水仙bes-ssr標(biāo)記引物cataca5及鑒定水仙品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5及鑒定水仙品種的方法，包括水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5的設(shè)計(jì)及合成、水仙基因組總DNA提取、PCR總反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測鑒定。本發(fā)明采用水仙基因組BAC-末端序列開發(fā)的水仙BES-SSR標(biāo)記，具有準(zhǔn)確性高、容易判斷，重復(fù)性好，不受環(huán)境因素的影響，而且譜帶清晰等特點(diǎn)，是一種有效可靠的分子標(biāo)記，用于水仙種質(zhì)鑒定，具有取樣量小、操作方便、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5還可用于水仙品種指紋圖譜繪制、遺傳多樣性分析、群居遺傳結(jié)構(gòu)研究和遺傳連鎖圖譜分析等【技術(shù)領(lǐng)域】。
【專利說明】水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5及鑒定水仙品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種BES-SSR標(biāo)記引物及其用于作物品種鑒定的方法，具體涉及水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5及鑒定水仙品種的方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】[0002]水仙為石蒜科水仙屬i^arcissus L.、多年生球根花丼,大多數(shù)原產(chǎn)于地中海沿岸及歐洲中部地區(qū)，約有40個(gè)原生種和許多變種，據(jù)英國皇家園藝學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)約有I萬多個(gè)園藝品種，其花色、花姿十分豐富，且部分水仙具宜人的香味，已成為世界各國廣泛栽培的著名觀賞兼藥用花卉。然而，水仙具有夏季休眠特性，每年開花一次，從花型花色方面鑒定周期較長，耗時(shí)耗力，其鱗莖和葉型也十分相似，很難從生物學(xué)性狀上將其有效地區(qū)分開來，對(duì)水仙的品種選育及鑒定方面都有著嚴(yán)重的影響。
[0003]陳林姣等(2002年)，朱震霞(2003 年)，Tucci 等(2004 年)，Lu Gang 等(2007)，鄭琴芳等(2012年)利用第一代分子標(biāo)記技術(shù)RAPD、ISSR、AFLP對(duì)中國水仙及水仙的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行了不同程度的分析；Hodgins等(2007年)以歐洲野生黃花水仙為材料，利用富集文庫篩選法得到8個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，其操作較為復(fù)雜且費(fèi)用較為昂貴；袁菊紅(2011年)利用得到的10對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)中國石蒜屬遺傳多樣性和親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，其實(shí)驗(yàn)材料中涉及中國水仙且擴(kuò)增出了帶型。現(xiàn)有的基于水仙屬的分子標(biāo)記數(shù)量了了可見，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足水仙屬分子生物學(xué)的研究，這將嚴(yán)重制約了水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性分析的準(zhǔn)確性和遺傳圖譜構(gòu)建的精確性?？梢?，開發(fā)新的分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，對(duì)水仙種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析研究，為水仙新品種選育上提供有效的技術(shù)支持，在水仙育種及種質(zhì)鑒定方面有著十分重要的意義。
[0004]但是，現(xiàn)有的第一代分子標(biāo)記如:擴(kuò)增的限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記(amplified fragment length polymorphism, AFLP),第一步需要制備高分子量基因組DNA，然后酶切找到特異片段，實(shí)驗(yàn)程序繁瑣，操作復(fù)雜；限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性標(biāo)記(restriction fragment length polymorphism, RFLP),技術(shù)難度大，操作復(fù)雜,所需 DNA質(zhì)量高，要經(jīng)過Southern雜交且需選用單拷貝探針，標(biāo)記數(shù)量少且多態(tài)性較低；隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(randomly amplified polymorphic DNA, RAPD)和簡單序列重復(fù)標(biāo)記(inter-simple sequence repeat, ISSR) 二者均為顯性,不能區(qū)分是純合還是雜合個(gè)體，且RAPD重復(fù)性較低，對(duì)DNA模板的質(zhì)量要求很高，而水仙屬植物葉片和鱗莖中含有大量的多糖多酚類物質(zhì)，這將對(duì)DNA提取增加了難度，所以此法不適用于水仙標(biāo)記分析。
[0005]簡單重復(fù)序列(simple sequence repeat, SSR) 或稱為微衛(wèi)星DNA(microsatellite DNA),又稱為短串聯(lián)重復(fù)(short tandem repeats, STR)是指一類由幾個(gè)(多為1-6個(gè))堿基組成的基序(motif)串聯(lián)而成的DNA序列，為第二代普遍認(rèn)可的新型分子標(biāo)記技術(shù)，其隨機(jī)廣泛分布于各類真核生物基因組的不同位置，大約每隔10_50kb的DNA序列中就會(huì)出現(xiàn)一個(gè)SSR位點(diǎn)。SSR標(biāo)記具有高度的多態(tài)性且分布于整個(gè)基因組中，用于檢測簡單易操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性高，所需模版DNA量少，僅需微量組織或者干組織樣品，便于數(shù)據(jù)比較分析，SSR遵循孟德爾共顯性遺傳模式，能夠區(qū)別純合顯性個(gè)體和雜合顯性個(gè)體等諸多有點(diǎn)。目前SSR標(biāo)記技術(shù)已成為構(gòu)成遺傳連鎖圖譜、研究群體遺傳學(xué)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測、目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選和法醫(yī)鑒定的理想工具，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于擬南芥、大豆、棉花、花生、葡萄、小麥、水稻、番茄、甜菜和油菜等多種植物上。
