miR-218模擬物、其應(yīng)用以及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法
【專利摘要】一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，步驟包括：利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmi1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR法檢測Bmi1轉(zhuǎn)錄水平；利用劃痕法對膠質(zhì)瘤細胞的遷移進行檢測；利用transwell法對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲進行檢測。本發(fā)明工藝簡單，成本低，能夠有效的篩選出對膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲活性具有抑制作用的藥物。本發(fā)明還公開了一種RNA分子miR-218模擬物及其在抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
【專利說明】mi R-218模擬物、其應(yīng)用以及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域,特別涉及一種miRNA的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]膠質(zhì)瘤是臨床上最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤的45%左右。按膠質(zhì)瘤的惡性程度分為I 一 IV級，級別愈高，其惡性程度愈大。在所有膠質(zhì)瘤病人中，25%~50%的為II級；50%~75%的為III級；75%~100%為IV級。惡性度高者瘤內(nèi)常有壞死與出血，血管豐富，血管外層及內(nèi)皮細胞均有明顯增生，除手術(shù)切除外，膠質(zhì)瘤的藥物療效和放療效果都不甚理想，因此膠質(zhì)瘤是療效最差的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計，膠質(zhì)瘤病人的一年總生存率低于30%，級別高的病人中位生存期只有大概15個月。膠質(zhì)瘤預(yù)后差的一個主要原因為膠質(zhì)瘤的高度侵襲能力，惡性程度高的膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，腫瘤成份與正常腦組織的分界模糊，手術(shù)往往不能將腫瘤組織完整切除，術(shù)后膠質(zhì)瘤的復發(fā)率較高。復發(fā)的膠質(zhì)瘤中，超過90%起源于手術(shù)區(qū)的浸潤瘤細胞或手術(shù)區(qū)邊緣的癌細胞。理解膠質(zhì)瘤的遷移機制，尋找和發(fā)現(xiàn)新的膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)的基因和信號途徑對于膠質(zhì)瘤的分子干預(yù)具有重要的意義。
[0003]原癌基因Bmil (B-cell-specific Moloney murine leukemia virus insertionsitel)是在1991年首次被報道，屬于多梳基因家族(Polycomb Group genes, PcG)成員，是與細胞周期轉(zhuǎn)換和細胞增殖相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄抑制因子，直接參與細胞生長、增殖的調(diào)節(jié)，Bmil基因在多種惡性腫瘤如膠質(zhì)瘤、肺癌、白血病、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等中大量表達，并且與這些腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后密切相關(guān)。INK4a/ARF是Bmil基因調(diào)節(jié)細胞增殖和老化的靶點，在Bmil缺陷的小鼠成纖維細胞(MEF)和淋巴細胞中，INK4a/ARF表達水平明顯升高，相反，Bmil過度表達的MEF細胞中INK4a/ARF蛋白下調(diào)，細胞可發(fā)生永生化，所以Bmil通過抑制INK4a/ARF基因的表達來維持細胞的自我更新。Bmil在人膠質(zhì)瘤細胞中高表達，并且敲除Bmil的膠質(zhì)瘤細胞在體成瘤能力減弱。
[0004]MicroRNA (miR,也稱miRNA)是一類長度為20-25核苷酸的非編碼的單鏈RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個核苷酸大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，通過與mRNA互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，參與調(diào)控心臟疾病、血管疾病、神經(jīng)和腫瘤等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。腫瘤的侵襲性是區(qū)別惡性腫瘤和良性腫瘤的重要生物學特征，也是目前惡性 腫瘤難以治愈最終導致死亡的重要原因，因此研究腫瘤侵襲的調(diào)控機制一直是腫瘤領(lǐng)域的主要方向。但是腫瘤的侵襲是一個多基因參與的復雜調(diào)控過程，所以能夠同時調(diào)控多個靶基因表達的mircoRNA自從發(fā)現(xiàn)之日起就成為了腫瘤發(fā)生和侵襲過程中研究熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的篩選方法，該方法工藝簡單，成本低，應(yīng)用該方法成功篩選并驗證了 miR-218模擬物具有抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的效果，從而達到抑制膠質(zhì)瘤的目的。
[0006]本發(fā)明的第一方面，涉及一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含miR-218核酸序列“莖-環(huán)”結(jié)構(gòu)的發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，主序列如下:5’ -UUGUGCUUGAUCUAACCAUGU-3’ (SEQID N0.3)。
[0007]本發(fā)明的第二方面，涉及根據(jù)本發(fā)明第一方面的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的第三方面，涉及一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:
[0009](1)利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmi 1轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；
[0010]將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA,定量PCR法檢測Bmil轉(zhuǎn)錄水平。
[0011]擴增Bmil的引物如下:
[0012]Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG (SEQ ID N0.1)，
[0013]Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC (SEQ ID N0.2)；[0014](2)利用劃痕法對膠質(zhì)瘤細胞的遷移進行檢測；
[0015](3)利用transwell法對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲進行檢測。
[0016]優(yōu)選地，所述步驟(1)中定量PCR體系為:10μ 1的Premix Ex Taq (SYBR qPCR)(2X)，10ymol/L的Bmil上下游上下游引物各0.5μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ 1。
[0017]優(yōu)選地，步驟(1)中PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后95。。15s，60°C 20s，72°C 20s，反應(yīng)40個循環(huán)。
[0018]步驟(2)中采用“劃痕法”對膠質(zhì)瘤細胞的遷移進行檢測的步驟為，用待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞12h對其進行饑餓干預(yù)。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質(zhì)瘤細胞，每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區(qū)。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液。在0小時，12小時和24小時顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并計算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。
[0019]步驟(3)中，利用transwell法對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲進行檢測的步驟為，待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液稀釋，種5X 105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數(shù)10個視野中的細胞數(shù)目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲。
[0020]進一步地，上述篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之前還包括步驟:構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut重組質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒分別與待篩選藥物共轉(zhuǎn)染工具細胞293T細胞株。
[0021]重組質(zhì)粒pmirGL0-Bmil3’ -UTR的構(gòu)建方法為:根據(jù)NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結(jié)合位點的長度為390bp的3’_UTR序列，兩端含有的酶切位點為Sac I, Xbal,利用這兩位點連接入pmirGLODual-Luciferase miRNA TargetExpression Vector 載體(promega)。插入序列如下:[0022]>Bmil-wt
[0023]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGAAGCACAATTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAAAAGCACAATGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.4)
[0024]重組質(zhì)粒pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut的構(gòu)建方法為:根據(jù)NCBI上Bmil的序列(BC011652.2)人工合成了含有miR-218結(jié)合位點突變的長度為390bp的3‘_UTR序列，具體突變是將pmirGL0-Bmil3’-UTR中的兩處長度為8bp的序列:AAGCACAA替換為TTTGTGTT。兩端含有的酶切位點為Sac I, Xbal,利用這兩位點連接入pmirGLO Dual-Luciferase miRNATarget Expression Vector 載體(promega)。插入序列如下:
[0025]>Bmil_mut
[0026]ACATTTCATTGTCCCCAGTCTGCAAAAGTTTGTGTTTTCTATTGCTTTGTCTTGCTTATAGTCATTAAATCATTACTTTTACATATATTGCTGTTACTTCTGCTTTCTTTAAAAATATAGTAAAGGATGTTTTATGAAGTCACAAGATACATATATTTTTATTTTGACCTAAATTTGTACAGTCCCATTGTAAGTGTTGTTTCTAATTATAGATGTAAAATGAAATTTCATTTGTAATTGGAAAAAATCCAATAAAAAGGATATTCATTTAGAAAATAGCTAAGATCTTTAATAAAAATTTGATATGAATTTGTGTTTGTGCAGAAGTTATGGAAAACCTATAGAGGATTACAACAGGTAAACGTTAAAGAGAATACATTGCTGACTTAT (SEQ ID N0.5)
[0027]重組質(zhì)粒圖譜如圖1所示。
[0028] 進一步地，上述篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，在步驟(1)之后，還包括步驟:利用Western blot法檢測待篩選藥物對Bmil蛋白表達的抑制作用。具體步驟為:
[0029]按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉(zhuǎn)膜lOOrnin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或?qū)φ?a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋，抗a-tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。
[0030]有益效果
[0031]本發(fā)明工藝簡單，成本低，能夠有效篩選出可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲活性的藥物，同時為膠質(zhì)瘤的防治提供有效干預(yù)靶點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為重組質(zhì)粒圖譜；
[0033]圖2為計算機軟件分析顯示Bmil的3’非翻譯區(qū)存在兩個miR-218的作用靶點；
[0034]圖3顯示了 miR-218模擬物能夠抑制攜帶Bmil靶序列熒光素酶的相對活性；
