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。Z4可以是SEQ ID NO:11 的 224-330,SEQ ID NO:12 的 220-326,SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ IDNO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0034]根據(jù)實(shí)施方式，Z3-Z4是選自以下的氨基酸序列:⑴由SEQ ID NO: 11的118到223位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:12的220到326位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列。
[0035]根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，多肽的氨基酸殘基總數(shù)是從154到288。
[0036]在一個(gè)實(shí)施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的99-113位置的氨基酸殘基的至少一部分，P可以是O或I ;Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID N0:12的111-147位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114-219、SEQ IDNO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在這個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)P是I時(shí)，Zl可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0037]在進(jìn)一 步的實(shí)施方式中，Z3可以是SEQ ID NO: 11的118-223、SEQ ID NO:12的
114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115-220 位置的 73 到 106 個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，并且Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是110。Z2可以是SEQ ID NO: 12的111-116位置的氨基酸殘基，和Z3可以是SEQ ID NO:11的120-223、SEQ ID NO:12的116_219、SEQID NO:24的167-270或SEQ ID NO:13的118到220位置的氨基酸序列。
[0038]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分，P可以是I或0(零):Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:14的163-199位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQID NO:13的121到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在這個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)P是I時(shí)，Zl可以氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:14的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0039]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Y可以是SEQ ID NO:14的99-162位置的氨基酸殘基的C-端側(cè)的20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、或60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)。Z2可以是SEQ ID NO: 14的163到170位置的氨基酸殘基，Z3可以包括SEQ ID NO:11的124-223、SEQ ID NO:12 的 120-219、SEQ ID NO:24 的 171-270 或 SEQ ID NO:13 的 121-220 位置的氨基酸殘基的C 一端側(cè)的71-100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是108。
[0040]在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽可以由選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 和 SEQ IDNO:27 的核苷酸序列編碼。多肽是選自 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29 的氨基酸序列。
[0041]在一個(gè)實(shí)施方式中，多肽在它的N-端與生物活性分子融合，與所述生物活性分子的天然形式(native form)的循環(huán)半衰期比較,該生物活性分子顯示增加的循環(huán)半衰期。該生物活性分子可以是多肽、蛋白質(zhì)或非肽(apeptide)。該生物活性分子可以是多肽、肽或蛋白質(zhì)藥物。生物活性分子可以是可溶性蛋白質(zhì)，例如但不限于:激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、共刺激分子、激素受體、細(xì)胞因子受體、生長(zhǎng)因子受體或短肽。該生物活性分子可以是EPO或它的變體/片段、p40或它的變體/片段(例如，含有Asn303Gln置換的p40變體)、G-CSF 或它的變體 / 片段、TNF 受體、GM-CSF、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-10 受體、TGF-β 'TGF-β 受體、IL-17、IL-17 受體、因子 VI1、CXCL_11、FSH、人生長(zhǎng)激素、骨形態(tài)生成蛋白-1 (bone morphogenetic protein-1, BMP-1)、CTLA4、Η)_1、GLP-1> β 動(dòng)物纖維素(betacellulin)、OPG、RNAK、α 干擾素(interferon-alpha)、β 干擾素(interferon-beta)或它們的變體/片段。該生物活性分子可以是分泌性蛋白，其可以是成熟的形式。
