一種利用ssr分子標(biāo)記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用SSR分子標(biāo)記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。所述SSR分子標(biāo)記引物體系包括33對(duì)Las-SSR可用引物，其中18對(duì)為SSR核心引物。本發(fā)明首次提出了基于SSR分子標(biāo)記并結(jié)合PAGE電泳分析柑橘黃龍病菌亞洲種（Ca.L.asiaticus）菌株多樣性的方法，該方法簡(jiǎn)單、方便、分析效率高，為黃龍病分子流行學(xué)的研究奠定了分子基礎(chǔ)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種利用SSR分子標(biāo)記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種利用SSR分子標(biāo)記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]柑橘黃龍病是危及世界和我國(guó)多個(gè)柑橘產(chǎn)區(qū)的最主要的病害。該病害最早在我國(guó)廣東發(fā)現(xiàn)，至今已有近百年歷史。目前，黃龍病在亞洲和非洲廣泛分布，在大洋洲、南美洲和北美洲的部分柑橘主產(chǎn)區(qū)也嚴(yán)重發(fā)生，已報(bào)道在50多個(gè)國(guó)家和地區(qū)造成了巨大的損失。對(duì)黃龍病病原的認(rèn)識(shí)經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的時(shí)間，目前普遍認(rèn)為黃龍病是由限制于寄主植物韌皮部、不可體外培養(yǎng)的革蘭氏陰性細(xì)菌Libriacter spp.)引起的。6?.L.spp包含3個(gè)亞種:亞洲種H L.asiaticus)、非洲種{Ca.L.africanus)、和美洲種H L.americanus)。其中亞洲種(6?.L.asiaticus)為世界范圍內(nèi)流行范圍最廣、致病力最強(qiáng)的種群。我國(guó)發(fā)現(xiàn)的所有黃龍病相關(guān)病原均屬于亞洲種(fe.L.asiaticus)。
[0003]目前已成功地完成了 2個(gè)亞洲種(6?.L.asiaticus)菌株的全基因組測(cè)序。2009年公布了一個(gè)從攜毒柑橘木虱Psy62中獲得的大小為1.23 Mb的亞洲種(fe.L.asiaticus)全基因組序列(Genebank ID: gb I CP001677.5);2013 年，Genebank 上又公布了一個(gè)來(lái)自中國(guó)廣西的柑橘黃龍病菌亞洲種iCa.L.菌株的基因組(GenebankID: gb I CP004005.1)，大小為1.27 Mb。在Psy62菌株的全基因組序列公布以后，Liu等分析了中國(guó)云南和廣東兩個(gè)省的柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株中的前噬菌體特異引物766F/R的擴(kuò)增結(jié)果，首次報(bào)道中國(guó)菌株的地區(qū)變異性(Liu et al., 2011)?？?7基因的限制性酶切多態(tài)性也證明了菌株的多態(tài)性與地域相關(guān)(Hu et al., 201 D0Wang等分析262個(gè)分別來(lái)自中國(guó)和美國(guó)的菌株某區(qū)域(CLIBASIA_ 05640- CLIBA SIA_05650)的電泳條帶類(lèi)型譜，發(fā)現(xiàn)2個(gè)國(guó)家之間及中國(guó)的云南和廣東兩省之間的菌株具有多態(tài)性，指出基因的插入和缺失突變是菌株遺傳多樣性的重要依據(jù)(Wang et al., 2012)。Zhou報(bào)道了基因組中的另兩個(gè)高度變異的前噬菌體基因，并利用這兩個(gè)基因分析來(lái)自不同國(guó)家的32個(gè)菌株，得出菌株多態(tài)性與地域差異相關(guān)的結(jié)論(Zhou et al., 2011)。
[0004]柑橘黃龍病菌株的地區(qū)差異性和遺傳多樣性一方面曾經(jīng)引起黃龍病起源的爭(zhēng)議，另一方面對(duì)于該病害在不同地域間的流行和傳播也曾一度引起熱議。柑橘生產(chǎn)實(shí)踐者或研究者甚至發(fā)現(xiàn)柑橘黃龍病菌亞洲種在曾經(jīng)流行過(guò)美洲種的地區(qū)大勢(shì)流行，造成嚴(yán)重的危害。因此，基于病原分子多樣性的病原流行趨勢(shì)分析具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前常用的遺傳多樣性分析都是基于常規(guī)PCR技術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳及序列測(cè)定來(lái)實(shí)現(xiàn)的。但是常規(guī)PCR通常設(shè)置較大的(20 μ L ^25 μ L)的體系，浪費(fèi)大量的試劑和實(shí)驗(yàn)材料(尤其是各種PCR酶價(jià)格比較昂貴，另外需要從國(guó)外取得的實(shí)驗(yàn)材料更加珍貴)；并且普通瓊脂糖凝膠電泳的分辨率比較低；另外，序列測(cè)定需要用到高精度的大型測(cè)序儀，批量測(cè)序價(jià)格昂貴。因此，尋找出一種簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、高效的鑒定柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法具有非常重要的理論和實(shí)踐意義。
