用于創(chuàng)傷弧菌的lamp-lfd檢測(cè)的引物和探針序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列，特點(diǎn)是包括三對(duì)LAMP的引物TolC-F3、TolC-B3、TolC-FIP、TolC-BIP、TolC-LF、TolC-LB和一條探針TolC--HP步驟，其中Van-FIP為5’端生物素標(biāo)記引物，探針TolC-HP為5’端異硫氰酸熒光素FITC標(biāo)記探針，具體序列如序列表中SEQNO1-NO7所示，優(yōu)點(diǎn)是具有更高的快捷性、特異性和靈敏度，儀器需求簡(jiǎn)單，有利于創(chuàng)傷弧菌的早期診斷和檢測(cè)，可滿足基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場(chǎng)疫源地檢測(cè)的需要。
【專利說(shuō)明】用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種創(chuàng)傷弧菌的引物和探針序列，尤其是涉及一種用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列。
【背景技術(shù)】
[0002]創(chuàng)傷弧菌{Vibrio vulnificus)為革蘭氏陰性嗜鹽弧菌，普遍存在于河口和海水環(huán)境中，魚類及貝母類等為主要易感水生動(dòng)物。同時(shí)，該菌是人獸共患病的重要病原，人通常是因?yàn)樯呈芪廴镜暮．a(chǎn)品，或者傷口接觸受污染的海水或海洋動(dòng)物而感染該細(xì)菌。細(xì)菌感染患者主要出現(xiàn)原發(fā)性敗血癥、創(chuàng)傷感染、急性胃腸炎和蜂窩織炎等臨床癥狀，其中引起的敗血癥性休克的死亡率可高達(dá)50%。在我國(guó)，創(chuàng)傷弧菌感染多發(fā)生于沿海地區(qū)，被列為食品污染源中八大高危微生物之一，對(duì)于該病的診斷和鑒別具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。創(chuàng)傷弧菌引起的最初癥狀并無(wú)明顯特異性，在感染早期完成診斷和鑒定顯得尤為重要。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便而又適用于臨床檢測(cè)的致病菌檢測(cè)方法具有極大的應(yīng)用價(jià)值。
[0003]傳統(tǒng)創(chuàng)傷弧菌鑒定主要通過(guò)病原分離與生化鑒定完成，但其存在細(xì)菌培養(yǎng)繁瑣，檢測(cè)周期長(zhǎng)，不易鑒別相近物種或亞型等缺點(diǎn)。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，以溶血素基因、DNA回旋酶B亞基(gyrB)、toxR基因、RNA聚合酶σ亞基因子S (rpoS)等基因?yàn)榘袠?biāo)建立的常規(guī)PCR或real-time PCR技術(shù)已成功應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的實(shí)驗(yàn)室診斷，具有靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，但該方法必須配備昂貴的儀器設(shè)備，需專門的操作人員。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是由日本學(xué)者Notomi發(fā)明的一種新式恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，其反應(yīng)依賴于具有鏈置換活性的ifeiDNA聚合酶，通過(guò)4個(gè)特異引物，在恒溫條件下(65°C左右)高效(30 mirTl h)擴(kuò)增目標(biāo)DNA，相比于PCR相關(guān)檢測(cè)技術(shù)，具有檢測(cè)時(shí)間更短，儀器依賴性小等優(yōu)點(diǎn)，具有應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)疫源地檢測(cè)的巨大潛力。LAMP的反應(yīng)產(chǎn)物可通過(guò)瓊脂糖凝膠的方法進(jìn)行判定，但該方法存在操作過(guò)程易污染，易出現(xiàn)假陽(yáng)性的缺點(diǎn)。
[0005]LAMP檢測(cè)與橫向流動(dòng)試紙條(Lateral flow dipstick, LFD)技術(shù)聯(lián)用(LAMP-LFD)是一種新的檢測(cè)方法，反應(yīng)中FITC標(biāo)記的探針與生物素標(biāo)記的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特異性雜交，不僅可避免非特異性擴(kuò)增引起的假陽(yáng)性，同時(shí)還能夠避免因瓊脂糖凝膠電泳等檢測(cè)手段引起的體系污染問(wèn)題，進(jìn)一步提高了反應(yīng)的特異性和靈敏度。LFD檢測(cè)不需特殊設(shè)備以及EB等有毒試劑，操作者只需將產(chǎn)物和試紙條浸入緩沖液即可，操作簡(jiǎn)便、安全。LAMP-LFD結(jié)合技術(shù)的檢測(cè)結(jié)果可以直接肉眼觀察，LFD試紙條上有控制帶和檢測(cè)帶，兩條帶均顯色表示檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，只有控制帶顯色、檢測(cè)帶不顯色表明檢測(cè)結(jié)果為陰性。LAMP-LFD結(jié)合方法安全、快捷、高效、高靈敏度且無(wú)設(shè)備及技術(shù)限制，具有其他技術(shù)所無(wú)法替代的優(yōu)勢(shì)。
