美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽及其編碼序列和用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽、編碼該抗菌肽的多核苷酸以及該抗菌肽的用途。該抗菌肽是含有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。編碼該抗菌肽的多核苷酸是含有編碼SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列的核苷酸序列或者其互補序列。該抗菌肽對多種細菌有明顯的抑制作用，對大腸埃希氏菌（CMCC44102）、大腸埃希氏菌（ATCC25922）、鼠傷寒沙門菌（CMCC50115）的最小抑菌濃度（MIC）達到了62.5μg/mL。該抗菌肽可以用于制備如飼料添加劑、防腐劑、農(nóng)用生物防治劑、控制微生物感染的治療藥物組合物等。
【專利說明】美洲短吻鱷Cathe I icidi η-AM抗菌肽及其編碼序列和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及Cathelicidin抗菌肽家族的抗菌肽，尤其涉及一種美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽。此外,本發(fā)明還涉及編碼該抗菌肽的核苷酸序列以及該抗菌肽的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]由于抗生素的亂用與濫用，許多細菌產(chǎn)生了耐藥菌株，而新型抗生素的研發(fā)速度又不夠快，因此新抗生素研發(fā)與抗菌需求之間的矛盾日益突出。另外，抗生素在畜產(chǎn)品中的殘留問題也越來越引起人們的重視，它直接危害到了人類的健康?？咕莫毺氐目咕鷻C理為這一問題的解決提供了可能，因此極有希望被開發(fā)成為一類新型的高效抗菌藥物。
[0003]抗菌肽是存在于動物體內(nèi)的一類具有廣譜抗菌活性的多肽，也是先天免疫系統(tǒng)中重要的組成部分。到目前為止，人們已經(jīng)從哺乳動物、昆蟲及兩棲動物中發(fā)現(xiàn)了幾百種抗菌肽，并對其結(jié)構(gòu)、活性、作用機理等做了大量的研究，發(fā)現(xiàn)抗菌肽抗菌活性高，抗菌譜廣，作用機理與普通抗生素通過抑制蛋白的合成來達到殺菌效果的特點有很大的不同，它們是通過破壞細菌的細胞膜來致死細菌的，因此不易產(chǎn)生耐藥性。大多數(shù)的抗菌肽都具有以下特點:分子量小，熱穩(wěn)定性好，帶有正電荷，并且是兩性分子。根據(jù)抗菌肽的這些特征，人們將抗菌肽分成兩大類:defensins(防御素)和Cathelicidins。
[0004]Cathelicidin這一名詞從1995年開始被用來描述具有Cathelin和C端抗菌肽兩種結(jié)構(gòu)域的分子。由于Cathelicidin家族成員多種多樣,其抗菌機制不盡相同。它們對細菌、真菌、病毒和寄生蟲的感染都具有抵抗作用，要么直接殺死病原體，要么通過結(jié)合內(nèi)毒素而減輕因病原微生物感染引起的各種生物學(xué)效應(yīng)。其中最主要的機制之一是Cathelicidin能夠在病原體的質(zhì)膜表面形成跨膜離子通道,造成細胞內(nèi)容物的滲出從而導(dǎo)致細菌的死亡。Cathelicidin具有強大的結(jié)合細菌脂多糖(LPS)的能力。在與細菌胞漿膜磷脂分子吸附而結(jié)合在脂質(zhì)膜上之后，Cathelicidin分子聚集成團，其疏水端借助分子中柔性的連接結(jié)構(gòu)插入到質(zhì)膜中，而親水端指向膜的內(nèi)部以形成跨膜離子通道，能允許多種物質(zhì)包括疏水復(fù)合物、小分子通過。于是膜的完整性受到破壞，胞內(nèi)離子大量丟失，最終導(dǎo)致細菌的死亡。平面磷脂雙層的試驗表明:質(zhì)膜通透性的改變可能是由于通道的形成而導(dǎo)致的。具有ct螺旋結(jié)構(gòu)的Cathelicidin家族肽,能夠快速地滲入到敏感菌的質(zhì)膜中，從而改變其通透性，而在殺菌濃度下，內(nèi)膜的完整性被破壞，導(dǎo)致細胞呼吸顯著減少，細菌隨之死亡。除了抗菌活性以外，Cathelicidin還具有其他重要的生物學(xué)功能，包括促進創(chuàng)傷修復(fù)、作為化學(xué)引誘劑召集炎癥細胞到達炎癥部位、誘導(dǎo)血管生成、結(jié)合內(nèi)毒素以及誘導(dǎo)細胞溶解等。Cathelicidin的這些生物學(xué)效應(yīng)增強了宿主的防御機制,促使機體能夠從病原體感染中恢復(fù)過來。
[0005]中藥寶典《本草綱目》認為“鼉(即鱷)甲:主治心腹癥瘕；伏孥積聚；寒熱；女子小腹陰中相引痛、崩中下血五色及瘡疥死肌……肉:主治少氣吸吸，足不立地；別錄濕氣邪氣、諸蠱，腹內(nèi)癥瘕、惡瘡。 脂:主治摩風(fēng)及惡瘡……”。上述“癥瘕”和“積聚”主要指現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的卵巢癌和肝癌，“少氣吸吸”即為今天的咳嗽、哮喘?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)鱷魚制品具有明顯的醫(yī)藥保健功效。有研究發(fā)現(xiàn)灣鱷鱗甲提取物對小鼠的腫瘤有抑制作用。研究者用鱷魚、羅漢果和甘草按一定比例研制了鱷魚止咳膏，發(fā)現(xiàn)其對小鼠有明顯的鎮(zhèn)咳、祛痰、抗炎以及免疫調(diào)節(jié)作用。
[0006]為了能夠抵御外來壓力，在長期的演化過程中，鱷魚進化出了大量抗菌肽類物質(zhì)。目前發(fā)現(xiàn)的許多鱷魚抗菌肽對大腸桿菌、肺炎雙球菌等菌株具有一定的抑菌作用，但對哺乳動物正常的組織細胞不存在毒害作用，其作為抗生素類藥物的替代品，在臨床、食品以及飼料業(yè)具有很高的應(yīng)用價值。從鱷魚體中直接提取抗菌肽方法復(fù)雜，產(chǎn)量甚微；采用化學(xué)合成法制備抗菌肽成本太高，均無實際應(yīng)用的可能。因此利用基因重組技術(shù)在微生物中直接表達鱷魚抗菌肽便成為解決這一問題的出路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的一個目的在于提供一種美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽，本發(fā)明的另一目的在于提供一種編碼該抗菌肽的核苷酸序列以及該抗菌肽的用途。
