基于熒光定量pcr的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒及方法
【專利摘要】一種基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒及方法。該試劑盒包括8種試劑：裂解液、PCR反應(yīng)液、dNTP混合物、Taq酶液、2×SYBR?Premix?Ex?Taq反應(yīng)預(yù)混液、引物對(duì)、陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照等。本發(fā)明提供了沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)和急性病毒性壞死病毒(AVNV)等5種病原生物的特異引物。本發(fā)明充分利用了熒光定量PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束便可根據(jù)擴(kuò)增曲線即時(shí)判定待檢測(cè)組織樣本中是否含有上述該五種病原中的一種或幾種及其含量，由于提供了退火溫度相近的特異引物，因此能夠同時(shí)對(duì)上述5種病原生物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明能夠快速、特異的完成檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便，具有很高的推廣價(jià)值。
【專利說(shuō)明】基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒及方法，屬于海洋生物病原檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、急性病毒性壞死病毒(AVNV)是最常見(jiàn)的貝類中的主要病原。沙門(mén)氏菌是一種革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌，是常見(jiàn)的人畜共患的腸道致病菌。其廣泛分布于自然界中，能夠引起嚴(yán)重的食物中毒、感染、動(dòng)物性傳播疾病，對(duì)人類和動(dòng)物健康具有極大危害。副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，在富含浮游生物、微粒和幾丁質(zhì)的環(huán)境中能較好生長(zhǎng)，廣泛存在于多種水產(chǎn)品中。派琴蟲(chóng)是影響貝類養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原之一，它使貝類貝殼不閉合，性腺發(fā)育抑制，套膜收縮，生長(zhǎng)緩慢，致死率可達(dá)95%。馬爾太蟲(chóng)是給世界貝類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重危害的主要疾病之一，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織規(guī)定的必須上報(bào)的貝類寄生蟲(chóng)病之一，它能引起貝類的消化道變色、消瘦、生長(zhǎng)停止并最終導(dǎo)致貝類死亡。急性壞死性病毒(AVNV)是造成中國(guó)北方沿海養(yǎng)殖櫛孔扇貝夏季大量死亡的病原，已給櫛孔扇貝養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大地經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]從前對(duì)這些病原生物進(jìn)行檢測(cè)，采取的是傳統(tǒng)方法，大都通過(guò)細(xì)菌病毒培養(yǎng)檢測(cè)法、免疫組化檢測(cè)法、組織病理學(xué)檢測(cè)法等，這需要針對(duì)具體的病原設(shè)計(jì)不同的檢測(cè)方法，檢測(cè)過(guò)程龐雜、需要眾多儀器設(shè)備，耗時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法做到檢測(cè)的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種基于PCR的貝類多種病原生物同步檢測(cè)試劑盒及方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足。
`[0005]本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思是通過(guò)設(shè)計(jì)退火溫度相近的普通引物和熒光引物，將多種病原生物引物在同一個(gè)普通PCR儀和同一個(gè)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，使得檢驗(yàn)流程可以標(biāo)準(zhǔn)化、自動(dòng)化，建立同時(shí)快速檢測(cè)進(jìn)口貝類中不同種類病原生物的試劑盒及方法，以達(dá)到迅速、直觀、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、低成本的檢驗(yàn)鮮活貝類中的病原生物的目的。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的的:
[0007]—種基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:
[0008](I)裂解液:含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH為?.5-8.5，其濃度分別為1-lOmg/mL，10-50mmol/L, 1 -1 Ommol/T,；
[0009](2) PCR 反應(yīng)液:含 dNTP 和 MgCl2 ；
[0010]含dATP, dTTP, dCTP,和dGTP的四種混合物dNTP,其中每種溶液的濃度2.5mmol/L ；MgCl2 濃度為 20-30mmol/L ；
[0011](3)Taq 酶液:5υ/μ L ;
[0012](4) 2 X SYBR Premix Ex Taq 反應(yīng)預(yù)混液；[0013](5)引物對(duì):
[0014]沙門(mén)氏菌:普通PCR引物-上游引物:5’ -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3’