[0042]在一個(gè)實(shí)施方式中，提供產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1的多肽的方法，其中該方法包括以下步驟:(i)將編碼所述多肽的DNA分子引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，(ii)將細(xì)胞在其培養(yǎng)基中在所述多肽可以被表達(dá)的條件下生長(zhǎng)；和(iii)收獲表達(dá)的多肽。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞可以是CHO、COS或BHK細(xì)胞。
[0043]在另一個(gè)實(shí)施方式中，提供以下方法:(i)減少自身免疫性疾病的癥狀、預(yù)防或治療自身免疫性疾病，(?)抑制移植排斥，或(iii)治療或預(yù)防內(nèi)毒素誘導(dǎo)的休克，其包括施用治療有效量的以上所述多肽，其中該多肽融合到生物活性分子。
[0044]在一個(gè)實(shí)施方式中，提供分離的核酸分子，其編碼根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的多肽。多肽可以具有選自以下的氨基酸序列:SEQ IDNO:18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29。核酸分子可以具有以下序列中顯示的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:27。核酸分子可以進(jìn)一步地包括信號(hào)序列或前導(dǎo)序列。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，提供包括所述核酸分子的表達(dá)載體和含有所述載體的宿主細(xì)胞。表達(dá)載體的例子包括但不限于pADllEP0-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp40N303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADllp40N303Q-hFc_6、pADllEP0-hFc-5、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc_5 和 pADllTNFR-hFc-5。
`[0046]在一個(gè)實(shí)施方式中，提供向哺乳動(dòng)物遞送生物活性分子的方法，其包括向需要其的哺乳動(dòng)物施用核酸分子的步驟。
[0047]在另一個(gè)實(shí)施方式中，多肽包括在N-端到C-端方向由鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域組成的Fe結(jié)構(gòu)域，其中所述鉸鏈區(qū)包括人IgD鉸鏈區(qū)或人IgGl鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基的至少一部分；所述CH2結(jié)構(gòu)域包括人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的N-端的4-37個(gè)連續(xù)氨基酸殘基用人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的N-端部分或人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端部分的氨基酸殘基的至少一部分置換，和所述CH3結(jié)構(gòu)域包括人IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少一部分。
[0048]鉸鏈區(qū)可以包括人IgGl的鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基的至少一部分，所述CH2結(jié)構(gòu)域包括人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的N-端的4_37個(gè)連續(xù)氨基酸殘基用人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)的氨基酸殘基的至少一部分置換。
[0049]鉸鏈區(qū)可以包括人IgD的鉸鏈區(qū)的氨基酸殘基的至少一部分，所述CH2結(jié)構(gòu)域包括人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的N-端的4_37個(gè)連續(xù)氨基酸殘基用人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)的氨基酸殘基的至少一部分置換。[0050]多肽可以進(jìn)一步包括CHl結(jié)構(gòu)域，其中所述CHl結(jié)構(gòu)域包括人IgGlCHl結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基的至少一部分，并且其中所述CHl結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)到所述鉸鏈區(qū)的N-端。多肽可以進(jìn)一步包括CHl結(jié)構(gòu)域，其中所述CHl結(jié)構(gòu)域包括人IgDCHl結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基的至少一部分，并且其中所述CHl結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)到所述鉸鏈區(qū)的N-端。多肽可以進(jìn)一步包括偶聯(lián)到所述鉸鏈區(qū)的N-端的第二多肽，其中該第二多肽是生物活性的非免疫球蛋白多肽。多肽可以進(jìn)一步包括通過(guò)連接體偶聯(lián)到所述CHl結(jié)構(gòu)域的N-端或偶聯(lián)到所述CH4結(jié)構(gòu)域C-端的生物活性分子，其中所述生物活性分子不是免疫球蛋白多肽。多肽和生物活性分子可以經(jīng)連接體彼此連接。連接體分子是白蛋白連接體或合成的連接體。該白蛋白連接體包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 的氨基酸序列。該合成連接體可以是由Gly和Ser殘基組成的10到20個(gè)氨基酸殘基的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，這種 Gly-Ser 連接體是 GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:32)。
[0051]本發(fā)明也包括含有重組的Fe區(qū)的抗體分子，該重組的Fe區(qū)如上所述。
[0052]
附圖簡(jiǎn)述
[0053]圖1顯示雜交Fcs (hybrid Fcs,hFcs)的示意圖，其可以用作以“X”表示的生物活性分子的載體蛋白。
[0054]圖2 顯示 hFcs 的圖示，其中對(duì)源于 IgGl(SEQ ID NO:11)、IgG2 (SEQ ID:12)、IgG4(SEQ ID:13)和IgD(SEQ ID:14)的氨基酸位置進(jìn)行詳細(xì)描述。除非另有說(shuō)明，本申請(qǐng)全部多肽中氨基酸位 置的命名采用相同規(guī)則。
