傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法，其屬于檢測用病毒樣品及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體包括即先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經(jīng)特異性PCR方法及ELISA試驗(yàn)檢測，通過特異序列測定分析后，進(jìn)行病毒增殖和TCID50滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進(jìn)行定值即為成品。傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品成品為凍干粉末狀，1mL/支，安瓿瓶真空包裝，其為定性樣品，用于該病毒檢測的質(zhì)量控制、新方法研制等。對積極開展我國水生動(dòng)物及其產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制，添補(bǔ)該測量領(lǐng)域的空白，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。
【專利說明】傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測用病毒培養(yǎng)物標(biāo)準(zhǔn)品及其制備方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及IPNV標(biāo)準(zhǔn)樣品及其制備方法。【背景技術(shù)】
[0002]傳染性膜臟壞死病病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus, IPNV),為雙股核糖核酸類型，病毒顆粒呈六角形或近似圓形，20面體，直徑50-72納米，少數(shù)可大到75-110納米，有單層衣殼，沒有囊膜，有92個(gè)殼粒。對乙醚、氯仿等脂溶劑、胰酶及乙二胺四乙酸不敏感，對甘油也很穩(wěn)定，對熱和酸穩(wěn)定。可以在多種冷水性魚類的細(xì)胞株中增殖，并使細(xì)胞產(chǎn)生病變；而在溫水性魚類的細(xì)胞株中不增殖，也不出現(xiàn)細(xì)胞病變。敏感細(xì)胞接種病毒后，在15°C _25°C均能出現(xiàn)細(xì)胞病變，最適溫度為15-20°C。該病毒現(xiàn)有VR299、Sp、Ab、He等不同血清型。傳染性膜臟壞死病(Infectious Pancreatic Necrosis, IPN)是由傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)引起的危害極其嚴(yán)重的一種魚病，該病是世界性魚病，主要危害溪鱒、虹鱒、克氏鮭、紅克鮭、銀大馬哈魚、枇杷鱒、紅大馬哈魚等魚苗和幼魚。最早發(fā)生在加拿大、美國，后來在丹麥、法國、希臘、英國、德國、挪威、意大利、瑞典、日本等國發(fā)生流行，本世紀(jì)80年代又傳入朝鮮、我國臺灣省及東北、山西、山東、甘肅等養(yǎng)殖虹鱒地區(qū)。在我國山西省某虹鱒養(yǎng)殖場于1986年和1987年有過二次大流行，造成90%的虹鱒稚魚死亡，東北地區(qū)也有過流行。該病往往屬于急性流行，死亡率高達(dá)50% -100%，而20周齡以上的幼魚一般不發(fā)病。此病常在水溫10°C -15°C時(shí)流行，IO0C以下或15°C以上發(fā)病少，而且病情較輕，死亡率低。發(fā)病后殘存未死的，可數(shù)年以上用到終身成為帶毒者，并通過糞例、魚卵、精液排出病毒，繼續(xù)傳播。自80年代該病傳入我國以來，隨著進(jìn)出口貿(mào)易的急劇增加，IPNV已經(jīng)成為口岸水生動(dòng)物及其產(chǎn)品的檢疫對象。
[0003]實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制一直是人們關(guān)注的事情，傳染性胰臟壞死病已有國際或國內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)方法。然而標(biāo)準(zhǔn)方法的使用并不總能保證測試結(jié)果的良好的重復(fù)性，針對內(nèi)部質(zhì)量控制，許多實(shí)驗(yàn)室使用自己的標(biāo)準(zhǔn)樣品，這種樣品制備特別費(fèi)時(shí)，進(jìn)一步來講個(gè)體的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)樣品與不同的實(shí)驗(yàn)室結(jié)果的比對是不可能的。為了幫助實(shí)驗(yàn)室完成好的質(zhì)量保證，遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局從2005年就開始做這項(xiàng)工作。本標(biāo)準(zhǔn)樣品的研制成功，不僅為檢測研究、醫(yī)藥研究、應(yīng)用研究提供了標(biāo)準(zhǔn)樣品的需求，同時(shí)為檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)技術(shù)指導(dǎo)、服務(wù)出口企業(yè)提供技術(shù)上的支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的技術(shù)方案為，先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經(jīng)特異性PCR方法及ELISA試驗(yàn)檢測，通過特異序列測定分析后，進(jìn)行病毒增殖和TCID5tl滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進(jìn)行定值即為成品。
[0005]本發(fā)明所涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的來源是:遼寧地區(qū)實(shí)驗(yàn)室分離株，IPNV毒株由遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局的實(shí)驗(yàn)室分離保存，毒株名稱:IPNV-DL。(發(fā)表的相關(guān)文章:胡曉利，李偉，肇慧君，吳斌.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J].中國動(dòng)物檢疫，2012，29 (3):27-30)。