[0008]一方面，本發(fā)明提供了一種美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽，其特征在于所述多肽選自下組:
[0009](a) SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽；
[0010](b) SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過修飾所得到的功能等同的多肽衍生物；
[0011](c)SEQ ID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加所形成的功能等同的衍生多肽。
[0012]第二方面，本發(fā)明提供了還一種多核苷酸，其特征在于所述多核苷酸的核苷酸序列選自下組:
[0013](a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸；
[0014](b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
[0015]優(yōu)選地，所述多核苷酸編碼SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽或其互補序列。
[0016]更優(yōu)選地，所述多核苷酸的序列選自下組的一種:
[0017](a) SEQ ID NO:1 中 17-139 位的序列；
[0018](b)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自多核苷酸序列(a)的序列；
[0019](c)多核苷酸序列(a)和(b)的互補序列。
[0020]第三方面，本發(fā)明還提供了還一種表達載體，其特征在于所述表達載體含有至少上述任意一種所述的多核苷酸。
[0021]第四方面，本發(fā)明還提供了一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞含有上述表達載體，或其基因組中整合有至少上述任意一種所述的多核苷酸。
[0022]優(yōu)選地，所述的遺傳工程化的宿主細胞是將權(quán)利要求5所述的表達載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌而得到的。
[0023]第五方面，本發(fā)明還提供了一種制備如上述美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽的方法，其特征在于所述多肽·通過固相化學(xué)法合成或通過基因重組方法生成，所述基因重組方法包括以下步驟:[0024]1)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，將權(quán)利要求5所述的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞；
[0025]2)篩選陽性克??；
[0026]3)誘導(dǎo)表達如權(quán)利要求1所述的抗菌肽；
[0027]4)回收條件培養(yǎng)基或細胞提取物，
[0028]5)從獲得的所述培養(yǎng)基或細胞提取物分離并純化所述多肽。
[0029]第六方面，本發(fā)明還提供了上述美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽在在制備飼料添加劑、防腐劑、農(nóng)用生物防治劑或控制微生物感染的治療藥物組合物中的用途。
[0030]第七方面，本發(fā)明還提供了一種用于控制微生物感染的治療藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物包括權(quán)利要求1所述的抗菌肽。
[0031]第八方面，本發(fā)明還提供了一種飼料添加劑，其特征在于所述飼料添加劑包括權(quán)利要求I所述的抗菌肽。
[0032]第九方面，本發(fā)明還提供了一種防腐劑，其特征在于所述防腐劑包括權(quán)利要求1所述的抗菌肽。
[0033]第十方面，本發(fā)明還提供了一種農(nóng)用生物防治劑，其特征在于所述農(nóng)用生物防治劑包括權(quán)利要求1所述的抗菌肽。
[0034]本發(fā)明的美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽具有抗菌活性，可以殺死細菌、真菌、病毒和原生動物。這些抗菌肽總體上對任何具有細胞膜或脂雙層膜組分的生物體有作用。該抗菌肽是可以應(yīng)用在人類和/或牲畜藥物、獸用或者作為農(nóng)業(yè)、食品及工業(yè)上試劑的有效化合物。
[0035]此外，本發(fā)明的抗菌肽及其多核苷酸序列還具有下列用途:
[0036]1.該Cathelicidin-AM抗菌肽與白蛋白偶聯(lián)后免疫動物，可以制備與Cathelicidin-AM抗菌肽特異性結(jié)合的抗體。該抗體可以用于檢測溶液中的抗菌肽的存在。
[0037]2.將SQ ID NO:1或者與其互補的多核苷酸(包括DNA或者RNA)，或者其片段，進行標記后，可以通過Southern、Northern、基因芯片等技術(shù),檢測動物基因組中的抗菌肽基因片段的存在，或者檢測抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄情況。