[0005]簡(jiǎn)單串聯(lián)重復(fù)序列(Simple sequence repeat, SSR)也叫微衛(wèi)星標(biāo)記(Microsatellite),是基于某一物種已知基因組的、以一定數(shù)目核苷酸(1、個(gè)堿基對(duì))2次以上重復(fù)排列的長(zhǎng)達(dá)幾十到幾百個(gè)核苷酸的序列。SSR標(biāo)記因重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性高且在基因組中普遍存在的優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于植物遺傳圖譜的構(gòu)建、品種鑒定、遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。雖然遺傳標(biāo)記在許多模式植物上已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但在植物病原細(xì)菌上還是方興未艾。植物病原細(xì)菌的遺傳方式完全不同于植物，細(xì)菌的遺傳并不涉及菌株的雜交，另一方面，細(xì)菌核酸的獲得需要克服人工培養(yǎng)的障礙，因此想要利用SSR分子標(biāo)記的方法來(lái)分析植物病原細(xì)菌的遺傳多樣性，還需克服一系列的技術(shù)問(wèn)題。
[0006]柑橘黃龍病菌目前還不能進(jìn)行體外培養(yǎng)，無(wú)法提取純病菌的核酸。目前還沒(méi)有簡(jiǎn)單有效的遺傳多樣性分析方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的技術(shù)不足，提供一套用于柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的SSR分子標(biāo)記引物體系。
[0008]本發(fā)明另一目的在于提供一種利用上述SSR分子標(biāo)記引物體系鑒定和分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法。
[0009]本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明提供了一種柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析SSR分子標(biāo)記引物體系，所述SSR分子標(biāo)記引物體系包括33對(duì)Las-SSR可用引物，分別為L(zhǎng)as_ssrf Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示；
其中有 18 對(duì)為 SSR 核心引物，分別是 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0010]所述SSR分子標(biāo)記引物體系構(gòu)建方法步驟如下:
51.柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)全基因組序列的獲得:從Genebank中下載得到2個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株序列，Genebank ID分別為gb I CP001677.5和gb I CP004005.1，分別為采自美國(guó)佛羅里達(dá)州Psy62菌株和中國(guó)廣西gxpsy菌株的基因組序列；
52.全基因組序列中SSR位點(diǎn)的鑒定:利用SSR檢索軟件TandemRepeats Finder(version 4.07b)獲得了 36個(gè)含有SSR位點(diǎn)信息的序列；具體是利用Tandem PepeatsFinder (version 4.07b)在線(xiàn)軟件掃描分析候選的SSR位點(diǎn)信息,將得到的結(jié)果進(jìn)行篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn):(I)若匹配率(Percent Matches)為100%，則重復(fù)單元的重復(fù)長(zhǎng)度為2 bp^lObp ;(2)若Percent Matches介于90%和100%之間，則重復(fù)單元的最小重復(fù)長(zhǎng)度為10 bp ；
(3)重復(fù)數(shù)大于等于2 ;
53.根據(jù)S2得到的含有SSR位點(diǎn)的序列,利用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPremier 5.0合成SSR引物，得到36對(duì)Las-SSR引物(如表1所示)，引物設(shè)計(jì)參數(shù)主要包括:引物長(zhǎng)度為15 bp~25 bp，退火溫度為45°C~65°C，GC含量為 40%~65%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp~600 bp,其中Las-ssr28位點(diǎn)的序列總長(zhǎng)度大于600 bp，其預(yù)測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1742 bp ；
