一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括一次發(fā)酵和二次發(fā)酵過(guò)程。本發(fā)明采用二次發(fā)酵酶液的方法優(yōu)化了纖維素酶發(fā)酵工藝路線(xiàn)，縮短了在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)比現(xiàn)有發(fā)酵工藝獲得相同酶活力的發(fā)酵時(shí)間，使得酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量提高、生產(chǎn)成本降低，更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。而且，本發(fā)明方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)方法容易掌握，且添加劑來(lái)源即為經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理后的自身發(fā)酵酶液，不需要另外購(gòu)進(jìn)添加劑而增加成本。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及纖維素酶發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素是地球上十分豐富的可再生資源，它占植物干重的35-50%。利用纖維素酶將纖維素降解為低聚糖、雙糖或單糖，從而進(jìn)一步生產(chǎn)其他生物基產(chǎn)品，例如單細(xì)胞蛋白、酒精等，對(duì)于解決目前面臨的能源危機(jī)、糧食短缺、環(huán)境污染等問(wèn)題具有十分重要的意義。纖維素酶是一種由三種組分組成的混合酶系，包括葡聚糖內(nèi)切酶(Cl酶)、葡聚糖外切酶(Cx酶)、β -葡萄糖苷酶(BG酶)。目前，纖維素酶的應(yīng)用已經(jīng)擴(kuò)展到醫(yī)藥、遺傳、紡織、日用化工、造紙、環(huán)境、食品發(fā)酵、飼料、工業(yè)洗滌、石油開(kāi)采、資源再生、廢水處理、農(nóng)業(yè)、生物能源等各個(gè)領(lǐng)域，尤其是在生物能源方面的應(yīng)用，前景十分廣闊。
[0003]纖維素酶是使纖維素降解生成葡萄糖的一組酶的總稱(chēng)，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶的三個(gè)組分經(jīng)過(guò)協(xié)同作用，將大分子的纖維素降解為低分子量的寡糖、雙糖或多糖。纖維素酶廣泛的應(yīng)用于食品加工業(yè)、釀造業(yè)、造紙工業(yè)、飼料添加劑、紡織工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域、植物細(xì)胞融合等方面。纖維素酶的產(chǎn)生菌包括細(xì)菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纖維素酶生產(chǎn)的菌種主要為絲狀真菌。絲狀真菌產(chǎn)生的纖維素酶酶系較全，且其產(chǎn)生的酶多為胞外酶，便于后期的分離提取。
[0004]目前，纖維素酶的生產(chǎn)方法一般是固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵。固態(tài)發(fā)酵成本低，但易污染雜菌，不易提取，難以進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。而液態(tài)發(fā)酵，屬于密閉式發(fā)酵，發(fā)酵過(guò)程中不易污染，且發(fā)酵條件易控制，后期分離提取酶液簡(jiǎn)便，因此便于大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)高活性的纖維素酶不僅高產(chǎn)菌株是一個(gè)關(guān)鍵因素，優(yōu)良的發(fā)酵工藝路線(xiàn)，包括培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度等也是關(guān)鍵所在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的在于提供一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明采用二次發(fā)酵酶液的方法優(yōu)化了纖維素酶發(fā)酵工藝路線(xiàn)，縮短了在相同發(fā)酵時(shí)間內(nèi)比現(xiàn)有發(fā)酵工藝獲得相同酶活力的發(fā)酵時(shí)間，使得酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量提高、生產(chǎn)成本降低，更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案為:
[0007]一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括一次發(fā)酵過(guò)程和二次發(fā)酵過(guò)程，
[0008]其中，所述一次發(fā)酵過(guò)程為:(1)向一次發(fā)酵培養(yǎng)基中加入纖維素酶產(chǎn)生菌A進(jìn)行一次發(fā)酵，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基以纖維素為底物，當(dāng)一次發(fā)酵液的濾紙酶活為10-20IU/ml時(shí)停止發(fā)酵，得到一次發(fā)酵液，(2)除去一次發(fā)酵液中的纖維素酶產(chǎn)生菌A的菌絲殘片以及孢子，得到一次酶液；
[0009]所述二次發(fā)酵過(guò)程為:(1)分別向二次發(fā)酵的二次發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一次酶液和纖維素酶產(chǎn)生菌B，從而構(gòu)成發(fā)酵體系，其中，一次酶液的添加量為使所述發(fā)酵體系中濾紙酶活為0.03~liu/ml，(2)在所述發(fā)酵體系中進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)纖維素酶。
[0010]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A與所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為同一種的菌種。
[0011]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A與所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為不同種的菌種。
