一種淡紫灰鏈霉菌及其在制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種淡紫灰鏈霉菌菌株，其分類命名為淡紫灰鏈霉菌（STREPTOMYCES?LAVENDULAE），已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC?No.7548。本發(fā)明還涉及淡紫灰鏈霉菌在發(fā)酵海藻渣制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用。本發(fā)明所述淡紫灰鏈霉菌菌株對海藻渣的降解效果突出，不但能將海藻加工行業(yè)提取海藻膠以后產(chǎn)生的廢渣進(jìn)行重新利用，而且其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗生素類代謝活性物質(zhì)能夠有效抑制多種致病微生物的生長，具有良好的促生增產(chǎn)功效，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中效果顯著。
【專利說明】一種淡紫灰鏈霉菌及其在制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說，涉及一種淡紫灰鏈霉菌菌株及其在發(fā)酵海藻渣制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]迄今為止，海藻已在食品、海洋藥物、動物飼料、有機肥料、化妝品及生物能源等領(lǐng)域和范圍內(nèi)顯現(xiàn)出巨大的開發(fā)潛力和經(jīng)濟價值。在海藻的加工利用過程中，會產(chǎn)生大量的廢棄物——海藻渣，這些海藻渣中含有豐富的海藻酸、甘露醇、甜菜堿、殼聚糖、多酚以及海藻纖維、果膠、蛋白質(zhì)、木質(zhì)素等物質(zhì)。因此，如何將海藻渣進(jìn)一步加工利用，最大程度的發(fā)揮其價值，成為人們?nèi)找骊P(guān)心的問題。
[0003]中國發(fā)明專利CN101439997A公開了一種海藻有機肥的制備方法，利用提取海藻膠后的廢渣發(fā)酵生產(chǎn)有機肥。針對海藻渣不容易降解導(dǎo)致的發(fā)酵困難，在配料中加入1%。~15%。的磷酸二氫鉀，使不溶性海 藻酸鈣轉(zhuǎn)化成可溶性的海藻酸鉀，加快海藻渣的發(fā)酵和腐熟，縮短發(fā)酵時間5~8天，縮短腐熟時間5~10天。
[0004]中國發(fā)明專利CN101585723A公開了一種海藻生物長效肥的制備方法，以海藻渣為活性載體，將海藻提取物內(nèi)的多種活性物質(zhì)和營養(yǎng)成分全部包裹，進(jìn)行生化反應(yīng)，制成無毒、無污染、純天然的海藻生物長效肥。
[0005]中國發(fā)明專利CN102391030A公開了一種有機海藻肥及其作為高效植物生長調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用。所述的海藻肥是將鮮海帶化工中的海藻渣與麥麩、秸桿、中藥渣、果渣、活性污泥或酒糟中的一種或幾種混合物的復(fù)配物，進(jìn)行堆肥微好氧發(fā)酵而成的有機海藻肥。
[0006]中國發(fā)明專利CN102408282A公開了一種有機海藻肥及其作為高效鹽堿土改良劑的應(yīng)用，是將海藻工業(yè)廢渣采用微好氧發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行發(fā)酵腐熟而得到有機海藻肥，或?qū)⒌玫降挠袡C海藻肥與麥麩、秸桿、中藥渣、果渣、活性污泥或酒糟中的一種或幾種混合物復(fù)配而成的復(fù)合有機海藻肥。
[0007]上述海藻渣肥料的主要缺點是腐熟過程中海藻渣降解效果差，所用微生物多為廣譜性菌株，不能專一性地降解海藻渣，腐熟周期長、效率低，而且部分腐熟劑中含有的黑曲霉等還會引起植株軟腐病等真菌性病害。此外，這類海藻渣肥多為微生物發(fā)酵后再與化肥原料摻混而成，雖然有一定的肥效，但是其中的有效菌大部分已死亡，根本起不到應(yīng)有的作用，而一些純粹的微生物發(fā)酵產(chǎn)品由于營養(yǎng)匱乏，雖然有效菌較多，但是發(fā)揮作用慢，農(nóng)戶認(rèn)可度低，市場推廣應(yīng)用困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種淡紫灰鏈霉菌菌株，所述淡紫灰鏈霉菌菌株不僅能夠高效降解海藻渣，獲得海藻多糖、酚類多聚化合物等海藻活性物質(zhì)，而且發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗生素類代謝活性物質(zhì)能夠有效抑制多種病原微生物的生長，具有良好的促生增產(chǎn)功效。[0009]為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案之一，是提供一種淡紫灰鏈霉菌菌株，所述菌株的分類命名為淡紫灰鏈霉菌(STREPTOMYCES LAVENDULAE),已于2013年05月03日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7548，保藏單位地址:北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。