下游引物:5’ -AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3，
[0015]熒光定量PCR 引物-上游引物:5’ -CCGTATGGCTGGGCGTTT-3’
下游引物:5’ -AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG-3，
[0016]副溶血弧菌:普通PCR引物-上游引物:5’ -CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3’
下游引物:5’ -TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3，
[0017]熒光定量PCR 引物-上游引物:5’-CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT-3’
下游引物:5’ -TCCGCTTCGCGCTCATCAATA-3，
[0018]派琴蟲(chóng):普通PCR 引物-上游引物:5’ -CCGCTTTGTTTGGATCCC-3’
下游引物:5’ -ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3’
[0019]熒光定量PCR 引物-上游弓丨物:5’ -TACCTAGCGGGTTTTGCTACTC-3’
下游引物:5’ -GTCTACGACGACACGATAATGC-3’
[0020]折光馬爾太蟲(chóng):普通PCR引物——上游引物:5 ’ -CCGCACACGTTCTTCACTCC-3 ’下游引物:5’ -CTCGCGAGITTCGACAGACG-3’
`[0021]熒光定量PCR 引物-上游引物:5’ -GCTCTTCTTCCCGATACAAACA-3’
下游引物:5’ -TAATACGCCTGCCTTCACAAG-3’
[0022]AVNV:普通 PCR 引物-上游引物:5’-TCTTTACCATGAAGATACCCACC-3’
下游引物:5’ -GTGCACGGCTTACCATTTTT-3’
[0023]熒光定量PCR 引物-上游引物:5’ -AGCCTTTTACAGAATTTTGCACCTT-3’
下游引物:5’ -TGTCGCATGTTAACCTCGTCTG-3’
[0024](6)滅菌去離子水；
[0025](7)陽(yáng)性對(duì)照:含有以上5種病原DNA模板的混合液；
[0026](8)陰性對(duì)照:ddH20
[0027]利用上述試劑盒的基于熒光定量PCR的貝類多種病原生物同步檢測(cè)方法，它的步驟如下:
[0028](I)提取待測(cè)樣品的DNA，以待測(cè)樣品的DNA為模板、在包括如上所述普通引物和熒光定量PCR引物的反應(yīng)體系中進(jìn)行普通PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)；
[0029](2)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)特異條帶的有無(wú)判斷是有含有病原生物；
[0030]對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度判斷結(jié)果，熒光定量PCR呈陽(yáng)性，則待測(cè)樣品中含有病原生物。
[0031]優(yōu)選的，所述普通PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:Taq (5U/μ L) 0.1 μ L，10 XPCRBuffer (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (2.5mM) 1.6 μ L，模板DNA2 μ L，10 μ M 的上下游引物各0.4 μ L, ddH2013.5 μ L。
[0032]優(yōu)選的，所述普通PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，57°C退火45s，72。。延伸 lmin,30 個(gè)循環(huán)；72°C終延伸 5min。
[0033]優(yōu)選的，所述熒光定量PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:2XSYBR Premix Ex Taq主要反應(yīng)預(yù)混液10.0 μ L，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒DNA2.0 μ L，ddH207.2 μ L，引物濃度0.2 μ mol/L。[0034]優(yōu)選的，所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s，60°C退火并延伸20s，45個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火延伸階段收集熒光信號(hào)。
[0035]本發(fā)明充分利用了熒光定量PCR技術(shù)的高效擴(kuò)增性、核酸雜交的良好特異性和熒光檢測(cè)技術(shù)的快速敏感性，反應(yīng)結(jié)束便可根據(jù)擴(kuò)增曲線即時(shí)判定待檢測(cè)組織樣本中是否含有上述該五種病原中的一種或幾種，由于設(shè)計(jì)了退火溫度相近的特異引物，因此能夠同時(shí)對(duì)上述5中病原生物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明操作簡(jiǎn)便快捷，能在2.5小時(shí)內(nèi)完成貝類中沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)和AVNV的同時(shí)檢測(cè)，以滿足口岸進(jìn)口水產(chǎn)品快速檢測(cè)的需要，具有很高的推廣價(jià)值。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1為普通PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。
[0037]圖2為五種病原質(zhì)?？截悢?shù)與最小循環(huán)數(shù)(Ct)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0038]其中，圖2a—圖2e分別為沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、AVNV質(zhì)?？截悢?shù)與最小循環(huán)數(shù)(Ct)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0039]圖3為五種病原生物的熔解曲線；