[0012]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A為檜狀青霉，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木
霉O
[0013]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木霉。 [0014]優(yōu)選的是，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木霉Rut C30。
[0015]優(yōu)選的是，所述二次發(fā)酵過(guò)程中所述一次酶液的添加量為使所述發(fā)酵體系中濾紙酶活為0.5~0.7IU/ml。
[0016]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟⑵中，將一次發(fā)酵液在800~1200rpm下離心4~6min后，再用0.22~0.8 μ m的濾膜過(guò)濾，得到所述一次酶液。
[0017]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟(2)中，將一次發(fā)酵液在800~1200rpm下離心4~6min后,再用0.45 μ m的濾膜過(guò)濾后,得到所述一次酶液。
[0018]優(yōu)選的是，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟(1)中，將經(jīng)纖維素酶產(chǎn)生菌A培養(yǎng)獲得的種子液與一次發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1: 20~1: 100進(jìn)行接種，在22~28°C條件下發(fā)酵72~132h。
[0019]本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明方法由于一次酶液發(fā)酵獲得過(guò)程中纖維素酶產(chǎn)生菌A對(duì)纖維素的水解作用，產(chǎn)生了可溶性的寡糖、雙糖和單糖，這些可溶性糖為二次酶液獲得過(guò)程中所述發(fā)酵體系中的纖維素酶產(chǎn)生菌B的菌絲的生長(zhǎng)提供了碳源和能源，同時(shí)為纖維素酶的表達(dá)提供了誘導(dǎo)性物質(zhì)。因此，既使得了纖維素酶產(chǎn)生菌B的菌絲的快速生長(zhǎng)，也使得纖維素酶產(chǎn)生菌B產(chǎn)酶時(shí)間提前，與現(xiàn)有常規(guī)發(fā)酵方法相比較，在相同發(fā)酵時(shí)間時(shí)提高了酶活或者獲得相同酶活力時(shí)縮短了發(fā)酵時(shí)間，使得酶制劑產(chǎn)品質(zhì)量提高、生產(chǎn)成本降低，更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。一次發(fā)酵液要經(jīng)過(guò)離心和過(guò)濾去除其中的纖維素酶產(chǎn)生菌A的菌絲以及孢子，從而不會(huì)影響到二次酶液的發(fā)酵，還能提高纖維素酶的發(fā)酵效率?？傊?，本發(fā)明方法生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、技術(shù)方法容易掌握，且添加劑來(lái)源即為經(jīng)過(guò)過(guò)濾處理后的自身發(fā)酵酶液，不需要另外購(gòu)進(jìn)添加劑而增加成本。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為本發(fā)明所述纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法的流程圖。
[0021]圖2為用30ml 二次發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵方法與常規(guī)發(fā)酵方法發(fā)酵效果對(duì)比圖。
[0022]圖3為用5L 二次發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)本發(fā)明所述產(chǎn)纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵方法與常規(guī)發(fā)酵方法發(fā)酵效果對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說(shuō)明書(shū)文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0024]實(shí)施例1
[0025]纖維素酶活力測(cè)定[0026]本發(fā)明涉及的酶活力測(cè)定為濾紙酶活。
[0027]本發(fā)明涉及的各種酶活力同意定義為:在50±0.l0C,pH4.8的條件下，Iml酶液水解底物Imin產(chǎn)生相當(dāng)于I μ mol葡萄糖的還原糖量,為I個(gè)酶活力單位,用IU/ml表示。
[0028]所述的酶活檢測(cè)方法均根據(jù)國(guó)際方法IUPAC進(jìn)行。
[0029]濾紙酶活力的測(cè)定方法:1ml粗酶液,在50±0.1/C,ρΗ4.8的條件下,水解50± Img濾紙Ih所產(chǎn)生的還原糖的量，用DNS法測(cè)定還原糖的生成量。
[0030]實(shí)施例2
[0031]1)實(shí)驗(yàn)組:本發(fā)明所述纖維素酶液態(tài)發(fā)酵方法
[0032]菌種活化:在纖維素酶產(chǎn)生菌中，選取具有代表性的里氏木霉RUT-C30以及檜狀青霉9-3作為纖維素酶液態(tài)發(fā)酵的生產(chǎn)菌，經(jīng)傳代活化后，在PDA斜面保存于4°C備用；
[0033]菌種培養(yǎng):用無(wú)菌水將斜面孢子洗下，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為IO7個(gè)/ml，按照體積比為3: 100的接種量接種種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)18-24h菌種種子液；
[0034]一次發(fā)酵:(I)將青霉與木霉種子液分別按照體積比為1: 20的接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基，將青霉在30°C條件下發(fā)酵120h，將木霉在26°C條件下發(fā)酵120h，分別得到青霉一次發(fā)酵液和木霉一次發(fā)酵液，(2)將兩種一次發(fā)酵液分別在1200rpm尚心5min后經(jīng)