[0010]所述淡紫灰鏈霉菌菌株是由下述方法篩選得到的:
[0011](I)菌種富集
[0012]以海藻渣為唯一營養(yǎng)物質(zhì)配制初篩液體培養(yǎng)基，從海藻腐爛部位挑菌接種，28°C、180rpm搖床培養(yǎng)72h，得富集后的發(fā)酵液；
[0013](2)菌種復(fù)篩
[0014]將步驟(1)所得發(fā)酵液進(jìn)行梯度稀釋，在復(fù)篩培養(yǎng)基平板上涂布，挑選菌落周圍透明圈大的菌株進(jìn)行劃線分離純化。
[0015]優(yōu)選地，步驟(1)中初篩液體培養(yǎng)基組成為新鮮海藻渣與蒸餾水按1:1重量比混合后打成勻漿，PH7.2-7.5 ；
[0016]優(yōu)選地，步驟(2)中復(fù)篩培養(yǎng)基組成為:海藻酸鈉I重量份，添加1-5重量份硫酸銨，1-5重量份氯化鈉，1-5重量份KH2PO4,0.1-0.5重量份MgSO4.7H20,0.1-0.5重量份CaCO3，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.2-7.5。
[0017]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案之二，是提供上述淡紫灰鏈霉菌在制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用。
[0018]優(yōu)選地，所述海藻·微生物肥料中淡紫灰鏈霉菌的有效活菌數(shù)> 1.0X 101(lCFU/g。
[0019]優(yōu)選地，所述海藻微生物肥料對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、串珠鐮刀菌、蘋果黑腐皮殼菌、小麥根腐病菌、玉米小斑病菌、禾生炭疽病菌有抑菌活性。
[0020]本發(fā)明通過固態(tài)淺盤發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵能夠高效降解海藻渣的淡紫灰鏈霉菌，使海藻廢渣中的難以被農(nóng)作物利用的營養(yǎng)物質(zhì)通過微生物的分解代謝，轉(zhuǎn)化為易被植物吸收的小分子活性物質(zhì)，同時所得海藻微生物肥料還含有高活菌數(shù)的生防放線菌淡紫灰鏈霉菌(保藏號為CGMCC N0.7548)及其代謝活性物質(zhì)，實現(xiàn)了傳統(tǒng)海藻有機肥與活菌制劑的有機結(jié)
八
口 ο
[0021]在本發(fā)明中，首先利用海藻渣篩選出不僅能夠高效降解海藻渣，同時對農(nóng)作物具有抗病促生功能的生防放線菌淡紫灰鏈霉菌，繼而對該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及固態(tài)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，通過淺盤發(fā)酵的方式進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)，獲得海藻活性微生物肥料。利用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品不僅具有傳統(tǒng)的海藻有機肥所含的海藻活性物質(zhì)，而且具有活菌制劑的活體調(diào)節(jié)功能，在促進(jìn)生長、改良土壤、增強作物抗逆性方面效果顯著。
[0022]本發(fā)明具有的有益效果:
[0023](I)所用的生防菌淡紫灰鏈霉菌對海藻渣的降解效果突出，其發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗生素類代謝活性物質(zhì)不僅能夠有效抑制多種致病微生物的生長，而且具有良好的促生增產(chǎn)功效，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中效果顯著。
[0024](2)變廢為寶，將海洋藻類特有的營養(yǎng)活性物質(zhì)與活菌制劑有效結(jié)合，補充單一產(chǎn)品的不足。
[0025](3)海藻廢渣價格低廉，處理工藝簡單，便于進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。
[0026](4)淺盤固態(tài)發(fā)酵過程粗放，對設(shè)備無菌條件要求低，而且后處理簡便，無廢水廢料生成，投資少、能耗低、無污染、易操作。
[0027](5)發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計合理，目標(biāo)菌株容易生長，培養(yǎng)周期短，有效活菌數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于液態(tài)發(fā)酵，達(dá)到1.0X101QCFU/g以上。