[0006]目前，開發(fā)的SSR標(biāo)記主要有G-SSR (基因組SSR)和EST-SSR (表達(dá)序列標(biāo)簽SSR)兩種，而現(xiàn)有的水仙EST數(shù)據(jù)庫中登錄的水仙EST序列還很少，開發(fā)SSR標(biāo)記遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，且利用EST序列開發(fā)獲得的SSR標(biāo)記多態(tài)性較基因組SSR標(biāo)記低，因此利用水仙基因組中獲取SSR位點(diǎn)信息，開發(fā)基于水仙基因組的SSR標(biāo)記引物對(duì)水仙種質(zhì)鑒定和遺傳多樣性分析等領(lǐng)域提供有效的標(biāo)記技術(shù)，迫在眉睫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供了一種水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5及鑒定水仙品種的方法。所述水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，是利用水仙BAC-末端序列獲得水仙SSR位點(diǎn)信息CATACA5，在其位點(diǎn)兩翼保守區(qū)設(shè)計(jì)特有的SSR標(biāo)記引物。
[0008]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下:
本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，由上游引物CATACA5 F和下游引物CATACA5R組成，其核苷酸序列如下:
CATACA5 F: 5’-GACATTTCCATTTACGTGTCTG
CATACA5 R: 5’-AGAAAACATCAGGTCTCAACT。
[0009]利用本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5鑒定水仙品種的方法，包括水仙基因組總DNA提取、PCR總反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測鑒定，其特征在于:
1、水仙基因組總DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因組總DNA；
2、PCR總反應(yīng)體系建立:水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5BES-SSR-PCR總反應(yīng)體系20ul:供鑒定的水仙基因組總 DNA 50ng, 10XPCR Buffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul,lOmmol/L 水仙 CATACA5 上下游引物各 1.0ul，5U/L Taq DNA 聚合酶 0.2ul，無菌 ddH2012.8ul ;所述供鑒定的水仙，本發(fā)明共提供24份水仙品種樣品；
3、PCR擴(kuò)增程序:水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5BES-SSR-PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4min，94°C變性 30s, 52°C退火 30s, 72°C 延伸 45s，共 35 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 IOmin, 4°C保存；
4、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件=IXTBE電泳緩沖液，8%(v/v)的聚丙烯酰胺凝膠，在電壓400V,電流IOOmA下電泳3.0h后用銀染法染色，經(jīng)ImageScanner III凝膠掃描儀掃描保存；所述8%(v/v)聚丙烯酰胺凝膠，即30%(29:1，w/v)丙烯酰胺/雙丙烯酰胺14ml，5 X TBE 10ml，ddH20 26ml, 10% (w/v)過硫酸銨 250ul，TEMED IOOul ;銀染法染色，即 10%(v/v)醋酸固定20min, ddH20沖洗IOmin, 0.2%(w/v)硝酸銀溶液染色30min, ddH20沖洗5s,用含100g/L無水碳酸鈉、2ml/L甲醒和8mg/L硫代硫酸鈉的顯影液顯影；
5、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測鑒定:利用水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，對(duì)24份水仙的樣品進(jìn)行品種鑒定，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的PCR擴(kuò)增圖譜中，在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國多花水仙金盞銀臺(tái)；在分子量為109bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國多花水仙重瓣玉玲瓏；在分子量為234bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Replete ;在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量為112bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋多花水仙Jetf ire ;在分子量為129bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量為262bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，貝U該品種為西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量為168bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量為114bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋紅口水仙Recurvus ;在分子量為254bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量為277bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋三蕊水仙Thalia ;在分子量為173bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量為98bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙WhiteFavourite ;在分子量為146bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋長壽花水仙SilverSmiles ;在分子量為261bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Pink Charm ;在分子量為164bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Johann Strauss ;在分子量為115bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量為244bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Dutch Master ;在分子量為108bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,貝U該品種為西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量為222bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Daydream ;在分子量為174bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋仙客來水仙Tete-a-Tete ;在分子量為253bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Bella Vista ;在 分子量為281bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Carlton。
[0010]本發(fā)明采用水仙基因組BAC-末端序列，設(shè)計(jì)獲得的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，具有重復(fù)性好，譜帶清晰，多態(tài)性高等特點(diǎn)；用于水仙品種鑒定，結(jié)果有效可靠；可以用于水仙種質(zhì)鑒定、品種指紋圖譜繪制、遺傳多樣性分析、群居遺傳結(jié)構(gòu)研究和遺傳連鎖圖譜分析。
[0011]綜上所述，本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，具有如下有益效果:
O使用本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，在水仙品種之間有很好的多態(tài)性，且譜帶清晰，穩(wěn)定可靠；也可以將本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5用于更多的水仙屬植物的種質(zhì)資源鑒定和遺傳多樣性分析。
[0012]2 )本發(fā)明的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，是基于水仙基因組BAC-末端序列開發(fā)的，因此多態(tài)性更高，在對(duì)水仙的種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析方面可以提供更有效的技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5對(duì)提供鑒定的24份水仙品種的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測圖。各泳道中，M代表分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_24表示24份提供鑒定的水仙品種。
【具體實(shí)施方式】
[0014]為了進(jìn)一步闡明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明，以下結(jié)合具體實(shí)施例加以說明。[0015]實(shí)施例1利用水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5鑒定水仙品種的方法
利用水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5鑒定水仙品種的方法，包括水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5設(shè)計(jì)及合成、水仙基因組總DNA提取、PCR總反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和水仙品種鑒定。
[0016]1.水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5設(shè)計(jì)及合成:根據(jù)水仙BES-SSR位點(diǎn)搜索的結(jié)果，設(shè)計(jì)合成水仙CATACA5 BES-SSR的標(biāo)記引物為:
CATACA5 F: 5’-GACATTTCCATTTACGTGTCTG CATACA5 R: 5’-AGAAAACATCAGGTCTCAACT ;
具體方法如下:依據(jù)水仙基因組BAC-末端序列，利用SSR Hunter分析軟件(微衛(wèi)星檢索工具)搜索SSR位點(diǎn)信息，設(shè)定參數(shù)值:二、三、四、五和六核苷酸基序的最小重復(fù)次數(shù)分別為7、5、5、5和5次。根據(jù)得到的SSR位點(diǎn)信息及其側(cè)翼序列(上下游各150bp)篩選并剔除冗余序列。根據(jù)水仙BES-SSR位點(diǎn)搜索，篩選得到的水仙SSR位點(diǎn)及其側(cè)翼序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)每個(gè)SSR位點(diǎn)PCR擴(kuò)增引物，引物設(shè)計(jì)參數(shù)要求:引物長度控制于18bp-24bp，最適長度21bp ;退火溫度48°C -56°C，最適52°C;上下游引物退火溫度之差不高于3°C ；GC含量35%-60%，最適50% ;水仙BES-SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段100_400bp。引物設(shè)計(jì)完成后，送上海鉬尚生物公司合成并得到水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5。
[0017]2.水仙基因組總DNA提取
