利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法：在表達(dá)外源基因的同時，利用內(nèi)源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達(dá)，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因水稻。具體為：將外源基因表達(dá)框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達(dá)框構(gòu)建在同一個植物表達(dá)載體上；所述amiRNA表達(dá)框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。本發(fā)明通過定向沉默水稻中參與除草劑解毒和脫毒代謝酶基因的表達(dá)，從而獲得了一種能安全選擇消滅轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
【專利說明】利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，以及所用的基因、質(zhì)粒屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物目前已經(jīng)在世界上許多國家大量推廣，我國也在大力發(fā)展、推廣轉(zhuǎn)基因技術(shù)和轉(zhuǎn)基因研究。當(dāng)下，利用轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)藥用蛋白、工業(yè)酶等研究工作也開展得如火如荼(Larrick and Thomas, Current Opinion in Biotechnology, 2001, 12:411-418)。種植這些轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物存在其可能混入非轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物從而導(dǎo)致混入人食物中的重要健康安全隱患以及轉(zhuǎn)基因漂移等生態(tài)安全隱患，因此，發(fā)明一種簡便、控制轉(zhuǎn)基因農(nóng)作傳播方法具有重大的現(xiàn)實意義。
[0003]細(xì)胞色素P450是一類利用NADPH所傳遞的電子去催化分子氧活化的血紅素蛋白，占植物基因的1%，是植物中一類重要的酶。它在植物體內(nèi)介導(dǎo)一系列氧化反應(yīng)，其功能涉及木質(zhì)素、留醇、內(nèi)萜、生物堿、脂肪酸和許多起植保素功效的次生物質(zhì)合成代謝，以及天然和人工合成的許多外源抗生素(如除草劑)等物質(zhì)的降解和除毒代謝等，在植物生長發(fā)育、防御病蟲害和適應(yīng)逆境中有著特別重要的作用。細(xì)胞色素P450是一個超基因家族， 植物中命名的已超過1000個，水稻中可能的有500多個，截止目前，生物學(xué)功能被確切驗證的植物P450基因只有40個左右，目前的研究顯示P450在水稻自身防御中具有重要作用，是茉莉酸途徑中的一類重要氧化酶，參與合成二萜、羥色胺等多種用于防御的此生代謝產(chǎn)物(Fujiwara T et al, Joural of Biology Chemistry, 2010285:11308-11313; Reub en J P et al, Phytochemisty2006, 67:2307-2317)。CYP81A6 基因是水稻 P450 基因家族中苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因，故水稻對苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑有良好的抗性 (Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Pan et al, Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trends in Plant Science5:116-123)。將水稻解毒的P450基因用反義RNA或RNAi技術(shù)與目的基因以及其它相關(guān)構(gòu)建于同一載體，就可以在表達(dá)目的基因的同時獲得可以選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因植物(生物反應(yīng)器)。
[0004]目前應(yīng)用的反義RNA或RNAi沉默技術(shù)盡管能夠達(dá)到選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的目的， 但是它存在很多的問題，其中最重要有“脫靶效應(yīng)”:水稻中P450基因是一個超基因家族， 其彼此間的同源性很高，在構(gòu)建RNA或RNAi沉默載體產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因水稻時，dicer酶酶切前體siRNA (dsRNA)不是單一位點酶切，會產(chǎn)生大量siRNA，可能會造成目的基因脫靶；同時， 水稻被注釋的基因只有60%左右，由于RNA聚合酶`的作用，可能會產(chǎn)生次生的siRNA，產(chǎn)生 “非靶標(biāo)效應(yīng)”，在沉默靶基因的同時，也導(dǎo)致非靶標(biāo)基因也被沉默，從而可能導(dǎo)致一些有益農(nóng)藝性狀的消失以及一些不可預(yù)知的水稻功能缺失(Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690 ；Norman Warthmann et al, PLoS ONE, 2008, 3 (3);張曉輝等，自然科學(xué)進展，2009，10:1029-1036)。所以急需一個特異性高、安全、無明顯副作用的沉默技術(shù)以及方法。[0005]miRNAs (microRNAs)是一種高度保守的、長度為18-25個核苷酸的單鏈RNA小分子，廣泛存在于真核生物中，最早在1993年于秀桿線蟲中被發(fā)現(xiàn)。miRNAs前體與沉默目標(biāo)基因存在I個至幾個堿基的不完全配對或完全配對，在dicer酶的作用下，miRNAs前體偏好產(chǎn)生并聚集一種sRNA雙鏈結(jié)構(gòu)(miRNA-miRNA*)，然后與整合到沉默復(fù)合體(RISC)中，最后與靶基因的mRNA3’未翻譯區(qū)結(jié)合，完全匹配的導(dǎo)致mRNA降解而達(dá)到靶基因沉默，不完全配對的導(dǎo)致mRNA轉(zhuǎn)錄抑制而達(dá)到祀基因沉默(Norman Warthmann et al, PLoSONE, 2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。