【具體實施方式】
[0028]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0029](一)淡紫灰鏈霉菌(STREPTOMYCESLAVENDULAE) CGMCC N0.7548 的獲得方法:
[0030](1)樣品收集
[0031]從青島明月海藻集團原料存放處取樣，選取泡葉藻、馬尾藻、海帶等藻類的腐爛部位作為待篩分樣品，用牛皮紙袋裝好，得到6個待篩樣品；
[0032](2)初篩培養(yǎng)基配制
[0033]取新鮮的海藻渣150g，加入150ml蒸餾水，用打漿機打成勻漿，調(diào)節(jié)pH至7.5，分裝至250ml三角瓶中，每瓶50ml，滅菌后備用。
[0034](3)富集培養(yǎng)
[0035]用接種環(huán)分別從6個樣品中挑取腐爛部位接種至步驟(2)中三角瓶中，28°C、180rpm搖床培養(yǎng)72h，得富集后的發(fā)酵液；
[0036](4)復(fù)篩培養(yǎng)基配制
[0037]稱取海藻酸鈉lg，硫酸銨3g，氯化鈉lg，磷酸氫二鉀lg，硫酸鎂0.2g,碳酸鈣
0.2g，用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5，最后加入3.6g瓊脂粉,滅菌后倒平板備用；
[0038](5)菌種復(fù)篩
[0039]取步驟(3)中所得發(fā)酵液，10倍梯度稀釋法稀釋，取10' 10_4、10_5、10_6稀釋度，在步驟(4)中所得培養(yǎng)基平板上涂布，做3個重復(fù)，分別置于25°C、30°C及37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0040](6)分離純化
[0041]從步驟(5)中培養(yǎng)好的平板上挑選菌落周圍透明圈大的菌株，進(jìn)一步在復(fù)篩培養(yǎng)基上劃線分離，得到I株水解圈直徑遠(yuǎn)大于其它菌落的菌株，通過革蘭氏染色鏡檢及菌落形態(tài)特征觀察，初步判定為一株放線菌。
[0042](7)菌種鑒定
[0043]對步驟(6)中所得菌株進(jìn)行生理生化、16sRNA序列測定及分析，鑒定結(jié)果為一株淡紫灰鏈霉菌，并申請到保藏號為CGMCC N0.7548。
[0044](二)淡紫灰鏈霉菌(STREPTOMYCES LAVENDULAE) CGMCC N0.7548 的培養(yǎng)方法:
[0045](I)培養(yǎng)基
[0046]該菌株的活化及種子液培養(yǎng)均選用高氏I號培養(yǎng)基；
[0047](2)培養(yǎng)條件
[0048]該菌株最適生長溫度為28°C，最適pH為7.2，高氏I號平板培養(yǎng)48h可見明顯菌落；搖瓶培養(yǎng)裝液量為20%，搖床轉(zhuǎn)速120-150rpm，一般60h左右可達(dá)到接種要求；
[0049](三)淡紫灰鏈霉菌(STREPTOMYCESLAVENDULAE) CGMCC N0.7548 的具體特征:
[0050](I)菌落特征
[0051]該菌株在高氏合成I號瓊脂中氣生菌絲淡紫色，基內(nèi)菌絲麥桿黃色；馬鈴薯浸汁瓊脂中氣生菌絲豆蘧紫色，基內(nèi)菌絲褐色；淀粉瓊脂中氣生菌絲淡紫色，基內(nèi)菌絲杏仁黃色；察氏瓊脂中氣生菌絲紫色，基內(nèi)菌絲白色；葡萄糖天門冬素瓊脂中氣生菌絲灰白色，基內(nèi)菌絲黃色。
[0052]該菌株氣生菌絲和基內(nèi)菌絲顏色變化均不明顯，但在同種培養(yǎng)基上氣生菌絲和基內(nèi)菌絲之間顏色變化較大；僅在土豆培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色的可溶性色素，而在其他培養(yǎng)基上無色素產(chǎn)生。
[0053](2)生理生化特性
[0054]該菌株能夠使淀粉水解，能使明膠液化，不能分解纖維素，不產(chǎn)生硫化氫和黑色素，能夠使硝酸鹽還原，能夠使牛奶凝固與凍化，能夠利用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露醇、麥芽糖，不能利用阿拉伯糖和鼠李糖。
[0055](四)利用淡紫灰鏈霉菌生產(chǎn)海藻微生物肥料的工藝過程:
[0056]( I)海藻渣預(yù)處理
[0057]取樣檢測 并調(diào)節(jié)海藻加工后產(chǎn)生的海藻渣的含水量；
[0058]( 2 )發(fā)酵培養(yǎng)基配制及滅菌
[0059]取步驟(1)所得海藻渣750重量份，添加200-300重量份麩皮，50-100重量份稻殼，5-10重量份硝酸鉀，15-20重量份可溶性淀粉，0.5-1重量份KH2PO4,0.05-0.1重量份MgSO4,調(diào)節(jié)pH至7-8 ;分裝至發(fā)酵專用淺盤中，表面用6層紗布覆蓋，高壓蒸汽滅菌；
