提高種子產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及利用整合了DHS的反義多核苷酸或eIF-5A的正義多核苷酸的載體來提高植物中種子產(chǎn)量的方法。
【專利說明】提高種子產(chǎn)量的方法
[0001]本申請是2005年12月5日提交的題為“DHA與eIF_5A的異構體的多聚核苷酸及其使用方法”的國家申請?zhí)枮?00580041648.2 (PCT / US2005 / 043708)的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]本申請要求于2004年12月3日申請的美國臨時申請60/632，567、于2005年6月14日申請的美國臨時申請60/690，160、于2005年8月25日申請的美國臨時申請60/710,999以及于2005年10月21日申請美國臨時申請60/728，737的優(yōu)先權，并作為參考并入本申請。本申請是于2004年6月8日申請的美國申請10/862,440的部分繼續(xù)申請，10/862，440是于2000年11月29日申請的序列號09/725，019 (現(xiàn)為美國專利6，878，860)的部分繼續(xù)申請，09/725，019是于2000年6月19日申請的09/597，771 (現(xiàn)為美國專利6，538，182)的部分繼續(xù)申請，09/597，771是現(xiàn)已放棄的于1999年7月6日申請的09/348，675的部分繼續(xù)申請，所有這些均作為參考并入本申請。
【技術領域】[0003]本發(fā)明涉及真核起始因子5A(" eIF-5A")特有的同工型(isoform)與編碼eIF_5A 的多核苷酸,及 Νε-(4_ 氨丁基)賴氨酸合酶("DHS" deoxyhypusine synthase)與編碼DHS的多核苷酸，此外還涉及調節(jié)eIF-5A同工型和DHS表達的方法。
【背景技術】
[0004]衰老是植物生命中生物發(fā)育的末期階段。它預示著死亡，并且發(fā)生在包括整個植株、器官、花和果實、組織以及單個細胞在內的多種生物組織水平上。
[0005]可通過不同的內在的或者外在的因子來誘導衰老的發(fā)生。在植物生命中或者諸如果實、花和葉這樣的植物組織中，衰老是一個復雜的、高度調節(jié)的發(fā)育階段。衰老可導致細胞膜和大分子同時被破壞，并使得代謝產(chǎn)物隨后轉移到植物的其它部分。
[0006]除了在正常植物發(fā)育過程中發(fā)生的程序性衰老之外，作為對外部環(huán)境因子的調節(jié)性應答，也可發(fā)生細胞及組織的死亡以及隨后的代謝產(chǎn)物的再次流通。過早誘導衰老起始——也稱為壞死或者細胞凋亡——的外部因子，包括諸如溫度、干旱、弱光或貧乏的養(yǎng)料供應這樣的逆境，以及病原體侵襲.暴露在逆境中的植物組織也產(chǎn)生乙烯，即熟知的逆境乙烯(Buchanan-ffo 11 as ton, V., 1997, J.Exp.Botany, 48: 181-199 ； Wright, M., 1974,Plant, 120:63-69)。已知乙烯在某些植物中可導致衰老。
[0007]衰老并不是一個被動過程，而是一個涉及特定基因協(xié)調表達的主動調節(jié)的過程.在衰老期間，總RNA水平降低，許多基因的表達被關閉(Bate et al，1991，J.Exper.Botany, 42,801-11 ；Hensel et al，1993，ThePlant Cell，5，553-64).不過，越來越多的證據(jù)表明衰老過程依賴于細胞核基因的從頭轉錄.例如，mRNA和蛋白合成的抑制物以及將細胞去核可阻止衰老.