[0038]3.根據(jù)SQ ID NO:1或者與其互補的多核苷酸設(shè)計引物，可以通過反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測抗菌肽基因在動物體內(nèi)各組織中、不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄情況。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為美洲短吻鱷粘膜上皮組織總RNA電泳圖。
[0040]圖2為美洲短吻鱷粘膜上皮組織cDNA文庫重組質(zhì)粒的菌落PCR電泳圖。其中:M.DNA標記；1.空白對照；2-5.PCR目的條帶。
[0041]圖3為美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽基因的PCR電泳結(jié)果。其中:M.DNA標記；l-4.Cathelicidin-AM抗菌肽基因PCR條帶。
[0042]圖4為P43啟動子和nprB信號肽基因PCR電泳圖。其中:M.DNA標記；1_2.P43啟動子的條帶；3-4.nprB信號肽的條帶。
[0043]圖5為重疊延伸擴增和SOE融合電泳圖。其中:M.DNA標記；1.nprB和P43融合片段；2.P43-SP-CathAM 融合片段。
[0044]圖6為Cathelicidin-AM抗菌肽的重組表達質(zhì)粒pHY43N_cathAM構(gòu)建圖。[0045]圖7為pHY43N_cathAM的陽性克隆檢測電泳圖。其中:M.DNA標記；1.陽性克隆；
2.空白對照；3.陰性對照。
[0046]圖8為美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽重組表達產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。其中:1.蛋白質(zhì)標記；2.未加誘導(dǎo)的pHY43N-cathAM WB800菌體；3.加誘導(dǎo)的pHY43N_cathAMWB800菌體4.純化的Cathelicidin-ΑΜ抗菌妝。
[0047]圖9為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽離子交換分析純化圖。
[0048]圖10為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對大腸埃希氏菌的抑菌效果。
[0049]圖11為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對鼠傷寒沙門菌的抑菌效果。
[0050]圖12為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對C型產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌效果。
[0051]圖13為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對流感嗜血桿菌的抑菌效果。
[0052]圖14為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對副溶血性弧菌的抑菌效果。
[0053]圖15為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對空腸彎曲菌的抑菌效果。
[0054]圖16為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對金黃色葡萄球菌的抑菌效果。
[0055]圖17為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對單核細胞增生李斯特氏菌的抑菌效果。
[0056]圖18為美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽對肺炎鏈球菌的抑菌效果。
【具體實施方式】
[0057]本發(fā)明通過構(gòu)建美洲短吻鱷皮膚組織cDNA文庫，并通過測序和篩選，獲得了一種美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的cDNA。同時，通過人工合成方法(固相化學(xué)法)和基因重組方法，分別獲得了該抗菌肽cDNA所編碼的多肽片段。在本發(fā)明的實施方案中，該Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽多肽含有41個氨基酸，最優(yōu)選為含有SQ ID NO:2中I至41位的氨基酸序列。將該抗菌肽氨基酸序列經(jīng)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同Cathelicidin 成熟妝。
[0058]本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。在本發(fā)明中，術(shù)語“衍生物”是指基本上保持本發(fā)明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列)。這些衍生物和類似物屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的范圍。
[0059] 在本發(fā)明中，還包括具有與Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽相同功能的、SEQ ID N0.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):一個或多個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。變異形式還包括:同源序列、保守性變異體等。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含該Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽或其片段的融合蛋白。