[0055]圖3顯示hFcs圖示，其中通過(guò)以“AL”表示的白蛋白連接體，在C-端每個(gè)hFc偶聯(lián)到以“X”表示的生物活性分子。
[0056]圖4顯示與連接體偶聯(lián)的hFcs的圖示，其中對(duì)源于人白蛋白(SEQ ID NO:25)的白蛋白連接體的氨基酸位置進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0057]圖5顯示hFc-6的疏水性分布(hydrophobicity plot)的結(jié)果。
[0058]圖6(a)顯示使用特異性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hIgGl、Enbre_(etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc_5 的 Fe y RI 結(jié)合活性結(jié)果；圖 6 (b)顯示使用特異性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hlgGU Enbrei? (etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc-5 的 Clq 結(jié)合活性結(jié)果。
[0059]圖7 (a)顯示在人F36E細(xì)胞系中與EPO生物活性相比較的EPO-1gGlFc、EPO-hFc-1、EP0-hFc-5、EP0-hFc-6 和Aranesp? (derbepoetin alfa)的生物活性結(jié)果；圖7(b)顯示在小鼠造血細(xì)胞系(NFS-60)中NeuIasla⑩(pegfiIgrastim)和 G-CSF-hFc-5 的體外生物活性結(jié)果；圖7 (c)顯示在人PBMCs中p40和p40N303Q-hFc-5的體外生物活性結(jié)果；圖7(d)顯示在鼠科L929細(xì)胞中Enbrcl? (etanercept)和TNFR_hFc_5的體外生物活性結(jié)果；和圖 7(e)顯示在人 WISH 細(xì)胞中 thFc-l-AL (O)-1FN-β 和 thFc-1-AL (3)-1FN-β 的體外生物活性結(jié)果。
[0060]圖8(a)顯示經(jīng)SC途徑(左圖)和IV途徑(右圖)向獼猴施用的Aranesp?(derbepoetin alfa)、EPO-hFc-l或EP0_hFc_5的體內(nèi)半衰期的結(jié)果；圖8(b)顯示經(jīng)皮下注射途徑(左圖)和靜脈注射途徑(右圖)向Sprague Dawley大鼠施用的j.mrOSTIM?(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的藥物動(dòng)力學(xué)的結(jié)果；圖8(c)顯示經(jīng)皮下注射途徑向獼猴施用的Enbrel⑩(etanercept)的藥物動(dòng)力學(xué)的結(jié)果;圖8(d)顯示經(jīng)皮下注射途徑向SpragueDawley大鼠施用的TNFR-hFc-5和Enbrel? (etanercept)的藥物動(dòng)力學(xué)的結(jié)果。
[0061]圖9(a)顯示經(jīng)皮下注射途徑(左上圖)和靜脈注射途徑(右下圖)向獼猴施用的Aranesp? (derbepoetin alfa)和EP0_hFc_5的體內(nèi)生物活性的結(jié)果，圖9(b)顯示經(jīng)皮下注射途徑(上圖)和靜脈注射途徑(下圖)向Sprague Dawley大鼠施用的LEUCOSTIM?(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的體內(nèi)生物活性的結(jié)果。
[0062]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳方式
[0063]本發(fā)明提供雜交人免疫球蛋白Fe片段，其從N-端到C-端包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，其中該鉸鏈區(qū)是人IgD鉸鏈區(qū)或人IgGl鉸鏈區(qū)的至少部分氨基酸序列；CH2結(jié)構(gòu)域是人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域，在CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)的4-37氨基酸殘基替代。當(dāng)被連接到生物活性分子，例如生物活性多肽的生物活性分子，用于產(chǎn)生Fe融合蛋白時(shí)，這種雜交Fe片段使Fe融合蛋白的非特異免疫反應(yīng)最小化，延長(zhǎng)生物活性多肽的生物活性分子的血清半衰期，并使生物活性多肽的生物活性分子的活性最優(yōu)化。
[0064]根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式中的Fe融合蛋白中，設(shè)計(jì)IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端與IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的剩余部分的組合，使得在兩個(gè)不同Ig亞基重組處產(chǎn)生的融合蛋白的區(qū)域是疏水性的。產(chǎn)生的融合蛋 白的疏水區(qū)應(yīng)位于折疊蛋白內(nèi)部，其最小化不期望的非特異免疫反應(yīng)。
[0065]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“Fe片段”或“Fe”是指蛋白質(zhì)，其含有免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)I (CHl)、重鏈恒定區(qū)2 (CH2)和重鏈恒定區(qū)3 (CH3)，并且不含有所述免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區(qū)以及輕鏈恒定區(qū)I (CLl)。它可以進(jìn)一步地包括在重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)。雜交Fe或雜交Fe片段在本文有時(shí)稱為“hFc”。
[0066]另外，本發(fā)明的Fe片段可以是以具有天然糖鏈、與天然糖鏈相比增加的糖鏈、與天然糖鏈相比減少的糖鏈的形式，或者可以是以去糖基化的形式。通過(guò)本領(lǐng)域常見方法，例如化學(xué)方法、酶學(xué)方法和使用微生物的基因工程方法，可以獲得免疫球蛋白Fe糖鏈的增加、減少或去除。從Fe片段去除糖鏈引起與第一補(bǔ)體成分Cl的Clq部分的結(jié)合親和力的銳減以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)的減少或喪失，因此不會(huì)誘導(dǎo)不必要的體內(nèi)免疫反應(yīng)。就這點(diǎn)而言，在一些情況下，去糖基化或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fe片段作為藥物載體可能更適合于本發(fā)明的目標(biāo)。