[0035]圖4顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在轉(zhuǎn)錄水平的表達；[0036]圖5顯示了 miR-218模擬物能夠抑制Bmil在蛋白質(zhì)水平的表達；
[0037]圖6顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質(zhì)瘤細胞的遷移；
[0038]圖7顯示了 miR-218模擬物有效減少膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。
[0039]本發(fā)明中所述生化試劑及生物材料均可從市售渠道獲得，比如工具細胞293T細胞株可以通過上海拜力生物科技有限公司購買獲得，膠質(zhì)瘤細胞(U251)購自中國科學院細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，Bmil抗體購自Cell SignalingTechnology)公司。
【具體實施方式】
[0040]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0041]實施例1
[0042]1.miR-218靶基因的篩選
[0043]運用PicTar、TargetScan等軟件檢索miR-218可能的祀基因，發(fā)現(xiàn)Bmil基因的3’非翻譯區(qū)(3’ UTR)含有2個miR-218的靶位點(附圖2)。因此miR-218類似序列可能具有抑制原癌基因Bmil表達的功能。
[0044]2.報告基因驗證Bmil是miR-218的靶基因
[0045]構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR 和 pmirGL0_Bmil3’ -UTR-mut 重組質(zhì)粒
[0046]構(gòu)建方法:人工合成了含有miR-218結(jié)合位點的Bmi 13 ’ -UTR的長度為390bp的序列，通過限制性內(nèi)切酶Sac I, Xbal連接入相同酶切的pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector 載體中即獲得 pmirGL0_Bmil3’ -UTR 載體。將pmirGL0-Bmil3’ -UTR兩處長度為8bp的序列:AAGCACAA替換為TTTGTGTT就構(gòu)建成pmirGL0_Bmil3，-UTR - mut 載體。
[0047]pmirGL0-Bmil3’ -UTR載體中將含有可以與miR-218結(jié)合的位點Bmil3’ -UTR序列與螢火蟲熒光素酶基因融合，使轉(zhuǎn)錄出來的螢火蟲熒光素酶3’ -UTR含有miR-218的結(jié)合位點，這樣在和miR-218共轉(zhuǎn)染的時候，miR-218將會通過與結(jié)合位點的結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制螢火蟲熒光素酶的表達。在pmirGL0-Bmil3’ -UTR - mut載體中miR-218結(jié)合位點被突變掉，所以與miR-218共轉(zhuǎn)染的時候不會影響螢火蟲熒光素酶的表達。載體中海參熒光素酶作為內(nèi)參，測定螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶的活性比值就可以確定系統(tǒng)中螢火蟲熒光素酶的含量，進而判斷出預(yù)測的miR-218結(jié)合位點是否真的和miR-218結(jié)合。具體方法:將 pmirG LO 空載體,pmirGL0-Bmil3’ -UTR 載體與 pmirGL0_Bmil3’ -UTR - mut 分別與miR-218模擬物共轉(zhuǎn)染工具細胞293T，轉(zhuǎn)染24h后用專用裂解液裂解細胞，每孔100 μ 1，打均勻，充分裂解后樣品備用。采用Promega公司的熒光素酶檢測試劑盒，在1.5ml離心管中加入LARII50 μ 1和裂解液5 μ 1混勻，酶標儀檢測螢火蟲熒光素酶；加入50 μ 1 Stop&Glo溶液滅活螢火蟲熒光素酶，酶標儀檢測海參熒光素酶，計算螢火蟲熒光素酶與海參熒光素酶的比值。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-218的模擬物后熒光素的表達下降了約50%左右，而突變與miR-218的模擬物結(jié)合位點以后螢火蟲熒光素酶的表達恢復(見附圖3)，證明Bmil是miR-218的直接靶基因。
[0048]3.利用定量PCR法和Western blot法檢測miR-218模擬物對Bmil轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達的抑制作用
[0049]miR-218模擬物或miR-對照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞72小時后利用trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA ;定量PCR體系為:10 μ 1的Premix Ex Taq(SYBR qPCR) (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1 μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ KPCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后95°C 15s,60°C 20s,72°C 20s，反應(yīng)40個循環(huán)。發(fā)現(xiàn)增加了 miR-218模擬物在膠質(zhì)瘤細胞的表達量后，Bmil轉(zhuǎn)錄水平的表達量明顯下降。
[0050]miR-218模擬物或miR-對照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞72小時后，收集細胞蛋白樣品進行電泳。電泳時，按每孔50 μ g蛋白上樣量等量上樣。以400mA恒壓轉(zhuǎn)膜lOOmin。將膜放入放入1%酪蛋白/TBS中于室溫下振蕩封閉lh。加入TBST稀釋后的Bmil抗體(Cell SignalingTechnology)或?qū)φ?a-tubulin(Santa Cruz Biotechnology)抗體一抗(Bmil 抗體按 2:1000稀釋，抗α-tubulin抗體按1:2000稀釋)，4°C振蕩孵育過夜。吸凈一抗，TBST漂洗膜10minX3 ;加入稀釋后的二抗(均為1:4000稀釋)，水平搖床室溫孵育lh。吸凈二抗，TBST漂洗膜，10minX4，混合ECL (A:B=100:1液)，充分覆蓋濕潤NC膜表面，靜置lmin ;于暗室中用保鮮膜將NC膜封好，將X光片平放于NC膜上顯影并記錄數(shù)據(jù)。結(jié)果可見，增加了miR-218模擬物在膠質(zhì)瘤細胞的表達量后，Bmil蛋白的表達量明顯下降。(見附圖5) [0051]4.膠質(zhì)瘤細胞的遷移實驗
