一株反硝化細菌及其培養(yǎng)條件的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一株反硝化細菌及其培養(yǎng)條件，屬于環(huán)境微生物領域。經鑒定，該反硝化細菌為黃色海假單胞菌Pseudomonasxanthomarina，命名為DN1，現(xiàn)保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCNo.7650。經初步優(yōu)化，該菌株的培養(yǎng)基為：丁二酸鈉6-8g/L、酵母粉6-10g/L、硝酸鈉0.67g/L、磷酸二氫鉀1.36g/L、硫酸銨0.24g/L、硫酸鎂0.2g/L，搖床培養(yǎng)條件為：pH5.0，30℃，200rpm。上述條件下所得菌體，在NO3-濃度為10mmol/L的水體中，作用72h，脫氮率達到90%以上。
【專利說明】一株反硝化細菌及其培養(yǎng)條件
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境微生物【技術領域】，具體涉及一株反硝化細菌及其培養(yǎng)方法，以及其反硝化能力。
【背景技術】
[0002]水體富營養(yǎng)化是現(xiàn)今我國水環(huán)境面臨的重大問題，嚴重地阻礙著我國國民經濟的發(fā)展。廢水處理過程中的脫氮處理越來越顯示其重要地位。在現(xiàn)代水產養(yǎng)殖業(yè)中，由于養(yǎng)殖動物排泄和餌料過剩等原因造成水體中氨氮、亞硝酸鹽等的含量嚴重超標，水質惡化，進而導致病害頻發(fā)，并嚴重影響了水產養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。相對于物理化學脫氮方法，生物脫氮已經成為廢水中去除氮素污染的最有效的方法之一，而微生物的反硝化作用正是改善水質，特別是降低水體中亞硝酸鹽濃度的有效手段之一。
[0003]本發(fā)明的目的在于提供一株反硝化細菌及其培養(yǎng)條件，并初步研究其反硝化能力，可應用于水體的凈化工藝。

【發(fā)明內容】

[0004]反硝化細菌的篩選、鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化方法如下:
(I)平板初篩及反硝化能力初步鑒定:從江南大學湖邊采集土壤樣品，制備土壤懸液，涂布于DM固體平板，于30°C恒溫培養(yǎng)至長出明顯菌落，用接種環(huán)逐個挑取形態(tài)各異的菌落至新的DM固體平板，劃線分離出單菌落。選取分離后的單菌落，點種于BTB平板上，挑取有藍色變色圈的陽性菌株即為反硝化細菌。
[0005](2)搖瓶復篩與脫氮能力測定:初篩得到的菌株經搖瓶發(fā)酵，測定其脫氮能力。經復篩，3號菌總氮去除率最高，達78%。
[0006](3)菌株16S rDNA鑒定:提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp,經測序比對,為黃色海假單胞菌xanthomarina'),命名為DN1，于2013年5月29日保藏在位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7650。
[0007](4)菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化:利用單因素實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為丁二酸鈉6-8 g/L、酵母粉6-10 8/1、硝酸鈉0.67 g/L、磷酸二氫鉀1.36 g/L、硫酸銨0.24 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，搖床培養(yǎng)條件為:pH 5.0，30。。，200rpm,該條件下發(fā)酵 14h, OD600 達 7.29,約 3X IO8 cfu/ml。
[0008](5)反硝化能力測定:在NaN03濃度為10 mmol/L的水體中，添加丁二酸鈉4 g/L,按1%的量接入上述菌液，72h后檢測水樣中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量(以不投加菌體的水樣作為對照)，計算脫氮率達到90%以上。
[0009]其中步驟(1)中所述的DM培養(yǎng)基為(g/L):丁二酸鈉4.72，NaNO3 0.67, KH2PO4
1.50，Na2HPO4 0.42，MgSO4.7H20 1.00，微量元素溶液2 ml，pH調至7.2，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂；BTB平板培養(yǎng)基為(g/L):FeCl3*H20 0.5，琥珀酸鈉8.5，BTB I ml (1%溶于酒精)，KNO3 1.00，KH2PO4 1.00，CaCl2.2H20 0.2，MgSO4.7H20 1.00，pH 調至 7.0-7.3。
[0010]本Iky^Wi'i^Pseuckmionas xanthomarina DNl 為反硝化細菌,可廣泛應用于各種富營養(yǎng)化水體的凈化。
【具體實施方式】
[0011]實施例1反硝化細菌的篩選與鑒定
1、培養(yǎng)基配方
LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨I，酵母提取物0.5，氯化鈉I，pH 7.0-7.2。需要時使用前加入100 μ g /ml氨節(jié)青霉素，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂,用于大腸桿菌的培養(yǎng)。
[0012]DM 培養(yǎng)基(g/L): 丁二酸鈉 4.72，NaNO3 0.67，KH2PO4 1.50，Na2HPO4 0.42，MgSO4.7H20 1.00，微量元素溶液2 ml, pH調至7.2，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。
[0013]微量元素溶液(g/L):CuS0.5Η20 4.00，F(xiàn)eSO4.7Η20 0.7，F(xiàn)eCl3.6Η20，CoCl2.6Η20，Na2MO4.2Η20 3.40，CaCl2.2Η20 2.00。
[0014]SM培養(yǎng)基(g/L):丁二酸鈉 3,NaNO3 0.67，KH2PO4 1.36，酵母粉 I,MgSO4.7Η20 1.00,
pH調至7.2，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂。
[0015]BTB 平板(g/L) =FeCl3.H2O 0.5，琥珀酸鈉 8.5，BTB I ml (1% 溶于酒精)，KNO31.00，KH2PO4 1.00，CaCl2.2H20 0.2，MgSO4.7H20 1.00，pH 調至 7.0-7.3。
[0016]2、平板初篩及反硝化能力初步鑒定
從江南大學湖邊采集土壤樣品，稱取IOg置于250 ml三角瓶中，加100 ml無菌水及幾粒玻璃珠，搖床振蕩I 5 min使土樣分散均勻。待土樣分散后,靜置5 min后,吸取I ml 土壤懸液至9 ml稀釋液(無菌水)，得到10_2稀釋度懸液，依次按10倍稀釋法稀釋至10_7，由此制得各稀釋度土壤懸液。分別吸取各稀釋度懸液0.1 ml至DM固體平板(放置過夜，無雜菌生長)，于30°C恒溫培養(yǎng)至長出明顯菌落，用接種環(huán)逐個挑取形態(tài)各異的菌落至新的DM固體平板，劃線分離出單菌落。
[0017]選取分離后的單菌落，點種于BTB平板上，BTB在酸性條件是黃綠色的，當反硝化細菌消耗了硝酸根，PH上升，BTB會變藍，初篩得到3株反硝化細菌。
[0018]3、搖瓶復篩與脫氮能力測定
初篩得到的菌株經搖瓶發(fā)酵，測定其脫氮能力。通過測定濾液中的no3_-n和no2_-n濃度變化，可以反映各菌株的硝酸鹽還原能力和實際脫氮能力。no3_-n的去除率，可以表明菌株的硝酸鹽還原能力，而不考慮硝酸鹽還原產物類型的差異(不論終產物是亞硝酸鹽或氣態(tài)產物)；NOx^-N (NOx--N =N03--N+N02--N，亦稱總氧化氮TON)的去除率，可以近似表明菌株的脫氮能力。NO3--N和NO2--N濃度測定采用國標方法。
[0019]經復篩,3號菌總氮去除率最高,達78%。
[0020]4、16S rDNA 鑒定
提取總DNA，用細菌16S rDNA通用引物擴增，得到的基因序列為1500 bp，經測序比對，與黃色海假單胞菌的16S rDNA序列同源性高達99%，初步判斷其為黃色海假單胞菌QPseudomonas xanthomarina ),DNl。
[0021]實施例2菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化及反硝化能力測定
利用單因素實驗對菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為丁二酸鈉6-8 g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸鈉0.67 g/L、磷酸二氫鉀1.36 g/L、硫酸銨0.24g/L、硫酸鎂0.2 g/L，搖床培養(yǎng)條件為:pH 5.0，30。。，200 rpm，該條件下發(fā)酵14h，OD600達
7.29，約 3X IO8 cfu/ml。
[0022]在NaNO3濃度為10 mmol/L的水體中，添加丁二酸鈉4 g/L,按1%的量接入上述菌液，72h后檢測水樣中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量(以不投加菌體的水樣作為對照)，計算脫氮率達到90%以上。
【權利要求】
1.一株反硝化細菌DNl,分類命名為黃色海假單胞菌xanthomarinaΛ%保藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.7650，保藏日期為2013年5月29日。
2.權利要求1所述菌株的培養(yǎng)方法，其培養(yǎng)基為:丁二酸鈉6-8g/L、酵母粉6-10 g/L、硝酸鈉0.67 g/L、磷酸二氫鉀1.36 g/L、硫酸銨0.24 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，搖床培養(yǎng)條件為:pH 5.0，30。。，200 rpm。
3.利用權利要求2所述的培養(yǎng)方法得到的菌液在水體脫氮中的應用方法:在NO3-濃度為10 mmol/L的水體中，作`用72h，脫氮率達到90%以上。
【文檔編號】C12R1/38GK103555637SQ201310568985
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權日:2013年11月15日
【發(fā)明者】張旦旦, 竇文芳, 史勁松, 許正宏 申請人:江南大學