[0006]目前，該技術(shù)已成功運(yùn)用于桃拉病毒(Taura syndrome virus, TSV)、對(duì)奸白斑癥病毒(White spot syndrome virus,WSSV)、傳染性肌肉壞死病毒(Infectious myonecrosisvirus, IMNV)、傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)、鰻利斯頓氏菌iListonella anguiIlarum'),觀鎮(zhèn)內(nèi)對(duì)于該技術(shù)的應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的診斷和檢測(cè)中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，即使國(guó)外文獻(xiàn)(Thanai Surasilp a, Siwaporn Longyant
а,Sombat Rukpratanporn b, Pattarin Sridulyakul a,Rapid and sensitive detectionof Vibrio vulnificus by loop-mediated isothermal amplification combined withlateral flow dipstick targeted to rpoS gene, Molecular and Cellular Probes ,2011,25:158-163)中有相關(guān)報(bào)道，但其檢測(cè)靈敏度和檢測(cè)速度都遠(yuǎn)不及本發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)速度快，檢測(cè)成本低，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性高的用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列。
[0008]本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為:
一種用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列，根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白基因TolC (GenBank登錄號(hào):DQ296643)的編碼序列設(shè)計(jì)LAMP的三對(duì)引物序列和一條探針序列，引物序列具體如下:
TolC-F3:5’ -TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3:5’ -CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP:5’ - TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3’，
TolC-BIP:5’ -GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF:5’ -GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
ToIC-LB: 5， -AACCTATCGAATGCACGCT-3，,
探針 TolC-HP:5’ -GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’，
其中，TolC-FIP的5’端為生物素標(biāo)記；探針TolC-HP的5’端為異硫氰酸熒光素標(biāo)記。
[0009]具體檢測(cè)方法步驟如下:
1)根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白基因TolCXGenBank登錄號(hào):DQ296643)的編碼序列設(shè)計(jì)LAMP的三對(duì)引物序列和一條探針序列，序列如上所述:
2)配置LAMP反應(yīng)體系:反應(yīng)體系各成分的終濃度分別為:外引物TolC-F3和TolC_B3各 0.2 Mmol/L,內(nèi)引物 TolC-FIP 和 TolC-BIP 各 1.6 Mmol/L，環(huán)引物 TolC-LF 和 TolC-LB各 0.4 Mmol/L, dNTPs 1.4mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8) 20mmol/L, KCl IOmmoI/L，MgSO4
б.5mmol/L, (MM)2SO4 IOmmoI/L，Triton X-1OO 0.1%, 8U Bst DNA 聚合酶大片段(NewEngland Biolabs)和2 PL樣品模版，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25 μ? ；
3)LAMP反應(yīng)體系擴(kuò)增:將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為63°C，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為35 min ；
4)探針雜交和LFD檢測(cè):擴(kuò)增后將20pmol的探針TolC-HP加入反應(yīng)體系中，63°C溫育5 min，進(jìn)行雜交，取5 PL雜交液加入100 μ?緩沖液中混勻，然后將LFD試紙條浸入加入雜交液的緩沖液中顯色，判斷橫向流動(dòng)試紙條檢測(cè)LAMP擴(kuò)增的結(jié)果。