54.用普通PCR的方法驗(yàn)證S3得到的36對(duì)Las-SSR引物的特異性:選取I個(gè)黃龍病柑橘葉片樣品(陽(yáng)性)和I個(gè)健康柑橘樣品(陰性)，剪取0.15 g柑橘葉片中脈，磨碎后用OMEGA公司的植物DNA提取試劑盒(產(chǎn)品號(hào)D2485-02)提取基因組總DNA。陽(yáng)性樣品中包含柑橘基因組DNA和柑橘黃龍病菌亞洲種(6?.L.asiaticus)基因組DNA。利用1% (w/v)的瓊脂糖凝膠檢測(cè)提取的DNA的質(zhì)量。以上述2個(gè)DNA樣品為模板，分別用所有設(shè)計(jì)的SSR引物進(jìn)行篩選；陽(yáng)性樣品能擴(kuò)增出目的片段而陰性樣品不能擴(kuò)增出該片段的引物為可用引物。篩選得到33對(duì)具有高穩(wěn)定性、高擴(kuò)增效率和較強(qiáng)特異性的Las-SSR可用引物(如表1中所示的33對(duì)可用引物)；
55.利用S4篩選到的33對(duì)Las-SSR可用引物對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.進(jìn)行遺傳多樣性分析:以柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaiicm)陽(yáng)性DNA樣
品為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增；預(yù)測(cè)擴(kuò)增片段小于500bp的PCR產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳，預(yù)測(cè)片段大于1500bp的PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，并測(cè)序比對(duì)；篩選出多態(tài)性非常好的18對(duì)SSR核心引物，其中17對(duì)SSR核心引物的PCR擴(kuò)增片段均小于600bp，用聚丙烯酰胺凝膠電泳即可分辨。只有Las-ssr28預(yù)測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1742 bp，還需使用瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分析。
[0011]步驟S3 所述 36 對(duì) Las-SSR 引物為 Las-ssrl~Las-ssr36，序列如 SEQ ID N0.1~ 72所示。
[0012]步驟S4所述33對(duì)Las-SSR可用引物分別為L(zhǎng)as-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
[0013]步驟S5 所述 18 對(duì) SSR 核心引物分別為 Las-ssrl、Las-ssr3、Las-ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
[0014]本發(fā)明還提供了一種上述SSR分子標(biāo)記引物體系鑒定和分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法，其具體步驟是:
51.實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備:選取典型斑駁癥狀的柑橘葉片，提取柑橘樣品葉中脈總DNA，采用國(guó)際上通用的柑橘黃龍病菌特異引物OIl和0I2c擴(kuò)增16S rDNA片段，檢測(cè)為陽(yáng)性的DNA樣品用于SSR遺傳多樣性分析；
52.以SI獲得的陽(yáng)性的DNA為模板，利用本發(fā)明的SSR分子標(biāo)記引物體系進(jìn)行PCR擴(kuò)
增；
53.對(duì)S2所述PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯色，顯色結(jié)束后，拍照獲取譜帶信息，比較同一 SSR標(biāo)記在不同菌株中的多態(tài)性；
54.結(jié)果統(tǒng)計(jì)及遺傳多樣性分析:讀取S3獲得的譜帶信息，以條帶位置為依據(jù)，最小片段的帶型為“1”，依次遞增；收集所有條帶類(lèi)型信息，使用分析軟件分別計(jì)算SSR標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)頻率(PPB)、Nei’ s基因多樣性指數(shù)(h)和Shannon’s信息指數(shù)(I)，反映菌株的遺傳多樣性；采用相關(guān)軟件方法進(jìn)行分析，獲得UPGMA聚類(lèi)圖。[0015]其中，步驟S2所述PCR擴(kuò)增的體系為15 μ L:包括9.9 μ L滅菌ddH20，1.5 μ L含Mg2+ 的 IOXTaq bufferU.5 μ L 的 2.5 mM 的 dNTPs，0.8μ L 的 10 μ M 正反向引物混合液，20 ng樣品DNA模板及0.2 μ L的2.5 M/μ L Taq DNA聚合酶；
擴(kuò)增程序?yàn)?94°C預(yù)變性5 min ;94°C變性30s、56°C退火40s、72°C延伸45s，循環(huán)35次；72°C 延伸 IOmin ；
步驟S3所述電泳優(yōu)選為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE電泳)，所述顯色為銀染顯色；
步驟S4所述分析軟件優(yōu)選為P0PGENE1.32軟件，所述相關(guān)軟件方法優(yōu)選為PowerMarkV3.0軟件中的N-J聚類(lèi)方法。