[0060]本發(fā)明的多核苷酸可以是單鏈的或是雙鏈的。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO:1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。本發(fā)明的多核苷酸還包括編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列的互補序列，例如SEQ ID NO:1的互補序列SQ ID NO:3。
[0061]編碼美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的多核苷酸包括:只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
[0062]本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的類似物和衍生物。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，多核苷酸變異體是多核苷酸的替換形式，不會從實質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
[0063]本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或該抗菌肽編碼序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生本發(fā)明所述多肽的方法。
[0064]本發(fā)明中，美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術(shù)語“表達載體”指本領(lǐng)域熟知的細菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。
[0065]本發(fā)明中，宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，枯草芽孢桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。本發(fā)明的宿主細胞優(yōu)選為枯草芽孢桿菌，因為枯草芽孢桿菌通?？梢灾苯幼鳛轱暳咸砑觿?dāng)用枯草芽孢桿菌作為宿主細胞表達本發(fā)明的抗菌肽，且打算將該抗菌肽應(yīng)用于飼料添加劑時，不需要對該抗菌肽進行分離純化，可以直接將誘導(dǎo)表達后的枯草芽孢桿菌培養(yǎng)液作為飼料添加劑，里面含有辦發(fā)明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。
[0066]本發(fā)明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽可以通過常規(guī)的化學(xué)固相法合成，并將C端酰胺化。本發(fā)明優(yōu)選為通過常規(guī)的重組DNA技術(shù)表達出重組Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。一般來說有以下步驟:
[0067]I)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，將構(gòu)建好的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞；
[0068]2)篩選陽性克??；
[0069]3)誘導(dǎo)表達本發(fā)明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽抗菌肽；
[0070]4 )回收條件培養(yǎng)基或細胞提取物，
[0071]5)從獲得的所述培養(yǎng)基或細胞提取物分離并純化所述多肽。
[0072]本實施方案中的抗菌肽對多種革蘭氏陽性細菌及革蘭氏陰性細菌有很強的抑制作用(參見實施例五，表1)。在本實施方案中選取的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等菌種在本領(lǐng)域中被認為是革蘭氏陽性及陰性細菌的模式生物，因此對這些模型細菌的生物活性可以被認為是對整個革蘭氏陽性及陰性細菌家族的生物活性。因此，本發(fā)明的CatheIicidin-AM抗菌肽可以作為殺菌試劑或者抑菌試劑用來阻止傳染、殺死微生物或者抑制微生物生長及其它功能，并因此可以有效治療或者控制由這些微生物引起的感染或者造成的污染。該抗菌肽還可以被用于飼料添加劑、農(nóng)用生物防治劑等，增加畜產(chǎn)品對微生物的抵抗力，為畜產(chǎn)品提供了新的抗菌途徑，具有廣泛的應(yīng)用前景。
·[0073]同時，本發(fā)明的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽也可以做為治療藥物組合物,適合人類、牲畜、農(nóng)業(yè)及藥業(yè)使用，其包括本發(fā)明的抗菌肽中的一種或者多種以及藥物上可以接受的載體。這些藥物組合物可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的，進行配制和給藥例如口服、注射或外用給藥應(yīng)用以控制和/或抑制包括革蘭氏陽性及陰性細菌的寬范圍微生物的感染。
[0074]以下結(jié)合實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但實施例不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明的方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0075]實施例一:Cathelicidin_AM抗菌肽的固相化學(xué)合成法