[0010]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
1、檢測(cè)靈敏度高，本方法的檢測(cè)靈敏度為3.7X IO2 cfumL—1，相對(duì)于【背景技術(shù)】中所涉及的國(guó)外文獻(xiàn)(Rapid and sensitive detection of Vibrio vulnificus by loop-mediatedisothermal amplification combined with lateral flow dipstick targeted to rpoSgene)中的檢測(cè)靈敏度1.5 X IO3 cfumL—1，靈敏度提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0011]2、檢測(cè)時(shí)間短，擴(kuò)增反應(yīng)只需35 min，從樣品基因組DNA的提取到完成結(jié)果判斷，整個(gè)檢測(cè)流程僅需80 min,比常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù)縮短約2h，相對(duì)于【背景技術(shù)】中所涉及的國(guó)外文獻(xiàn)中報(bào)道的方法，僅擴(kuò)增反應(yīng)就需要90min，按照文章所述，使用試劑盒提取基因組DNA，所需時(shí)間約30min，那么從樣品基因組DNA的提取到完成結(jié)果判斷所需時(shí)間約為130min ;而本發(fā)明涉及的方法從樣品基因組DNA的提取到完成結(jié)果判斷，整個(gè)檢測(cè)流程僅需80min,比【背景技術(shù)】中所涉及的國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道的方法縮短50min，大幅度提高檢測(cè)速度。 [0012]3、特異性強(qiáng)，所用的特異性引物根據(jù)創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白基因中的八個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)，并且還有DNA的特異性探針，可有效避免利用瓊脂糖凝膠電泳、熒光染料等方法引起的假陽(yáng)性問(wèn)題。從【背景技術(shù)】中所涉及的國(guó)外文獻(xiàn)提供的圖片來(lái)看，它存在著以下幾個(gè)問(wèn)題，一是，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的圖片不夠清晰，條帶間的分離度不好；二是從瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果來(lái)看，90min之內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物量明顯不是很好，說(shuō)明擴(kuò)增的峰值不大，在加樣孔有大量擴(kuò)增，這應(yīng)屬于無(wú)效擴(kuò)增，但在利用LFD檢測(cè)的時(shí)候，這個(gè)無(wú)效擴(kuò)增結(jié)果顯示也可能是陽(yáng)性，會(huì)影響結(jié)果判斷；三是，這樣的擴(kuò)增結(jié)果說(shuō)明，篩選的引物不是最優(yōu)的，遠(yuǎn)不及本發(fā)明篩選的引物的檢測(cè)效果。
[0013]4、檢測(cè)成本低。本發(fā)明提供的基因組DNA提取方法，樣品費(fèi)用〈0.5元/次，而上述國(guó)外文獻(xiàn)中使用試劑盒提取樣品的基因組DNA，若按科研中常用的TaKaRa通用型基因組DNA提取試劑盒來(lái)計(jì)費(fèi)，市場(chǎng)價(jià)格為350元/50次，即樣品費(fèi)用為7元/次；本發(fā)明采用的引物和探針的LAMP-LFD檢測(cè)方法的成本僅為上述國(guó)外文獻(xiàn)中檢測(cè)方法的0.07倍，大幅度節(jié)約檢測(cè)成本。
[0014]5、儀器設(shè)備要求低，無(wú)需常規(guī)PCR所用的PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)等，只需一個(gè)水浴鍋即可完成檢測(cè)。
[0015]6、操作簡(jiǎn)單，結(jié)果明顯，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，稍具分子生物學(xué)基礎(chǔ)的人員即可完成操作；檢測(cè)結(jié)果清晰明顯，肉眼觀察即可判斷。
[0016]7、對(duì)人身和環(huán)境更加安全，檢測(cè)過(guò)程中不涉及EB等有毒試劑。
[0017]綜上所述，使用本發(fā)明的引物和探針采用LAMP-LFD方法對(duì)創(chuàng)傷弧菌進(jìn)行檢測(cè)，具有更高的快捷性、特異性和靈敏度，儀器需求簡(jiǎn)單，有利于創(chuàng)傷弧菌的早期診斷和檢測(cè)，可滿足基層檢測(cè)機(jī)構(gòu)和現(xiàn)場(chǎng)疫源地檢測(cè)的需要。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1 為 LAMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；M: 100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美國(guó))；1:以無(wú)菌去離子水作為模板；2:以創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562的基因組DNA為模板；3~11:分別以哈維氏弧菌ATCC 33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、輪蟲(chóng)弧菌DSM17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鰻弧菌香魚分離株、嗜水氣單胞菌(Ah0201)、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌ATCC 19115的基因組DNA為模板；