[0067]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“去糖基化”是指糖部分從Fe片段通過(guò)酶進(jìn)行去除，和術(shù)語(yǔ)“非糖基化”(aglycosylation)意思是通過(guò)原核生物、優(yōu)選地大腸桿菌產(chǎn)生未糖基化形式的Fe片段。
[0068]如本文所用，術(shù)語(yǔ)“雜交(雜合)”是指編碼不同來(lái)源的兩種或更多種免疫球蛋白Fe片段的序列是以單鏈免疫球蛋白Fe片段出現(xiàn)。
[0069]在一個(gè)實(shí)施方式中，雜交人Fe在N-端到C-端方向上包括鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，其中該鉸鏈區(qū)是人IgD鉸鏈區(qū)或人IgGl鉸鏈區(qū)的至少部分氨基酸序列；以及CH2結(jié)構(gòu)域是人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域，其在N-端區(qū)的一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)的4-37個(gè)氨基酸殘基替代。該雜交人Fe可以經(jīng)過(guò)共價(jià)鍵在它的N-端連接到生物活性分子的C-端。
[0070]在另一個(gè)實(shí)施方式中，生物活性分子-雜交Fe融合多肽可以用下式表示:
[0071]N' -X-(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/，或
[0072]N' - (Zl)ρ-Υ-Ζ2-Ζ3-Ζ4_(連接體 h-X-C'
[0073]其中N'是多肽的N-端和C'是多肽的C-端；Zl表示氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至少C-端部分，或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分，表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的至少C-端部分，或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；Z2表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基的至少N-端部分，或SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基的至少N-端部分；Z3表示氨基酸序列，其包括 SEQ ID NO:11 的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114_219、SEQ ID NO:24 的 165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸殘基的至少C-端部分；Z4表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:13的221-327位置的氨基酸殘基的至少N-端部分，并且P和q每個(gè)均是O或I的整數(shù)，其中Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是80和140之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)，連接體是連接體分子，以及X是感興趣的生物活性分子。
[0074]在一個(gè)實(shí)施方式中，Z3-Z4是選自以下的氨基酸序列:(i)由SEQ ID NO:11的118到223位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 12的220到326位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續(xù)氨基酸序列。
`[0075]根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方`式，所述多肽的氨基酸殘基總數(shù)是從154到288。
[0076]當(dāng)施用到目標(biāo)者時(shí)，與單獨(dú)的X相比較，式N' -X-(Zl) p-Y-Z2-Z3-Z4-C/和N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(連接體),-X-C'的多肽增加了生物活性分子X(jué)的循環(huán)半衰期。
[0077]連接體可以源于人白蛋白(CAA00606SEQ ID NO:25)。該連接體可以包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 位的氨基酸序列。可選地，連接體可以是合成的連接體。該合成連接體可以是由總共10-20個(gè)Gly和Ser氨基酸殘基組成的肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，該Gly-Ser連接體是GGGGSGGGGSGGGSG (SEQID NO:32)。
[0078]Zl 可以包括人 IgGl (SEQ ID NO: 11)或 IgD (SEQ ID NO:14)的 CHl 結(jié)構(gòu)域的至少一部分。Zl可以包括IgGlCHl結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)(SEQ ID NO:11的90-98的位置)或IgDCHl結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)(SEQ ID NO: 14的90-98的位置)的5到9或7到9個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在一些實(shí)施方式中，Zl可以是IgGl CHl結(jié)構(gòu)域或IgD CHl結(jié)構(gòu)域的5、6、7、8或9個(gè)
C-端氨基酸殘基。
[0079]在一些實(shí)施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90至98位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO: 14的90至98位置的氨基酸殘基。Zl可以是由SEQ ID Ν0:11的90至98的位置或SEQ ID NO: 14的90-98的位置的5到9個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO: 11的90到98氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的90到98的
氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0080]Y可以包括人IgGl或IgD的鉸鏈區(qū)的至少一部分。Y可以包括IgGl鉸鏈區(qū)(SEQID NO: 11的99到113位置的氨基酸)或IgD的鉸鏈區(qū)(SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸)的C-端的5個(gè)或更多個(gè)、或10個(gè)或更多個(gè)的連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的153到162位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的143到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基。
[0081]Z2可以包括人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的N-端(SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基)或IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基)的4到37、6到30、6到12、6到8、8或6個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。在某些實(shí)施方式中，Z2可以是人IgG2CH2結(jié)構(gòu)域的6個(gè)N-端氨基酸殘基(SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸殘基)或人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的8個(gè)N-端氨基酸殘基(SEQ ID NO:14的163-170位置的氨基酸殘基)。
[0082]Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是90和120之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)；或105和115之間，兩端數(shù)值包括在內(nèi)。
[0083]Z4可以是氨基酸序列，其包括IgG4CH3結(jié)構(gòu)域(在SEQ ID NO:11的224_330、SEQID NO:12 的 220-326、SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ ID NO:13 的 221 到 327 位置的氨基酸殘基)的90或更多個(gè)、或100或更多個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。Z4可以是大于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的98 %或95 %的氨基酸殘基。在一個(gè)示例性實(shí)施方式中，TA是包括人IgG CH3結(jié)構(gòu)域全部氨基酸序列的氨基酸序列。例如，Z4是人IgG4CH3結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，對(duì)應(yīng)于人IgG4的氨基酸殘基341-447，如根據(jù)EU Index, Kabat編號(hào)(其對(duì)應(yīng)于SEQID NO:13的221-327位置的氨基酸殘基)。
[0084]在一個(gè)實(shí)施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括人IgGl鉸鏈區(qū)的C-端氨基酸殘基(SEQ ID NO: 11的99到113位置)的至少一部分，p可以是I或O ;Z2可以是氨基酸序列，其包括人IgG2CH2的N-端區(qū)(氨基酸殘基在SEQ ID NO:12的111-147位置)的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括人IgG亞類任意一個(gè)的C-端區(qū)(氨基酸殘基在SEQ ID NO:11 的 118-223,SEQ ID NO:12 的 114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或 SEQ IDNO:13的115到220位置)的至少一部分。在該實(shí)施方式中，當(dāng)P是I時(shí)，Zl可以是包括人IgGlCHl結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)(SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO: 11的90到98位的氨基酸殘基。
[0085]在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，Z3可以是人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域(在SEQ ID N0:13的
115-220 位置)、人 IgGlCH2 結(jié)構(gòu)域(在 SEQ ID NO:11 的 118-223 位置)、人 IgG2CH2 結(jié)構(gòu)域(在 SEQ ID N0:12 的 114-219 位置)、人 IgG3CH2 結(jié)構(gòu)域(在 SEQ ID NO:24 的 165-270位置)的C-端區(qū)的73到106個(gè)連續(xù)氨基酸殘基，并且Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是110。例如，Z2可以是在SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸殘基的氨基酸序列，以及Z3可以是在SEQ ID NO: 13的117到220位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。[0086]在另一個(gè)實(shí)施方式中，Y可以是包括人IgD鉸鏈區(qū)的C-端區(qū)(SEQ ID NO:14的99至Ij 162位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列，P可以是I或0(零)；Z2可以是包括人IgD CH2結(jié)構(gòu)域的N-端區(qū)(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列，和Z3可以是包括人IgG4CH2結(jié)構(gòu)域的C-端區(qū)(SEQ ID NO:13的121到220位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Y可以是在SEQ IDNO:14的158到162、133到162、或99到162位置的氨基酸殘基，Z2可以是在SEQ ID NO:14的163到170位置的氨基酸殘基和Z3可以是在SEQ ID NO:13的121-220位置的氨基酸殘基。