0.45 μ m的濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì)(殘留菌絲、孢子等)獲得青霉一次酶液和木霉一次酶液，用IUPAC方法測(cè)定濾紙酶活，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0035]二次發(fā)酵:(1)將編號(hào)為1、2、3和4的4個(gè)250ml錐形瓶?jī)?nèi)的各30ml里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基在115°C、IOlMpa的條件下滅菌、冷卻后，按照0.03IU/ml的酶活力分別向I和2號(hào)錐形瓶中添加青霉一次酶液和木霉一次酶液，按照與添加青霉一次酶液和木霉一次酶液的體積相同的量分別向3和4號(hào)錐形瓶中添加青霉一次發(fā)酵液和木霉一次發(fā)酵液，(2)在4個(gè)錐形瓶中分別按體積比為1: 20接種木霉菌種種子液，制得發(fā)酵體系。將配制好的4個(gè)I錐形瓶的發(fā)酵體系在26°C條件下發(fā)酵72-120h，1200rpm離心5min得到二次酶液。
[0036]2)對(duì)照組:常規(guī)纖維素酶發(fā)酵方法
[0037]菌種活化:在纖維素酶產(chǎn)生菌中，選取具有代表性的里氏木霉RUT-C30作為生產(chǎn)菌株，經(jīng)傳代活化后，在PDA斜面保存于4°C備用；
[0038]菌種培養(yǎng):用無(wú)菌水將斜面孢子洗下，血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子濃度為IO7個(gè)/ml，按照體積比為3: 100的接種量接種種子培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)18-24h獲得種子液；
[0039]酶液發(fā)酵過(guò)程:將250ml錐形瓶?jī)?nèi)的30ml里氏木霉發(fā)酵培養(yǎng)基在115°C、IOlMpa的條件下滅菌、冷卻后，添加與實(shí)驗(yàn)組一次酶液體積相同的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，按照體積比為1: 20的接種量接種到30rnl發(fā)酵培養(yǎng)基上，在26°C條件下發(fā)酵72-120h，1200rpm離心5min得到二次酶液。
[0040]結(jié)果如表1所示，添加經(jīng)過(guò)濾處理的酶液，能達(dá)到相同發(fā)酵時(shí)間提高酶活力或達(dá)到相同酶活力時(shí)縮短發(fā)酵時(shí)間的作用，而未經(jīng)過(guò)濾處理的酶液不僅沒(méi)有上述作用，反而對(duì)產(chǎn)酶有所抑制。
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一種纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，包括一次發(fā)酵過(guò)程和二次發(fā)酵過(guò)程， 其中，所述一次發(fā)酵過(guò)程為:(I)向一次發(fā)酵培養(yǎng)基中加入纖維素酶產(chǎn)生菌A進(jìn)行一次發(fā)酵，所述一次發(fā)酵培養(yǎng)基以纖維素為底物，當(dāng)一次發(fā)酵液的濾紙酶活為10-20IU/ml時(shí)停止發(fā)酵，得到一次發(fā)酵液，(2)除去一次發(fā)酵液中的纖維素酶產(chǎn)生菌A的菌絲殘片以及孢子，得到一次酶液； 所述二次發(fā)酵過(guò)程為:(1)分別向二次發(fā)酵的二次發(fā)酵培養(yǎng)基中加入一次酶液和纖維素酶產(chǎn)生菌B，從而構(gòu)成發(fā)酵體系，其中，一次酶液的添加量為使所述發(fā)酵體系中濾紙酶活為0.03~lIU/ml，(2)在所述發(fā)酵體系中進(jìn)行發(fā)酵，以生產(chǎn)纖維素酶。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A與所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為同一種的菌種。
3.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A與所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為不同種的菌種。
4.如權(quán)利要求3所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌A為檜狀青霉，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木霉。
5.如權(quán)利要求2所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木霉。
6.如權(quán)利要求4或5所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述纖維素酶產(chǎn)生菌B為里氏木霉Rut C30。
7.如權(quán)利要求1所述纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述二次發(fā)酵過(guò)程中所述一次酶液的添加量為使所述發(fā)酵體系中濾紙酶活為0.5~0.7IU/ml。
8.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟(2)中，將一次發(fā)酵液在800~1200rpm下離心4~6min后，再用0.22~0.8μπι的濾膜過(guò)濾，得到所述一次酶液。
9.如權(quán)利要求8所述纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟(2)中，將一次發(fā)酵液在800~1200rpm下離心4~6min后，再用0.45 μ m的濾膜過(guò)濾后，得到所述一次酶液。
10.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)方法，其特征在于，所述一次發(fā)酵過(guò)程中的步驟(1)中，將經(jīng)纖維素酶產(chǎn)生菌A培養(yǎng)獲得的種子液與一次發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1: 20~1: 100進(jìn)行接種，在22~28°C條件下發(fā)酵72~132h。
【文檔編號(hào)】C12R1/80GK103555694SQ201310557902
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】張東遠(yuǎn), 張粲, 李晨, 賈文娣, 赫榮琳, 武改紅, 陳樹(shù)林 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所