圖 2 為 LAMP-LFD 特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果；M:100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美國(guó))；1:以無(wú)菌去離子水作為模板；2:以創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562的基因組DNA為模板；3~11:分別以哈維氏弧菌ATCC 33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、輪蟲(chóng)弧菌DSM17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鰻弧菌香魚分離株、嗜水氣單胞菌(Ah0201 )、金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌ATCC 19115的基因組DNA為模板；
圖 3 為 LAMP 檢測(cè)的靈敏度結(jié)果；M: 100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美國(guó))；1:以無(wú)菌去離子水作為模板；2~10:創(chuàng)傷弧菌ATCC27562原始菌液(3.7 X IO9 cfumL—1)的10°、10' I O—2、10' I O—4、I O—5、I O—6、10' 10_8倍菌液提取的基因組DNA作為模板；
圖 4 為 LAMP-LFD 檢測(cè)的靈敏度結(jié)果；M: 100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美國(guó))；1:以無(wú)菌去離子水作為模板；2~10:創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562原始菌液(3.7X109cfumr1)的lO'lO'lO'lO'lO'lO'lO'lO'lO—8倍菌液提取的基因組DNA作為模板；圖 5 為 PCR檢測(cè)的靈敏度結(jié)果；M:100 bp Plus DNA ladder (Fermentas,美國(guó))；1:以無(wú)菌去離子水作為模板；2~10:創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562原始菌液(3.7X IO9 cfumL—1)的10°、10' I O—2、10' I O—4、I O—5、I O—6、10' 10_8倍菌液提取的基因組DNA作為模板。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0020]實(shí)施例1
LAMP-LFD技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的方法的建立
1.引物設(shè)計(jì):根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白基因TolC(GenBank登錄號(hào):DQ296643)的編碼序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中，引物序列具體如下:
TolC-F3:5’ -TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3:5’ -CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP:5’ - TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3，,
TolC-BIP:5’ -GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF:5’ -GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
TolC-LB: 5’ -AACCTATCGAATGCACGCT-3’，TolC-FIP 的 5’ 端為生物素標(biāo)記；
同時(shí)，設(shè)計(jì)一套探針，能夠特異性結(jié)合LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，用于LFD檢測(cè)，序列如下: TolC-HP:5’ -GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’，5’ 端為異硫氰酸熒光素標(biāo)記。