[0087]在這個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)P是I時(shí)，Zl可以是包括人IgD CHl結(jié)構(gòu)域的C端區(qū)(氨基酸殘基在SEQ ID NO:14的90到98位置)的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO:14的90到98位的氨基酸殘基。
[0088]在這個(gè)實(shí)施方式中，Y可以是人IgD鉸鏈區(qū)的C-端側(cè)(氨基酸殘基在SEQ ID NO:14的99-162位置)的20個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、30個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、40個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、50個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)、或60個(gè)連續(xù)氨基酸殘基或更多個(gè)。Z3可以包括SEQ ID NO: 13的121-220位置的氨基酸殘基C-端側(cè)的71到100個(gè)連續(xù)氨基酸殘基。Z2和Z3的氨基酸殘基總數(shù)可以是108。
[0089]表1顯示在構(gòu)建根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式的hFcs中有用的人IgGl、IgG2、IgG3和IgD片段的氨基酸序列。
[0091]表 I
【權(quán)利要求】
1.由下式表示的多肽:
N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/ 其中N'是所述多肽的N-端和C'是所述多肽的C-端； Zl是氨基酸序列，其由在(i)SEQ ID N0:11或(ii)SEQ ID NO: 14的90到98位置的氨基酸殘基組成； Y是氨基酸序列，其由從在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的C-端的5至29個(gè)或31至64個(gè)連續(xù)氨基酸殘基組成； Z2是氨基酸序列，其由在SEQ ID NO:14的163到170位置的氨基酸殘基組成； Z3-Z4是氨基酸序列，其由在SEQ ID NO: 13的121到220位置的氨基酸殘基和在SEQID NO:13的221到327位置的氨基酸殘基的連續(xù)氨基酸序列組成；以及P是O或I的整數(shù)。
2.權(quán)利要求1所述的多肽，其中Y是氨基酸序列，其由在SEQID NO:14的158至162位置的氨基酸殘基，在SEQ ID NO: 14的153至162位置的氨基酸殘基，在SEQ ID NO: 14的143至162位置的氨基酸殘基，或在SEQ ID NO:14的99至162位置的氨基酸殘基組成。
3.根據(jù)前述權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有選自SEQID NO: 19, SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22 的氨基酸序列。
4.據(jù)前述權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述多肽由選自SEQID NO:2, SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO :6的核苷酸序列編碼。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求1所述的多肽，其中P是O。
6.嵌合多肽，其由權(quán)利要求1至5任意一項(xiàng)所述的多肽和生物活性多肽組成，其中所述生物活性多肽被融合到所述的多肽的N-端或C-端，并且其中所述生物活性多肽顯示與所述生物活性多肽的天然形式的循環(huán)半衰期相比增加的循環(huán)半衰期，并且所述生物活性多肽是 EPO、G-CSF, TNF 受體或 p40。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽是p40變體，所述p40變體包含Asn303Gln置換。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合多肽，其中: (a)所述生物活性多肽是分泌性蛋白，分泌性蛋白的成熟形式、或抗體的Fab區(qū)；和/或 (b)所述多肽和所述生物活性多肽經(jīng)由連接體例如白蛋白連接體或合成的連接體彼此偶聯(lián)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的嵌合多肽，其中: (a)所述白蛋白連接體由SEQID NO:25的321至323、318至325、316至328、313至330,311至333或306至338的氨基酸序列組成；或 (b)所述合成的連接體是由SEQID NO:32所示的肽。
10.編碼前述權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)多肽的核酸分子。
11.包括根據(jù)權(quán)利要求10所述核酸分子的表達(dá)載體。
12.產(chǎn)生根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項(xiàng)所述的多肽的方法，其中所述方法包括下列步驟:(i)將權(quán)利要求11的核酸分子引入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，(?)將所述細(xì)胞在其生長(zhǎng)培養(yǎng)基中在所述多肽可以被表達(dá)的條件下生長(zhǎng)；以及(iii)收獲所表達(dá)的多肽。
13.根據(jù)權(quán)利要求6所述的嵌合多肽在制備用于增加所述生物活性多肽的循環(huán)半衰期的藥物中的用途。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其中所述嵌合多肽經(jīng)靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、經(jīng)頰、舌下、經(jīng)鼻、腸胃外、直腸、陰道或經(jīng)由肺部途徑施用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK103626875SQ201310553839
【公開日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2008年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2007年5月30日
【發(fā)明者】成永喆, 梁世煥 申請(qǐng)人:浦項(xiàng)工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán), 格納西尼有限公司