[0006]本發(fā)明為了完成本項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備工作，遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局成立了研制工作小組，IPNV標(biāo)準(zhǔn)樣品制備工藝流程見圖1。
[0007]本發(fā)明一方面涉及一種傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其步驟包括:
[0008]a.1PNV-DL毒株感染CHSE-214細(xì)胞獲得病毒增殖液；
[0009]b.將步驟a中獲得的病毒增殖液低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；
[0010]c.檢測步驟b中獲得的混合凍干粉樣品均勻性、穩(wěn)定性后定值并分裝。
[0011]本發(fā)明的上述技術(shù)方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，步驟a包括:將已長滿單層的CHSE-214細(xì)胞用0.05%胰酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，以I~2X IO6個(gè)細(xì)胞/細(xì)胞瓶分裝，待細(xì)胞長至培養(yǎng)單層80%面積時(shí)，倒掉含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，加入200 μ L步驟a中的感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液的上清液，20°C感作lh，再用無血清的M199培養(yǎng)基清洗兩次，覆蓋含1%甲基纖維素、2%血清的M199維持液；20°C低溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，反復(fù)凍融3次后，40C，lOOOOrpm，離心lOmin，得上清液即為IPNV-DL病毒增殖液；
[0012]本發(fā)明的上述技術(shù)方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其所述步驟b中低溫真空冷凍干燥凍干保護(hù)劑為:按蔗糖:去離子水的重量體積比為5%，脫脂奶粉:去離子水的重量體積比20%配制，108°C高壓滅菌15min。
[0013]本發(fā)明的上述技術(shù)方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其所述步驟b中低溫真空冷凍干燥條件:將IPNV-DL病毒增殖液經(jīng)6000rpm，離心IOmin去除細(xì)胞碎片后，保留上清液，在無菌操作條件下按1:1體積比和凍干保護(hù)劑混合，在_40°C冰柜中預(yù)凍24h，在設(shè)定的凍干條件進(jìn)行凍干，其中所述的設(shè)定的凍干條件為冷肼溫度為_80°C，真空度30mtorr，凍干時(shí)間24h ；
[0014]本發(fā)明的上述技術(shù)方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其所述步驟a中感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液為:用M199細(xì)胞培養(yǎng)液將感染IPNV-DL病毒的組織病料樣品勻漿、依次稀釋成1:10、1:100及1:1000三個(gè)稀釋度。
[0015]本發(fā)明的上述技術(shù)方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其所述步驟a中獲得病毒增殖液TCID5tl為10_8__5/0.lmL。
[0016]本發(fā)明另一方面涉及一種由上文所述方法制備的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品O
[0017]利于本發(fā)明上述技術(shù)方案所述方法制備傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品，即先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經(jīng)特異性PCR方法及ELISA試驗(yàn)檢測，通過特異序列測定分析后，進(jìn)行病毒增殖和TCID5tl滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進(jìn)行定值即為成品。傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品成品為凍干粉末狀，ImL/支，安瓿瓶真空包裝，其為定性樣品，用于該病毒檢測的質(zhì)量控制、新方法研制等。應(yīng)在生物安全I(xiàn)I級條件下，加入2mL超純水進(jìn)行水化，待樣品完全溶解后即可使用，用完之后立即放入-20°C冰箱保存。避光、-20°C條件貯存，室溫可存放30天。產(chǎn)品性質(zhì):乳白或淡黃色粉末。[0018]均勻性檢驗(yàn):在制備的標(biāo)準(zhǔn)樣品中隨機(jī)取8份樣品，每個(gè)樣品分為2個(gè)小樣，根據(jù)GB15805.1-2008傳染性胰臟壞死病病毒檢疫方法中的IPNV ELISA法，將測定結(jié)果進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示為無顯著性差異，即所測樣品是均勻的。
[0019]穩(wěn)定性檢驗(yàn):在兩種溫度類型條件下，對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)(GB15805.1-2008傳染性胰臟壞死病病毒檢疫方法中的IPNV ELISA法):一種是在貯存溫度(-200C )下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，隨機(jī)取24份樣品(樣品A和B)，每個(gè)月檢測2份，共計(jì)12個(gè)月；另一種是在較高的溫度(模擬樣品的運(yùn)輸條件4°C)下的穩(wěn)定性試驗(yàn)，樣品取24份，每I天檢測2份共計(jì)12天。將測定結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)，無顯著性差異即所測樣品是均勻的、穩(wěn)定的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.1PNV-DL標(biāo)準(zhǔn)樣品制備工藝流程。