[0021]2.樣品DNA提取:采用水煮法。創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562菌株于TCBS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(28°C)，挑取單克隆于TSB培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 h-12 h (28°C，150rpm/min)。取I mL細(xì)菌的液體培養(yǎng)懸液于1.5 mL離心管中，12000 rpm離心2 min，棄上清；使用100 mL細(xì)菌裂解液(Tris-HCl 0.1 πιοΙ?Λ 蛋白酶K 0.2 μm1,Triton X-100 2.0%)充分懸浮細(xì)菌，沸水浴10 min,立即冰浴7 min ;重復(fù)上一步操作I次；12000 rpm離心2 min,取上清用作LAMP和PCR擴(kuò)增的模板，-30°C貯存?zhèn)溆谩?br> [0022]3.創(chuàng)傷弧菌LAMP反應(yīng)
利用步驟I設(shè)計(jì)的特異性引物，以創(chuàng)傷弧菌基因組DNA為模版進(jìn)行LAMP擴(kuò)增。
[0023]3.1 LAMP反應(yīng)體系，各成分的終濃度分別為:TolC_F3和TolC_B3各0.2 Mmol/L,TolC-FIP 和 TolC-BIP 各 1.6 Mmol/L，TolC-LF 和 TolC-LB 各 0.4 Mmol/L, dNTPs 1.4 mmol/L, Tris-HCl (pH 8.8)20 mmol/L,KCl 10 mmol/LjMgSO4 6.5 mmol/L, (MM)2SO4 10 mmol/L, Triton X-100 0.1%, 8U Bst DNA 聚合酶大片段(New England Biolabs)和 2 ML 樣品模版，加雙蒸水使反應(yīng)體系總體積為25 μ? ；3.2 LAMP反應(yīng)條件:將上述反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)溫度為63°C，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為35 min。
[0024]4.探針雜交和LFD檢測(cè):擴(kuò)增后將20 pmol的TolC-HP探針加入反應(yīng)體系中，63°C溫育5 min，進(jìn)行雜交，取5 μ?雜交液加入100 μ? buffer中混勻，然后將LFD試紙條浸入加入雜交液的buffer中顯色，判斷LAMP的擴(kuò)增情況。
[0025]實(shí)施例2
使用本發(fā)明的引物和探針進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌LAMP-LFD檢測(cè)的特異性測(cè)定利用所設(shè)計(jì)的特異性引物和探針，分別以創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562、哈維氏弧菌ATCC33866、河流弧菌ATCC 33809、副溶血弧菌ATCC 33847、輪蟲(chóng)弧菌DSM 17186T、溶藻弧菌ATCC 17749、鰻弧菌香魚分離株、嗜水氣單胞菌(Ah0201)、金黃色葡萄球菌ATCC 6538以及單增李斯特菌ATCC 19115等的基因組DNA為模版，按上述實(shí)施例1的步驟3和步驟4進(jìn)行LAMP-LFD反應(yīng)，驗(yàn)證引物和探針的特異性，雙蒸水作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖1和圖2所示，利用電泳法(圖1)和LFD(圖2)都只能從創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA樣品中擴(kuò)增獲得目的條帶，其它樣品無(wú)擴(kuò)增條帶，說(shuō)明使用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行LAMP-LFD檢測(cè)，具有良好的特異性。
[0026]實(shí)施例3
使用本發(fā)明的引物和探針進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌LAMP-LFD檢測(cè)的靈敏度測(cè)定采用上述實(shí)施例1的步驟2的水煮法提取創(chuàng)傷弧菌的基因組DNA，以此作為L(zhǎng)AMP-LFD反應(yīng)的模板起始濃度(相當(dāng)于3.7X IO9 cfumL—1)，進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別作為模板，按上述實(shí)施例1的步驟3和步 驟4進(jìn)行LAMP-LFD反應(yīng)，驗(yàn)證引物和探針的靈敏度，雙蒸水作為陰性對(duì)照。結(jié)果如圖3、圖4和圖5所示，使用本發(fā)明提供的引物和探針進(jìn)行的LAMP-LFD檢測(cè)的靈敏度為3.7X IO2 CfumL-1 (圖4)，與LAMP的擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的靈敏度一致(圖3)，是TolC-F3和TolC-B3作為引物建立的常規(guī)PCR檢測(cè)方法的100倍(圖 5)。
[0027]實(shí)施例4
用本發(fā)明LAMP-LFD技術(shù)具體檢測(cè)人工污染蛤蜊組織中的創(chuàng)傷弧菌。
[0028]1.創(chuàng)傷弧菌人工污染及待檢測(cè)樣品基因組DNA提取
實(shí)驗(yàn)蛤蜊購(gòu)自浙江寧波當(dāng)?shù)爻?，在去殼的蛤蜊樣品中添加等體積的無(wú)菌堿性蛋白凍水，充分勻漿。取適量勻漿樣品經(jīng)TCBS平板檢驗(yàn)，其余樣品于-80°C貯存。TCBS過(guò)夜培養(yǎng)，確認(rèn)無(wú)弧菌感染后用于后續(xù)試驗(yàn)。
