一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物采油的培養(yǎng)基，特別是涉及一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。培養(yǎng)基中以甘油作為碳源，NaNO3作為無機(jī)氮源。本發(fā)明提供的培養(yǎng)基，可以有效地促進(jìn)厭氧產(chǎn)鼠李糖脂菌種在缺氧條件下快速代謝生產(chǎn)鼠李糖脂，并為激活油藏原位的相關(guān)功能菌種進(jìn)行微生物驅(qū)油，提供有效的營養(yǎng)激活劑配方。
【專利說明】一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物采油的培養(yǎng)基，特別是涉及一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]鼠李糖脂是由微生物代謝產(chǎn)生的一種生物表面活性劑，在微生物提高原油采收率(MEOR)【技術(shù)領(lǐng)域】有重要的應(yīng)用潛力。對鼠李糖脂好氧發(fā)酵條件優(yōu)化已有很多研究，但對相關(guān)菌種在厭氧條件下代謝生產(chǎn)鼠李糖脂所用的培養(yǎng)基還缺少研究。
[0003]目前，油田在利用鼠李糖脂提高采收率的技術(shù)中，大都采用地上發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖月旨，然后再注入油藏，然而有氧發(fā)酵設(shè)備的運(yùn)行與維護(hù)和產(chǎn)物的提取與運(yùn)輸?shù)某杀据^高；而地下有氧發(fā)酵，則需向油藏注入空氣，這又帶來操作性差，安全性差，設(shè)備要求較高，注空氣管線易氧化腐蝕等問題。因此，獲得一種代謝生產(chǎn)產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基，將能夠解決上述瓶頸問題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中碳源為甘油，無機(jī)氮源為NaNO3作。
[0007]所述培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:甘油3-4%，NaNO30.2-0.4%, K2HPO4.3H200.35-0.45%,KH2PO40.4-0.5%, MgSO4.7H200.003-0.005%, CaCl20.01-0.02%, KC10.08-0.14%,NaCl0.08-0.14%，酵母粉 0.1-0.2%，余量為水。
[0008]進(jìn)一步的說，所述培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:甘油3.6%，NaNO30.3%，K2HPO4.3Η200.42%，KH2PO40.47%, MgSO4.7Η200.004%, CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量為水。
[0009]一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基的應(yīng)用，所述培養(yǎng)基作為代謝生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑的培養(yǎng)基。
[0010]厭氧條件下利用所述培養(yǎng)基代謝生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑。
[0011]本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn):
[0012]將產(chǎn)鼠李糖脂菌種于本發(fā)明培養(yǎng)基中，在厭氧條件下快速地代謝生產(chǎn)鼠李糖脂，培養(yǎng)基中利用水溶性好且極易被微生物代謝利用甘油為碳源，縮短了厭氧產(chǎn)鼠李糖脂菌種細(xì)胞生長和鼠李糖脂合成所需的時(shí)間，在一定程度上彌補(bǔ)了在缺氧條件下細(xì)胞代謝緩慢的缺陷。同時(shí)能夠激活油藏缺氧生境中存在的厭氧產(chǎn)鼠李糖脂類功能菌，從而提高原油采收率，進(jìn)而對油藏原位的微生物驅(qū)油，減少基礎(chǔ)設(shè)施和生產(chǎn)設(shè)備費(fèi)用；降低采油成本。
[0013]本發(fā)明培養(yǎng)基可以促進(jìn)厭氧產(chǎn)鼠李糖脂菌種在缺氧條件下快速地代謝生產(chǎn)鼠李糖脂，縮短發(fā)酵周期。其中培養(yǎng)基提供有效的營養(yǎng)激活劑，能夠激活本源的厭氧產(chǎn)鼠李糖月旨，同時(shí)厭氧條件下發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂，可以避免好氧發(fā)酵過程中的諸多不利因素。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1
[0016]培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:甘油3.6%, NaNO30.3%, K2HPO4.3Η200.42%, KH2PO40.47%,MgSO4.7Η200.004%, CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量為蒸餾水，pH 自然。即培養(yǎng)基配完后無需調(diào)pH。
[0017]上述培養(yǎng)基中選取NaNO3作為無機(jī)氮源，保證產(chǎn)鼠李糖脂的厭氧功能菌在厭氧條件下進(jìn)行硝酸鹽呼吸獲取生長代謝所需的能量。
[0018]實(shí)施例2
[0019]利用上述培養(yǎng)基在厭氧瓶中發(fā)酵生產(chǎn)鼠李糖脂:
[0020]I)菌株為 Pseudomonas sp ANB10SURF-1 (Pseudomonas sp ANB10SURF-1 中的相關(guān)記載參見 Albino et al.2011Partial characterizat1n of b1surfactant producedunder anaerobic condit1ns by Pseudomonas sp ANB1SURF-1)。
[0021]2)厭氧培養(yǎng)基制備方法:將上述配制好的培養(yǎng)基煮沸約15min，至刃天青指示劑由藍(lán)色變淡紅色；然后在高純氮?dú)獗Ｗo(hù)下，分裝到厭氧瓶中；121°C，滅菌20min;注入過濾除菌的2.5%(w/v)Na2S.9H20還原劑至終濃度0.02%，去除殘余氧。
[0022]3)發(fā)酵條件:將200mL上述滅菌后的培養(yǎng)基于250mL厭氧瓶中，再將上述菌株按6%的接種量接種，在80r/min的轉(zhuǎn)速、40°C的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7d, pH自然。
[0023]4)發(fā)酵液中鼠李糖脂的定量測定:
[0024]采用苔黑酚-硫酸法，糖基分子在強(qiáng)酸性條件下脫水生成糠醛或其衍生物，與苔黑酚反應(yīng)可以生成帶色物質(zhì)，在421nm處有最大吸收。
[0025]樣品制備:發(fā)酵液先10，000 X g，離心20min，以去除菌體細(xì)胞；取0.5mL上清液用
ImL乙醚萃取三次，然后合并上層有機(jī)相至干凈試管中；將試管置于通風(fēng)廚內(nèi)，使乙醚完全揮發(fā)掉；加入0.5mL蒸懼水。
[0026]標(biāo)準(zhǔn)品的制備:配制一系列濃度(0-0.05g/L)的L-鼠李糖溶液，取L-鼠李糖在105°C烘干至衡重，稱取25mg溶于蒸餾水，定容至250mL，得到質(zhì)量濃度0.10g/L鼠李糖脂標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取 2.5mL, 5.0mL, 7.5mL, 10.0mL, 12.5mL, 15.0mL, 17.5mL, 20.0mL, 22.5mL, 25.0mL鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，至蒸餾水中定容至50mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.005,0.010,0.015，
0.020,0.025,0.030，0.035,0.0400.045,0.050g/L 的系列鼠李糖溶液。
[0027]將上述獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品與苔黑酚溶液按照1:9的體積比(ml)進(jìn)行混合置于試管中；其中，苔黑酚溶液為0.19% (質(zhì)量濃度)的苔黑酚溶于53% (體積濃度)的H2SO4中。
[0028]將上述試管于80°C水浴30min，室溫下冷卻15min ;測定其OD421。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的空白以蒸餾水代替鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品，發(fā)酵液的空白對照以未接種的培養(yǎng)基代替發(fā)酵液。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到鼠李糖的質(zhì)量濃度(見圖1)，乘以相關(guān)系數(shù)3，得到鼠李糖脂的質(zhì)量濃度，最終得出發(fā)酵液中鼠李糖脂質(zhì)量濃度。
[0029]在厭氧瓶培養(yǎng)條件下，利用該厭氧產(chǎn)鼠李糖脂培養(yǎng)基，鼠李糖脂產(chǎn)量為
3.12±0.llg/L。
[0030]實(shí)施例3
[0031]上述厭氧產(chǎn)鼠李糖脂培養(yǎng)基的物理模擬巖芯驅(qū)油實(shí)驗(yàn)評價(jià):
[0032]I)人造巖芯處理:抽真空飽和地層水，飽和油，老化。計(jì)算孔隙體積PV=巖心濕重-巖心干重；人造巖芯孔隙體積PV=2338.7g-2233.3g)/Ig^mr1=1S.4mL。
[0033]2) —次水驅(qū):利用地層水對巖芯進(jìn)行一次水驅(qū)，至含水率達(dá)98%以上，計(jì)算水驅(qū)采收率；計(jì)算水驅(qū)采收率=出油量/飽和油量X 100% ；
[0034]具體水驅(qū)采收率=(43mL/68mL)X 100%=63.6%。
[0035]3)將上述實(shí)施例培養(yǎng)基注入巖芯:將0.3PV滅菌且除氧的該厭氧產(chǎn)鼠李糖脂培養(yǎng)基注入巖芯中，其中，對照巖芯注入0.3PV的地層水。
[0036]4)培養(yǎng):關(guān)閉巖心兩端,模擬地層溫度培養(yǎng)一個(gè)月。
[0037]5) 二次水驅(qū):方法同一次水驅(qū)。計(jì)算二次采收率及提高的采收率；其中，
[0038]二次采收率=(二次水驅(qū)出油總量/飽和油量)X 100% ；
[0039]提高的采收率=(實(shí)驗(yàn)巖芯的二次采收率-對照巖芯的二次采收率)
[0040]經(jīng)二次水驅(qū)的二次采收率及提高的采收率分別為:
[0041]二次采收率=(8mL/68mL) X 100%=11.7%
[0042]提高的采收率=11.7%-0.9%=10.8%。
[0043]在模擬地層溫度培養(yǎng)的過程中，該厭氧產(chǎn)鼠李糖脂培養(yǎng)基在人造巖芯內(nèi)激活地層水中相關(guān)的厭氧產(chǎn)鼠李糖脂功能菌，并促進(jìn)其產(chǎn)生鼠李糖脂表面活性劑，作用于巖芯中的原油，從而在一次水驅(qū)基礎(chǔ)上提高原油采收率達(dá)10.8個(gè)百分點(diǎn)。
【權(quán)利要求】
1.一種代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基中碳源為甘油，無機(jī)氮源為NaNO30
2.按權(quán)利要求1所述的代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:甘油 3-4%, NaNO30.2-0.4%, K2HPO4.3Η200.35-0.45%, KH2PO40.4-0.5%,MgSO4.7Η200.003-0.005%, CaCl20.01-0.02%, KC10.08-0.14%, NaCl0.08-0.14%,酵母粉0.1-0.2%，余量為水。
3.按權(quán)利要求2所述的代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基，其特征在于:所述培養(yǎng)基按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為:甘油 3.6%, NaNO30.3%, K2HPO4.3H200.42%, KH2PO40.47%, MgSO4.7H200.004%,CaCl20.013%, KC10.1%，NaCl0.1%，酵母粉 0.16%，余量為水。
4.一種權(quán)利要求1所述的代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于:所述培養(yǎng)基作為代謝生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑的培養(yǎng)基。
5.按權(quán)利要求4所述的代謝產(chǎn)鼠李糖脂的培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于:厭氧條件下利用所述培養(yǎng)基代謝生產(chǎn)鼠李糖脂表面活性劑。
【文檔編號】C12P19/44GK104232708SQ201310558200
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】張穎, 趙峰, 史榮久, 韓斯琴 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所