(I)經(jīng)采樣收集各地水仙共24個(gè)品種，每個(gè)品種隨機(jī)抽取5片靠鱗莖中部幼嫩葉片，用雙蒸水洗凈后剪碎混勻，經(jīng)液氮處理后保存?zhèn)溆谩?br> [0018](2)采用改良的CTAB法(Stewart等人，1993)提取經(jīng)上述步驟處理的24份供試水仙品種總DNA，所述24個(gè)品種如表2所示。
[0019]表2 24份供鑒定水仙品種`及編號(hào)
【權(quán)利要求】
1.一種水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，由上游引物CATACA5F和下游引物CATACA5R組成，其特征在于核苷酸序列如下:
CATACA5 F: 5’-GACATTTCCATTTACGTGTCTG
CATACA5 R: 5’-AGAAAACATCAGGTCTCAACT。
2.利用如權(quán)利要求1所述的水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5鑒定水仙品種的方法，包括水仙基因組總DNA提取、PCR總反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測鑒定，其特征在于: (1)水仙基因組總DNA提取:利用改良的CTAB法提取水仙基因組總DNA； (2)PCR總反應(yīng)體系建立:總反應(yīng)體系20ul:供鑒定的水仙基因組總DNA 50ng，IOXPCRBuffer 2ul, 10mmol/L dNTPs 0.5ul，lOmmol/L水仙 CATACA5 上下游引物各 1.0ul，5U/L TaqDNA聚合酶0.2ul，無菌ddH20 12.8ul ;所述供鑒定的水仙，本發(fā)明共提供24份水仙品種樣品; (3)PCR擴(kuò)增程序:94°C預(yù)變性4min，94°C變性30s，52°C退火30s，72°C延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10min，4°C保存； (4)聚丙烯酰胺凝膠電泳條件:1XTBE電泳緩沖液，體積比為8%的聚丙烯酰胺凝膠，在電壓400V,電流IOOmA下電泳3.0h后用銀染法染色,經(jīng)ImageScanner III凝膠掃描儀掃描保存； (5)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測鑒定:利用水仙BES-SSR標(biāo)記引物CATACA5，對(duì)24份水仙的樣品進(jìn)行品種鑒定，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的PCR擴(kuò)增圖譜中，在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國多花水仙金盞銀臺(tái)；在分子量為109bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國多花水仙重瓣玉玲瓏；在分子量為234bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Replete ;在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋小冠水仙Alltruist ;在分子量為112bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Jetfire ;在分子量為129bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Tahiti ;在分子量為262bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋裂冠水仙Orangerie ;在分子量為168bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋重瓣水仙Yellow Cheerfulness ;在分子量為114bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋紅口水仙Recurvus ;在分子量為254bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Erlicheer ;在分子量為277bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋三蕊水仙Thalia;在分子量為173bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Mount Hood ;在分子量為98bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙White Favourite ;在分子量為146bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋長壽花水仙Silver Smiles ;在分子量為261bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙PinkCharm ;在分子量為164bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Johann Strauss ；在分子量為115bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋小冠水仙Barret Browning ;在分子量為244bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋喇機(jī)水仙Dutch Master ;在分子量為108bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,則該品種為西洋大冠水仙Fortissimo ;在分子量為222bp的位置出現(xiàn)DNA條帶,貝U該品種為西洋大冠水仙Daydream ;在分子量為174bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Gay Tabor ;在分子量為122bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋仙客來水仙Tete-a-Tete ;在分子量為253bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Bella Vista ;在分子量為281bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，貝U該品種為西洋大冠水仙 Carlton0
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK103589798SQ201310560714
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】潘東明, 祁世明, 郭志雄, 林琳, 潘騰飛 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)