[0021]圖2.1PNV-DL PCR擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出224bp大小的片段，與預(yù)期相符。1:DL2000Marker ;2~7 =PCR擴(kuò)增產(chǎn)物擴(kuò)增出224bp大小的片段；8:陰性對照。
[0022]圖3.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序后與GENBANK上公布的多株IPNV核苷酸序列進(jìn)行比對分析，序列比對結(jié)果顯示擴(kuò)增片段的核苷酸與多株IPNV序列同源性較高。
[0023]圖4.CHSE-214細(xì)胞隨感染IPNV-DL時(shí)間的增長細(xì)胞病變檢測圖；圖4a:正常 CHSE-214 細(xì)胞 100X ;圖 4b:CHSE-214 細(xì)胞 100X (接毒 48h)；圖 4c:CHSE_214 細(xì)胞100X(接毒72h);圖4d:CHSE-214細(xì)胞100X (接毒72h);從圖示結(jié)果分析可以證明:IPNV接種單層CHSE-214細(xì)胞48h后，細(xì)胞開始聚集、圓縮脫落，細(xì)胞病變結(jié)果如圖所示。結(jié)果顯示CHSE-214細(xì)胞隨感染IPNV時(shí)間的增長，細(xì)胞病變越加明顯。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下述非限制性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明中使用的傳染性胰臟壞死病病毒感染病料由本實(shí)驗(yàn)室保存(發(fā)表的相關(guān)文章:胡曉利，李偉，肇慧君，吳斌.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J].中國動(dòng)物檢疫，2012，29 (3):27-30)。M199培養(yǎng)基為美國Gibco公司產(chǎn)品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。PCR試劑 盒、蛋白酶K均購自大連TaKaRa有限公司；pMD18_T載體，宿主菌DH5 a、PCR試劑盒、分子量標(biāo)準(zhǔn)DL-2000、DNA快速純化回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均為TaKaRa公司產(chǎn)品；IPNV ELISA檢測試劑盒購自TEST-LINE Ltd ;氨芐青霉素(Amp)為上海生工公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純產(chǎn)品。CHSE-214細(xì)胞購自ATCC。
[0026]根據(jù)IPNV-DL的保守基因N基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，由寶生物公司合成，序列如表1，利用該特異性引物分別擴(kuò)增224bp大小的片段。引物終濃度均為20i!mOl/L。
[0027]表1檢測IPNV-DL的引物序列
[0028]
【權(quán)利要求】
1.一種傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，制備步驟包括: a.感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液接種CHSE-214細(xì)胞獲得病毒增殖液；步驟包括:將已長滿單層的CHSE-214細(xì)胞用0.05%胰酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，以I~2X IO6個(gè)細(xì)胞/細(xì)胞瓶分裝，待細(xì)胞長至培養(yǎng)單層80%面積時(shí)，倒掉含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，加入200 μ L步驟a中的感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液的上清液，20°C感作lh，再用無血清的M199培養(yǎng)基清洗兩次，覆蓋含1%甲基纖維素、2%血清的M199維持液；20°C低溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞病變達(dá)到80%時(shí)，反復(fù)凍融3次后，40C，lOOOOrpm，離心lOmin，得上清液即為IPNV-DL病毒增殖液； b.將步驟a中獲得的病毒增殖液低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；所述低溫真空冷凍干燥條件:將IPNV-DL病毒增殖液經(jīng)6000rpm，離心IOmin去除細(xì)胞碎片后，保留上清液，在無菌操作條件下按1:1體積比和凍干保護(hù)劑混合，在_40°C冰柜中預(yù)凍24h，在設(shè)定的凍干條件進(jìn)行凍干，其中所述的設(shè)定的凍干條件為冷肼溫度為_80°C，真空度30mton.，凍干時(shí)間24h ;所述凍干保護(hù)劑為:按蔗糖:去離子水的重量體積比為5%，脫脂奶粉:去離子水的重量體積比20%配制，108°C高壓滅菌15min ； c.檢測步驟b中獲得的混合凍干粉樣品均勻性、穩(wěn)定性后定值并分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，所述步驟a中感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液為:用M199細(xì)胞培養(yǎng)液將感染IPNV-DL病毒的組織病料樣品勻漿、依次稀釋成1:10、1:100及1:1000三個(gè)稀釋度。
3.根據(jù)權(quán)利要求1`所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備方法，其特征在于，所述步驟a中獲得病毒增殖液 TCID5tl 為 10_8…5/0.ImL0
4.由權(quán)利要求1所述的方法制備的傳染性胰臟壞死病病毒標(biāo)準(zhǔn)樣品。
【文檔編號】C12N7/00GK103614342SQ201310554941
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月7日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 胡強(qiáng), 宋立奇 申請人:吳斌, 肇慧君, 胡強(qiáng), 宋立奇