[0029]創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562菌株于TCBS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(28°C)，挑取單克隆于TSB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)10 h-12 h(28 °C，150 rpm)至菌液濃度約為3.7 X IO9 cfumL'副溶血弧菌ATCC 33847菌株于TCBS培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)(28°C )，挑取單克隆于TSB培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)10 h-12 h(28 °C, 150 rpm)至菌液濃度約為I X IO9 cfumL—1。利用無(wú)菌水10倍濃度梯度連續(xù)稀釋菌液。取創(chuàng)傷弧菌ATCC 27562 的 3.7X IO5 cfumL'3.7X IO4 cfumL'3.7X IO3cfumL'3.7X IO2 cfumL'3.7X IO1 cfumL、個(gè)稀釋濃度和副溶血弧菌ATCC 33847菌株的IXlO7 cfumL-1稀釋濃度的菌液各I mL，分別與解凍的蛤蜊組織勻漿等體積混合。每個(gè)菌液稀釋度制備5個(gè)重復(fù)。充分混勻后，300 rpm離心10 min去除蛤蜊組織，取上清液于新的離心管中，18000 rpm離心10 min。除去上清液，利用100 mL細(xì)菌裂解液(Tris-HCl 0.1molL—1，蛋白酶K 0.2 μ§μυ\ Triton X-100 2.0%)充分懸浮細(xì)菌，沸水浴10 min，立即冰浴7 min ;重復(fù)上一步操作I次；12000 rpm離心2 min，取上清用作LAMP和PCR擴(kuò)增的模板，-30 °C貯存?zhèn)溆谩?br> [0030]2.LAMP反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件，按照實(shí)施例1步驟3進(jìn)行。
[0031]3.LFD顯色，檢測(cè)結(jié)果判斷
經(jīng)LAMP擴(kuò)增后，將20 pmol的TolC-HP探針加入反應(yīng)體系中，63°C溫育5 min，進(jìn)行雜交，取5 KL雜交液加入100 μι buffer中混勻,然后將LFD試紙條浸入加入雜交液的buffer中顯色。如果質(zhì)控線和檢測(cè)線位置均出現(xiàn)條帶，證明檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；如果僅有質(zhì)控線位置出現(xiàn)條帶，證明結(jié)果陰性；如果質(zhì)控線和檢測(cè)線位置均未出現(xiàn)條帶，證明檢測(cè)失敗。同時(shí)，上述模板利用常規(guī)PCR技術(shù)檢測(cè)，并與本發(fā)明LAMP-LFD檢測(cè)結(jié)果比較(如表1)。
[0032]結(jié)果顯示在蛤蜊組織中等體積污染不同濃度的創(chuàng)傷弧菌后，LAMP-LFD靈敏度濃度以上的創(chuàng)傷弧菌污染樣品的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，PCR只能檢測(cè)到用3.7X IO4 cfumL—1污染的組織樣品；LAMP-LFD對(duì)副溶血弧菌污染的蛤蜊樣品檢測(cè)的結(jié)果為陰性，特異性良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。
[0033]表1利用創(chuàng)傷弧菌和副溶血弧菌人工污染蛤蜊組織樣品后本發(fā)明LAMP-LFD檢測(cè)和PCR檢測(cè)結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種用于創(chuàng)傷弧菌的LAMP-LFD檢測(cè)的引物和探針序列，其特征在于根據(jù)創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白基因TolC (GenBank登錄號(hào):DQ296643)的編碼序列設(shè)計(jì)LAMP- LFD的三對(duì)引物序列和一條探針序列，引物序列具體如下:
TolC-F3:5’ -TCTTGAAGCCACTTATCGC-3’，
TolC-B3:5’ -CAGCATCAACATCCAGTACA-3’，
TolC-FIP:5’ - TACCAACATCAAAGCCCGCTTttttCGTGCGTATGAGCAATCT-3，,
TolC-BIP:5’ -GATGCCACTCGTCGCCTTttttGCAGTACACTCAAGATGTAGTT-3’，
TolC-LF:5’ -GGTTGCTTCTAATGCTGAACG-3’，
ToIC-LB: 5，-AACCTATCGAATGCACGCT-3，,
探針 TolC-HP:5’ -GGTACTCGTACTATTGTGGAT-3’， 其中，TolC-FIP的5’端為生物素標(biāo)記；探針TolC-HP的5’端為異硫氰酸熒光 素標(biāo)記。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103614466SQ201310556940
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】陳炯, 周前進(jìn) 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)