[0052]采用“劃痕法”對膠質(zhì)瘤細胞的遷移活性進行研究。miR-218模擬物或miR-對照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞12h對其進行饑餓干預(yù)。此時細胞應(yīng)布滿培養(yǎng)板底，形成單層細胞。用200 μ 1滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質(zhì)瘤細胞，每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區(qū)。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)。在顯微鏡下用記號筆在培養(yǎng)板底部為細胞劃痕邊緣做記號并拍攝照片。在0小時，12小時和24小時鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并拍照。用Image-proplus6.0軟件計算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-對照的膠質(zhì)瘤細胞遷移活性大大增加，劃痕愈合為12小時是25.1%, 24小時為43.2%。而運用miR-218模擬物增加膠質(zhì)瘤細胞miR-218的表達量能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞向劃痕區(qū)的遷移，劃痕愈合率為12小時是19.2%24小時為34.2%(見附圖6)。
[0053]5.膠質(zhì)瘤細胞的侵襲實驗
[0054]利用transwell法對膠質(zhì)瘤的侵襲活性進行研究。miR-218模擬物或miR-對照轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液稀釋，種5X 105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用100%甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數(shù)10個視野中的細胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)運用miR-218模擬物增加膠質(zhì)瘤細胞miR-218的表達量能夠明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲(見附圖7)。
[0055]以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本【技術(shù)領(lǐng)域】中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù) 方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種RNA分子miR-218模擬物，其堿基序列包含如下序列:5，-U腳GCUUGAUCUAACCA腳-3'
2.如權(quán)利要求1所述的RNA分子miR-218模擬物在抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物中的應(yīng)用。
3.一種篩選能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲藥物的方法，其中所述藥物為miRNA或其模擬物，步驟包括:(1)利用定量PCR法檢測待篩選藥物對Bmil轉(zhuǎn)錄水平的抑制作用；將待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞后利用Trizol法提取總RNA，消化DNA后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，定量PCR法檢測Bmil轉(zhuǎn)錄水平。擴增Bmil的引物如下:Bmil 基因上游引物 Bmil-F:GCTTCAAGATGGCCGCTTG,Bmil 基因下游引物 Bmil-R:TTCTCGTTGTTCGATGCATTTC ；(2)利用劃痕法對膠質(zhì)瘤細胞的遷移進行檢測；(3)利用transwell法對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲進行檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，所述步驟(1)中的定量PCR體系為:10μ1的PremixEx Taq (2X )，10 μ mol/L的Bmil上下游引物各0.5 μ 1，待檢cDNA模板或陰性對照1 μ 1，加滅菌去離子水補足體積至20 μ 1。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述步驟(1)中的PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性30s ;然后 95°C 15s，60°C 20s，7`2°C 20s，反應(yīng) 40 個循環(huán)。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(2)中采用“劃痕法”對膠質(zhì)瘤細胞的遷移進行檢測的步驟為，用待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細胞12h對其進行饑餓干預(yù)。用滅菌槍頭勻速勻力的向一個方向劃單層膠質(zhì)瘤細胞,每孔平行的劃1次，形成1條無細胞劃痕區(qū)。PBS清洗細胞2次，加入無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液。在0小時，12小時和24小時顯微鏡下觀察劃痕兩側(cè)的距離變化并計算刺激前后劃痕兩側(cè)的距離。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，步驟(3)中，利用transwell法對膠質(zhì)瘤細胞的侵襲進行檢測的步驟為，待篩選藥物轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細胞48小時后換無血清的膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液稀釋，種5X105個細胞在transwell小室中，外面加入膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時后，用棉簽擦去上層未侵襲的細胞，用甲醇固定lOmin后空氣中晾干，加入DAPI染核，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機數(shù)10個視野中的細胞數(shù)目，判斷帶篩選藥物能否抑制膠質(zhì)瘤細胞侵襲。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其中，在步驟(1)之前還包括步驟:構(gòu)建pmirGL0_Bmil3’ -UTR和pmirGL0-Bmil3’ -UTR-mut重組質(zhì)粒，兩種質(zhì)粒分別與待篩選藥物共轉(zhuǎn)染工具細胞293T細胞株。
9.如權(quán)利要求3所述的方法,其中，在步驟(1)之后,還包括步驟:利用Westernblot法檢測待篩選藥物對Bmil蛋白表達的抑制作用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740809SQ201310567075
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2013年11月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月14日
【發(fā)明者】金衛(wèi)林, 高興春, 涂艷陽, 崔大祥 申請人:上海交通大學