[0076]根據(jù)編碼美洲短吻鱷Cathelicidin抗菌肽基因推斷出Cathelicidin-ΑΜ成熟肽氨基酸序列，按照標準固相肽合成程序人工合成該Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽。合成肽經(jīng)反相-高壓液相層析(RP-HPLC, Column:X Bridge 4.6X250mm)脫鹽、純化，采用乙臆 / 水 / 三氟乙酸系統(tǒng)洗脫(Pump A:0.07% trifluoroacetic in 100% water ;Pump B:0.05% trif luoroacetic in 100% acetonitrile),米用電噴霧質(zhì)譜(ES1-MS)測定其分子量。樣品純度>96%，其理論分子量為4546，實測分子量為4547.70，基本一致。將合成的Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽溶于滅菌雙蒸水,用于活性檢測。
[0077]實施例二:美洲短吻鱷Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽cDNA的獲取
[0078]本發(fā)明人用TaKaRa公司Smart? cDNA文庫構(gòu)建試劑盒,構(gòu)建了美洲短吻鱷皮膚組織cDNA文庫，通過隨機挑取克隆測序，并將測得序列用BLAST與國際基因庫(GenBank)中的序列進行比較，獲得了 Cathelicidin-ΑΜ抗菌肽的cDNA。
[0079]1.美洲短吻鱷粘膜上皮組織總RNA的提取
[0080]取美洲短吻鱷粘膜上皮組織于凍存管中，隨之將美洲短吻鱷釋放，凍存管置于液氣運回實驗室，存于液氣te中備用。
[0081]取粘膜上皮組織0.1g,液氮低溫研磨成粉末狀。加入2mL RNAiso Reagen室溫靜置至融化，再研磨至裂解液成透明狀。4°C、12000r/min離心5min。上清液中加入0.2mL氯仿，充分乳化溶液呈乳白狀后，于4°C、12000r/min離心15min，異丙醇沉淀，4°C、12000r/min離心IOmin收集沉淀。DEPC處理水配制的75%乙醇溶液洗漆。室溫干燥,RNase-free水溶解沉淀RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可以見到清晰的28S和18S兩條帶(電泳結(jié)果見圖1);以O(shè)D26Q/OD280比值鑒定總RNA的純度，其比值為1.95 ;_80°C保存。
[0082]2.第一鏈cDNA的合成
[0083](I) RNA 的熱變性:
[0084]總RNA (0.25 μ g/ μ L) 2 μ L
[0085]SMART IV 寡聚核酸2 μ L
[0086]CDS 111/3，PCR 引物 IyL
[0087]總體積5yL
[0088]將以上成分混勻，在離心機上甩一下，于65°C孵育變性5min，立即放于冰上。
[0089](2)反應(yīng)液配置:
[0090]
【權(quán)利要求】
1.一種美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽，其特征在于，所述多肽選自下組: (a)SEQ ID NO:2氨基酸序列的多肽； (b)SEQID NO:2氨基酸序列經(jīng)過修飾所得到的功能等同的多肽衍生物； (c)SEQID NO:2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加所形成的功能等同的衍生多妝。
2.一種多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的核苷酸序列選自下組: (a)編碼如權(quán)利要求1所述多肽的多核苷酸； (b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的多核苷酸，其特征在于:所述多核苷酸編碼SEQID N0:2所示氨基酸序列的多肽或其互補序列。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列選自下組的一種:
(a)SEQ ID NO:1 中 17-139 位的序列； (b)由于遺傳密碼的簡并性而衍生自多核苷酸序列(a)的序列； (C)多核苷酸序列(a)和(b)的互補序列。
5.—種表達載體,其特征在于:所述表達載體含有至少一種如權(quán)利要求2、3、4中任意一項所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于:所述宿主細胞含有權(quán)利要求5所述的表達載體，或其基因組中整合有至少一種如權(quán)利要求2、3、4中任意一項所述的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于:所述宿主細胞是將權(quán)利要求5所述的表達載體轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌而得到的。
8.一種制備如權(quán)利要求1所述的Cathelicidin-AM抗菌肽的方法,其特征在于:所述多肽通過固相化學(xué)法合成或通過基因重組方法生成，所述基因重組方法包括以下步驟: 1)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中，將權(quán)利要求5所述的表達載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞； 2)篩選陽性克?。? 3)誘導(dǎo)表達如權(quán)利要求1所述的抗菌肽； 4)回收條件培養(yǎng)基或細胞提取物， 5)從獲得的所述培養(yǎng)基或細胞提取物分離并純化所述多肽。
9.權(quán)利要求1所述的美洲短吻鱷Cathelicidin-AM抗菌肽在在制備飼料添加劑、防腐劑、農(nóng)用生物防治劑或控制微生物感染的治療藥物組合物中的用途。
10.一種用于控制微生物感染的治療藥物組合物，其特征在于:所述藥物組合物包括權(quán)利要求1所述的抗菌肽。
11.一種飼料添加劑，其特征在于:所述飼料添加劑包括權(quán)利要求1所述的抗菌肽。
【文檔編號】A23L3/3526GK103665137SQ201310553924
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】汪猜, 皮燦輝, 陳榮 申請人:廣州和仕康生物技術(shù)有限公司