[0016]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明提供了柑橘黃龍病菌亞洲種iCa.L.asiaticus)的全套SSR分子標(biāo)記引物體系并篩選出核心引物，結(jié)合PAGE電泳的方法為該病原的遺傳多樣性研究開(kāi)辟了新的途徑。與現(xiàn)有技術(shù)一次只能分析一個(gè)遺傳位點(diǎn)多樣性，本發(fā)明一次性涉及全基因組上分布的33個(gè)位點(diǎn)，效率大大提高，且足以對(duì)菌株遺傳多樣性進(jìn)行批量區(qū)分，方法簡(jiǎn)單，步驟少，易于操作，也克服了批量測(cè)序價(jià)格昂貴的問(wèn)題。另外，較小的PCR體系(10 μ Π5 μ L)就能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的，節(jié)省成本和實(shí)驗(yàn)材料，所用的材料均為常規(guī)試劑或裝置，耗資少；數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析借助于已開(kāi)發(fā)的軟件，可一次性處理所有數(shù)據(jù)。同時(shí)，首次結(jié)合PAGE電泳的方法克服了瓊脂糖凝膠電泳分辨率低的問(wèn)題。
[0017]另外，本發(fā)明采用提取感染黃龍病的葉片總DNA的方法，一并提取得到黃龍病菌DNA,設(shè)計(jì)的黃龍病菌特異性引物能避免柑橘基因組DNA的干擾，克服了黃龍病菌無(wú)法獲得純培養(yǎng)等技術(shù)缺陷，具有很好的推廣應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為所有36對(duì)Las-SSR可用引物的常規(guī)PCR篩選結(jié)果；其中“ + ”表示攜帶柑橘黃龍病菌亞洲種(fe.L.asiaticus)的砂糖橘葉中脈DNA，表示健康砂糖橘葉中脈DNA。
[0019]圖2為9對(duì)Las-SSR核心引物擴(kuò)增來(lái)自不同地區(qū)的32個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)菌株的PAGE電泳多態(tài)圖。
[0020]圖3為9對(duì)Las-SSR核心引物擴(kuò)增來(lái)自不同地區(qū)的32個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種(CkL.asiaticus)菌株的PAGE電泳多態(tài)圖。
[0021]圖4為我國(guó)6省的32個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)菌株基于SSR分析的條帶多樣性的聚類(lèi)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)`明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備及方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試劑、設(shè)備及方法。
[0023]實(shí)施例1本發(fā)明Las-SSR分子標(biāo)記引物體系的篩選
1、利用Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中的Genome數(shù)據(jù)庫(kù)，查找得到gb I CPOO1677.5和gb I CP004005.1兩個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種(Ck L.asiaticus)全基因組序列，核苷酸全長(zhǎng)分別為1.23 Mb和1.27 Mb。
[0024]本實(shí)施例所用分析軟件為SSR信息查找軟件Tandem Repeats Finder (version
4.07b)在線(xiàn)分析系統(tǒng)(http://tandem, bu.edu/trf/trf.html)和引物合成軟件 PrimerPremier 5.0。
[0025]實(shí)驗(yàn)方法為常規(guī)PCR、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE )。
[0026]2、利用 SSR 檢索軟件 Tandem Repeats Finder (version 4.07b)查找 2 個(gè)基因組中的所有2-500個(gè)堿基重復(fù)基序的所有SSR位點(diǎn)信息,經(jīng)篩選后得到36個(gè)SSR位點(diǎn)，篩選標(biāo)準(zhǔn):(I)若匹配率(Percent Matches)為100%，則重復(fù)單元的重復(fù)長(zhǎng)度為4 bp-10 bp ；
(2)若Percent Matches介于90%和100%之間，則重復(fù)單元的最小重復(fù)長(zhǎng)度為10 bp ；(3)重復(fù)數(shù)大于等于2。
[0027]用Primer Premier 5.0軟件對(duì)這36個(gè)位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的SSR引物,設(shè)計(jì)得到36對(duì)Las-SSR引物(如表1所示)。引物設(shè)計(jì)參數(shù)主要包括:引物長(zhǎng)度為15 bp~25 bp，退火溫度為450C~65。。，GC含量為40%~65%，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為100 bp~600 bp，其中Las-ssr28位點(diǎn)的序列總長(zhǎng)度大于600 bp，其預(yù)測(cè)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為1742 bp。