[0060](3)接種并發(fā)酵
[0061]將淡紫灰鏈霉菌(保藏號為CGMCC N0.7548)接種到步驟(2)所得培養(yǎng)基中，恒溫室中進(jìn)行發(fā)酵；
[0062]( 4 )干燥粉碎及包裝
[0063]將步驟(3)發(fā)酵結(jié)束所得產(chǎn)物熱風(fēng)烘干，粉碎后計量包裝，即得海藻微生物菌劑。
[0064]實施例1
[0065]( I)海藻渣預(yù)處理
[0066]取海藻加工后產(chǎn)生的新鮮海藻渣，測定其含水量，采用補水或晾曬的方式調(diào)節(jié)其含水量在55%-60%左右。
[0067](2)發(fā)酵培養(yǎng)基配制
[0068]取步驟(1)準(zhǔn)備好的海藻渣500kg，添加150kg麩皮(30%，W/W)，50kg稻殼(10%，W/W)，5kg 硝酸鉀(1%，W/W)，10kg 可溶性淀粉(2%，ff/ff), KH2PO4 (0.1%，W/W) 0.5kg, MgSO4(0.01%,ff/ff)0.05kg, pH用氨水調(diào)節(jié)，在混料設(shè)備中不停攪拌，要求物料濕潤但不結(jié)塊，直至呈均勻松散狀，pH穩(wěn)定在7.5。
[0069](3)培養(yǎng)基分裝及滅菌
[0070]將步驟(2)中所得培養(yǎng)基均勻分裝至發(fā)酵專用淺盤中，裝料厚度5cm，表面覆蓋六層紗布，121°C高壓蒸汽滅菌，保溫30min，滅菌結(jié)束后及時將托盤取出攤開，降溫走水。
[0071](4)菌種活化及接種
[0072]將沙土管保存的菌種放置在4°C冰箱中解凍，然后采用平板劃線的方式接到高氏一號培養(yǎng)基平板上，置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，然后挑取平板上長勢較好的單菌落接種在滅菌好的液體搖瓶培養(yǎng)基中，280C、120rpm往復(fù)式搖床培養(yǎng)60h。種子液要求鏡檢菌絲生長旺盛，孢子剛剛開始脫落，發(fā)酵液內(nèi)菌絲松散不成團，有效活菌數(shù)達(dá)到LOXIO8CFu/ml以上。接種量10%，接種后劃盤翻動均勻，使物料疏松透氣，菌種與物料充分接觸。
[0073](5)發(fā)酵工藝參數(shù)
[0074]將接種后的托盤置于30°C恒溫發(fā)酵室中，通風(fēng)培養(yǎng)，每隔4h劃盤翻料，以保證整個發(fā)酵過程中的氧氣供應(yīng)。
[0075]分別在發(fā)酵36h、48h、60h、72h取樣檢測，鏡檢菌體形態(tài)及孢子形成情況，一般在72h左右發(fā)酵結(jié)束。
[0076](6)干燥篩分
[0077]發(fā)酵結(jié)束后將物料攤薄，75°C熱風(fēng)干燥6h左右，至水分降至10%以下即可。
[0078](7)檢測及包裝
[0079]隨機抽取干燥后的產(chǎn)品，按照GB20287-2006的規(guī)定及相關(guān)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)提供的檢測方法檢測海藻渣發(fā)酵后部分營養(yǎng)物質(zhì)含量的變化，結(jié)果見表1。
[0080]表1海藻渣發(fā)酵后部分營養(yǎng)物質(zhì)含量變化
[0081]
【權(quán)利要求】
1.一種淡紫灰鏈霉菌菌株，其特征在于，其分類命名為淡紫灰鏈霉菌(STREPTOMYCESLAVENDULAE),已于2013年05月03日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏編號為CGMCC N0.7548。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的淡紫灰鏈霉菌在利用海藻渣制備海藻微生物肥料中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淡紫灰鏈霉菌在制備海藻微生物肥料的應(yīng)用，其特征在于，所述海藻微生物肥料中淡紫灰鏈霉菌的有效活菌數(shù)> 1.0X 101(lCFU/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的淡紫灰鏈霉菌在制備海藻微生物肥料的應(yīng)用，其特征在于，所述海藻微生物肥料對立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、串珠鐮刀菌、蘋果黑腐皮殼菌、小麥根腐病菌、玉米 小斑病菌、禾生炭疽病菌有抑菌活性。
【文檔編號】C12N1/20GK103540556SQ201310560255
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年11月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月12日
【發(fā)明者】趙宏濤, 李麗, 王鵬, 李園園, 公春艷 申請人:青島明月藍(lán)海生物科技有限公司