miRNA沉默技術(shù)特異性高、效率高、遺傳穩(wěn)定、作用時間長、體內(nèi)穩(wěn)定、高RNA啟動子兼容性、無明顯毒性等優(yōu)點(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols, 2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008, CambridgeUniversity Press)，其在功能基因組學(xué)研究、基因治療、動植物抵抗外源病毒等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。amiRNAs (artificial micoRNAs)是利用內(nèi)源性miRNA前體產(chǎn)生sRNA來實現(xiàn)基因沉默。2002年amiRNAs沉默技術(shù)第一次在人細(xì)胞系中應(yīng)用，之后在多種植物和動物中應(yīng)用。
[0006]目前還沒有一個既能表達(dá)外源蛋白同時又能安全、可選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因水稻(生物反應(yīng)器)的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻方法；本發(fā)明通過定向沉默水稻中參與除草劑解毒和脫毒代謝酶基因的表達(dá)，從而獲得了一種能安全選擇消滅轉(zhuǎn)基因水稻的方法。 [0008]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，在表達(dá)外源基因的同時，利用內(nèi)源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達(dá)，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0009]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的改進:將外源基因表達(dá)框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達(dá)框(amiRNA表達(dá)抑制框)構(gòu)建在同一個植物表達(dá)載體上；
[0010]amiRNA表達(dá)框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。
[0011]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進一步改進:表達(dá)的外源基因為醫(yī)用蛋白基因、工業(yè)酶基因、抗蟲基因或抗除草劑基因。
[0012]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進一步改進:作為前體的內(nèi)源性miRNA命名為0S-528，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
[0013]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進一步改進:除草劑解毒酶基因為CYP81A6，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
[0014]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進一步改進:在水稻中表達(dá)外源基因(目的基因)的同時定向抑制苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因水稻就能被苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺；
[0015]即，將目的基因(外源基因)表達(dá)框和苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6表達(dá)抑制框連接在同一個載體上，轉(zhuǎn)化時它們在同一個T-DNA片段上導(dǎo)入植物染色體中。
[0016]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進ー步改進:
[0017]amiRNAs核苷酸序列為以下:
[0018]miRl-F:AGTCAATACATGAGTTCGTCCGGCAGGAGATTCAGTTTGA ；
[0019]miRl-R:TGCCGGACGAACTCATGTATTGACTGCTGCTGCTACAGCC ；
[0020]miRl1-F:CTCCGGAgGAAgTCATGTATTGATTCCTGCTGCTAGGCTG ；
[0021]miRll-R:AATCAATACATGAcTTCcTCCGGAGAGAGGCAAAAGTGAA0
[0022]備注說明:
[0023]amiRNAs存在1_2個堿基錯配，小寫字體代表的是錯配堿基；帶下劃線的字體代表的是設(shè)計的人工miRNAs。
[0024]作為本發(fā)明的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法的進ー步改進:所得的載體為1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，將所述1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i載體導(dǎo)入水稻中，最終獲得抗草甘膦而對除草劑苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0025]備注說明:1174相當(dāng)于ー個外源基因。
[0026]本發(fā)明是一種利用`人工小分子RNAs (artificial microRNAs, amiRNAs)獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法。
[0027]具體而言，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0028]在表達(dá)目的基因(外源基因)的同時，利用amiRNAs方法，抑制轉(zhuǎn)基因水稻中參與除草劑解毒、脫毒基因的表達(dá)，獲得可被安全選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因水稻。