[0028]表1本發(fā)明中設(shè)計(jì)合成的柑橘黃龍病菌Las-SSR引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種用于柑橘黃龍病菌遺傳多樣性分析的SSR分子標(biāo)記引物體系，其特征在于，包括 33 對(duì) Las-SSR 可用引物，分別為 Las-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las_ssrl4、Las_ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las-ssr36,引物序列如 SEQ ID N0.1~16、SEQ IDN0.19~28、SEQ ID N0.31~40、SEQ ID N0.43~72 所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述SSR分子標(biāo)記引物體系，其特征在于，所述33對(duì)Las-SSR可用引物中有18對(duì)為SSR核心引物，分別是Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
3.—種權(quán)利要求1或2所述SSR分子標(biāo)記引物體系的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.柑橘黃龍病菌亞洲種全基因組序列的獲得:從Genebank中下載得到2個(gè)柑橘黃龍病菌亞洲種菌株序列，Genebank ID: gb I CP001677.5 和 gb I CP004005.1 ； S2.全基因組序列中SSR位點(diǎn)的鑒定:利用SSR檢索軟件獲得了36個(gè)含有SSR位點(diǎn)信息的序列； S3.根據(jù)S2得到的36個(gè)含有SSR位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)得到36對(duì)Las-SSR引物； S4.用普通PCR的方法驗(yàn)證S3得到引物的特異性，篩選得到33對(duì)Las-SSR可用引物； S5.利用S4篩選到的33對(duì)Las-SSR可用引物對(duì)柑橘黃龍病菌亞洲種進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選得到18對(duì)SSR核心引物； 其中，步驟S3所述36對(duì)Las-SSR引物為L(zhǎng)as-ssrl~Las_ssr36，序列如SEQ ID N0.1~72所示； 步驟S4所述33對(duì)Las-SSR可用引物分別為L(zhǎng)as-ssrl~Las_ssr8、Las-ssrlO~Las-ssrl4、Las-ssrl6~Las_ssr20、Las_ssr22~Las_ssr36，引物序列如 SEQ IDN0.1~16、SEQ ID N0.19~28、SEQ ID N0.31 ~40、SEQ ID N0.43~72 所示； 步驟 S5 所述 18 對(duì) SSR 核心引物分別為 Las-ssrl、Las_ssr3、Las_ssr5、Las_ssr7、Las_ssrl2~14、Las_ssrl8、Las_ssr22、Las_ssr27~29、Las_ssr31 ~36，引物序列如 SEQ IDN0.1~2、SEQ ID N0.5~6、SEQ ID N0.9~10、SEQ ID N0.13~14、SEQ ID N0.23~28、SEQ IDN0.35~36、SEQ ID N0.43~44、SEQ ID N0.53~58、SEQ ID N0.61 ~72 所示。
4.一種利用權(quán)利要求1或2所述SSR分子標(biāo)記引物體系分析柑橘黃龍病菌遺傳多樣性的方法，其特征在于，包括如下步驟: S1.實(shí)驗(yàn)材料的準(zhǔn)備:選取典型斑駁癥狀的柑橘葉片，提取柑橘樣品葉中脈總DNA，采用國(guó)際上通用的柑橘黃龍病菌特異引物OIl和0I2c擴(kuò)增16S rDNA片段，檢測(cè)為陽(yáng)性的DNA樣品進(jìn)行SSR遺傳多樣性分析； S2.以SI獲得的陽(yáng)性的DNA為模板，利用本發(fā)明的SSR分子標(biāo)記引物體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增； S3.對(duì)S2所述PCR擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳、顯色，顯色結(jié)束后，拍照獲取譜帶信息，比較同一 SSR標(biāo)記在不同菌株中的多態(tài)性； S4.結(jié)果統(tǒng)計(jì)及遺傳多樣性分析:讀取S3獲得的譜帶信息，以條帶位置為依據(jù)，最小片段的帶型為“1”，依次遞增；收集所有條帶類(lèi)型信息，使用分析軟件分別計(jì)算SSR標(biāo)記的多態(tài)性位點(diǎn)頻率、Nei's基因多樣性指數(shù)和Shannon’s信息指數(shù)，反映菌株的遺傳多樣性；采用相關(guān)軟件方法進(jìn)行分析，獲得UPGMA聚類(lèi)圖。
5.根據(jù)權(quán)利要求 4所述方法，其特征在于，步驟S3所述電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103667452SQ201310564327
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】許美容, 鄧曉玲, 鄭正, 李昕昱, 洪紅霞, 朱青 申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)