[0040]其中，圖3a—圖3e分別為沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、AVNV熔解曲線。
`[0041]圖4為五種病原生物熒光定量20次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。
[0042]其中，圖4a—圖4e分別為沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌、派琴蟲(chóng)、折光馬爾太蟲(chóng)、AVNV熒光定量PCR20次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下參考附圖給出本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，用來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明。
[0044]I試驗(yàn)材料和方法
[0045]1.1 病原
[0046]用于本試驗(yàn)的沙門(mén)氏菌(Salmonella Asl.1552)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus Asl.1997)購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；急性病毒性壞死病毒(AVNV)由黃海水產(chǎn)研究所惠贈(zèng)；派琴蟲(chóng)(Perkinsus sp.)、折光馬爾太蟲(chóng)(Marteiliarefringens)、燦爛弧菌(Vibrio splendidus)、費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、腸道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、尼氏單抱子蟲(chóng)(Haplosporidium nelsoni)均由廣西獸醫(yī)研究所謝芝勵(lì)研究員惠贈(zèng)。
[0047]1.2主要儀器
[0048]主要儀器:PTC_200型自動(dòng)熱循環(huán) PCR 儀(M J Research)、RocheLightCycler480 II型熒光定量PCR擴(kuò)增儀、島津UV-2450型紫外分光光度計(jì)、黑馬凝膠成像系統(tǒng)、D-1型自動(dòng)蒸汽滅菌鍋(北京發(fā)恩科貿(mào))、DYY-6C型穩(wěn)壓電泳儀(北京六一)、低溫微量超速離心機(jī)、水浴鍋、電子天平、振蕩儀等常用設(shè)備。
[0049]1.3試驗(yàn)方法
[0050]1.3.1 普通 PCR 檢測(cè)
[0051]1.3.1.1試驗(yàn)所用引物[0052]表1試驗(yàn)所用普通引物序列
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一種基于PCR的貝類多種病原生物檢測(cè)試劑盒，其特征在于該試劑盒包括:
2.利用權(quán)利要求1所述的試劑盒檢測(cè)貝類樣品中5種病原生物的方法，其特征在于所述方法包括以下步驟: (1)提取感染樣品組織的基因組DNA，以待測(cè)樣品的DNA為模板、在包括權(quán)利要求1所述的5種普通引物和5種熒光定量PCR引物的反應(yīng)體系中進(jìn)行普通PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)； (2)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)特異條帶的有無(wú)判斷是有含有病原生物；對(duì)熒光定量PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光檢測(cè)的最低Ct值和最高熒光強(qiáng)度判斷結(jié)果，熒光定量PCR呈陽(yáng)性，則待測(cè)樣品中含有病原生物。
3.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)貝類樣品中5種病原生物的方法，其特征在于: 所述普通PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:Taq(5U/y L)0.1 μ L，10XPCR Buffer (含有MgCl2) 2 μ L，dNTP Mixture (2.5mM) 1.6 μ L，模板DNA2 μ L, 10 μ M 的上下游引物各0.4 μ L，ddH2013.5μ L。
4.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)貝類樣品中5種病原生物的方法，其特征在于: 所述普通PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin,30個(gè)循環(huán)；72°C終延伸5min。
5.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)貝類樣品中5種病原生物的方法，其特征在于: 所述熒光定量PCR反應(yīng)體系每20 μ L組成如下:2 X SYBR Premix Ex Taq主要反應(yīng)預(yù)混液 10.0 μ L，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 DNA2.0 μ L，ddH207.2 μ L，引物濃度 0.2 μ mol/L。
6.如權(quán)利要求2所述的檢測(cè)貝類樣品中5種病原生物的方法，其特征在于: 所述熒光定量PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;95°C變性5s，60°C退火并延伸20s，45個(gè)循環(huán)；在每個(gè)循環(huán)的退火`延伸階段收集熒光信號(hào)。
【文檔編號(hào)】C12R1/42GK103555862SQ201310565912
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月13日
【發(fā)明者】楊冰, 王春德, 倪夢(mèng)麗 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)青島出入境檢驗(yàn)檢疫局