[0029]具體地，所述目標(biāo)除草劑為苯達(dá)松或磺酰脲類除草剤，它們是農(nóng)業(yè)上常用的除草劑，對多種闊葉雜草具有良好的除草能力，水稻具有對這兩種除草劑的解毒酶CYP81A6，故對這兩種除草劑有良好的抗性(Siminiszky, Phytochemistry Reviews5:445-458;Panet al,Plant Molecular Biology, 2006, 61:933-943;Werck-Reichhart et al, Trendsin Plant Science5:116-123)。故在水稻中表達(dá)目的基因的同時定向抑制苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻就可以被苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺。2002年amiRNAs沉默技術(shù)第一次在人細(xì)胞系中成功應(yīng)用，隨后在多種植物和動物中應(yīng)用，盡管其功能機制還有待于進一歩的研究，但由于amiRNAs沉默技術(shù)特異性高、效率高、遺傳穩(wěn)定、作用時間長、體內(nèi)穩(wěn)定、高RNA啟動子兼容性、無明顯毒性等優(yōu)點(Shao Yao Ying, MicroRNA Protocols,2006, Humana press Inc;KrisshnaraoAppasani, MicroRNAs:From Basic Science to Disease Biology,2008,CambridgeUniversity Press),其已成為新一代沉默技術(shù)的代表(Norman Warthmann et al, PLoSONE,2008, 3(3);Stephan Ossowski et al, The Plant Joural2008, 53:674-690)。amiRNA表達(dá)抑制框可以由一個啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段、終止子等功能性連接而成。啟動子可選擇玉米泛素啟動子Zmub1-1 (Christensen and Quail, TransgenicRes, 5:213-8),或水稻泛素啟動子(Wang and Oard, Plant Cell Reports, 22:129-134),或水稻 Actin 啟動子(McElroy et al, Plant Cell2:163-171 )，或 CaMV35S 啟動子，或其它在水稻中有活性的啟動子，終止子可為廣泛利用的CaMV35S終止子、Nos終止子等。[0030]在本發(fā)明中，為使得到的轉(zhuǎn)基因水稻能穩(wěn)定傳代，目的基因表達(dá)框與定向抑制的苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6的表達(dá)框緊密連鎖。這種連鎖在本發(fā)明中是通過插入DNA片段的構(gòu)建來實現(xiàn):即將目的基因表達(dá)框和苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6表達(dá)抑制框連接在同一個載體上，轉(zhuǎn)化時它們在同一個T-DNA片段上導(dǎo)入植物染色體中。例如利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化時，則是連接在同一個T-DNA片段中；利用基因槍方法時，則連接在同一個載體上的同一個DNA插入片段中。
[0031]具體地:
[0032]1.內(nèi)源miRNA至少具有以下核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:1。
[0033]2.被抑制表達(dá)苯達(dá)松、磺酰脲類除草劑解毒酶基因CYP81A6至少具有以下核苷酸序列編碼:SEQ ID NO:2。
[0034]3.amiRNAs至少具有以下核苷酸序列:
[0035]
【權(quán)利要求】
1.利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:在表達(dá)外源基因的同時，利用內(nèi)源性miRNA作為前體，定向抑制水稻中除草劑解毒酶表達(dá)，從而獲得安全、可選擇滅殺的轉(zhuǎn)基因水稻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:將外源基因表達(dá)框與定向抑制解毒酶的amiRNAs表達(dá)框構(gòu)建在同一個植物表達(dá)載體上； 所述amiRNA表達(dá)框包括由啟動子、反方向的被抑制基因的全部或部分片段和終止子功能性連接而成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:表達(dá)的外源基因為醫(yī)用蛋白基因、エ業(yè)酶基因、抗蟲基因或抗除草劑基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:作為前體的內(nèi)源性miRNA命名為0S-528，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:除草劑解毒酶基因為CYP81A6，其多核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在干:在水稻中表達(dá)外源基因的同時定向抑制苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑解毒基因CYP81A6的表達(dá)，所得的轉(zhuǎn)基因水稻就能被苯達(dá)松或磺酰脲類除草劑選擇滅殺。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的利用amiRNAs獲得安全可選擇滅殺轉(zhuǎn)基因水稻的方法，其特征在于:所得的載體為1300-35S-Ubq-1174-Ubq_CYP81A6i，將所述.1300-35S-Ubq-1174-Ubq-CYP81A6i載體導(dǎo)入水稻中，最終獲得抗草甘膦而對除草劑苯達(dá)松敏感的轉(zhuǎn)基因水稻。
【文檔編號】C12N15/84GK103602705SQ201310558050
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月11日
【發(fā)明者】劉明宏, 沈志成 申請人:浙江大學(xué)