使用取自衰老的葉片和綠色葉片的mRNA進行體外翻譯實驗的分子研究表明在衰老葉片中葉片蛋白產(chǎn)物的模式發(fā)生了改變(Thomas et al，1992，J.PlantPhysiol.,139,403-12).通過使用示差篩選和消減雜交技術，從很多不同的植物——包括諸如擬南芥、玉米、黃瓜、蘆筍、番茄、稻米和土豆這樣的單子葉及雙子葉植物中，鑒定了許多代表衰老誘導基因的cDNA克隆.對在衰老過程中特異表達的基因的鑒定是衰老繼續(xù)進行需要從頭轉錄的確切證據(jù).[0008]在衰老期發(fā)生的事件似乎具有很高協(xié)調性以在壞死及死亡發(fā)生之前最大利用細胞成分.會發(fā)生涉及特異信號感受與誘導串聯(lián)基因表達的復雜相互作用，以調節(jié)該過程.編碼與衰老相關蛋白的基因的表達可能通過普通激活蛋白——它們依次被激素信號直接或間接激活——來調節(jié).關于信號起始或者該過程隨后的協(xié)調的機制仍知之甚少.[0009]基因協(xié)調表達需要包括起始因子在內的涉及轉錄與翻譯的因子。在包括植物在內的多種生物中已經(jīng)分離并鑒定了翻譯起始因子基因。翻譯起始因子可以控制mRNA從細胞核中移出的速率、與核糖體連接的速率、并在某種程度上影響特定mRNA的穩(wěn)定性.ZuK, etal, EMB0J.17:2914-2925 (1998)。實際上，一個這樣的翻譯起始因子——它并不需要在整個翻譯過程中都有活性一可在細胞核和細胞質之間來回運輸特定類群的mRNA以進行翻譯.Jao, et al., ].Cell.Biochem.86:590-600, (2002) ；ffang et al, J Biol Chem276:17541-17549(2001) ；Rosorius et al, J.Cell ScL，112，2369-2380 (1999).這種已知的翻譯因子是真核起始因子5A(eIF-5A),并且是已知的唯一含輕丁賴氨酸的蛋白質.Park, etal, J Biol Chem263:15264-15269 (1988).[0010]真核翻譯起始因子5A(eIF_5A)是大小約17KDa的必需蛋白因子，它參與真核細胞蛋白合成的起始.可通過已知僅存于eIF-5A中的一種獨特的修飾氨基酸一輕丁賴氨酸[N-(4-氨基-2-羥丁基)賴氨酸]來鑒定它.羥丁賴氨酸是在翻譯后通過將來自多胺、 亞精胺的丁基基團轉移并羥基化到eIF-5A中特定賴氨酸殘基的側鏈氨基基團來形成的.eIF-5A的激活涉及將亞精胺的丁基殘基轉移到eIF-5A的賴氨酸上，形成羥丁賴氨酸并激活eIF-5A.在真桉生物中，Ne-(4-氨丁基)賴氨酸Ne -(4-氨丁基)賴氨酸合酶(DHS)調節(jié)eIF-5A中羥丁賴氨酸的翻譯后合成.使用甲二磺酰-嘌呤霉素試驗已表明羥丁賴氨酸修飾對于體外eIF-5A的活性是必需的.[0011]通過由Νε-(4-氨丁基)賴氨酸合酶(DHS ；EC1.1.1.249)與^-(4_氨丁基)賴氨酸羥化酶(DHH ;EC1.14.99.29)的活化來實現(xiàn)的保守賴氨酸殘基的轉化，于翻譯后在eIF-5A上形成羥丁賴氨酸.已經(jīng)從幾種植物中分離到DHS——包括番茄(GenBank序列號AF296077)、擬南芥(AT-DHS ;GenBank序列號 AF296078)、煙草(Ober and Hartmann, 1999)、康乃馨(GenBank序列號AF296079)和香蕉(GenBank序列號AF296080),但仍未鑒定出DHH的基因.[0012]DHS通過添加來源于亞精胺的丁基基團將eIF_5A的一個保守賴氨酸殘基轉化SNE-(4-氨丁基)賴氨酸.這個eIF-5A的中間型然后被DHH羥基化轉變成羥丁賴氨酸.Park et al, Biol.Signals6,115-123 (1997)。Νε - (4_ 氨丁基)賴氨酸型及輕丁賴氨酸型的 eIF-5A 均可在體外與 mRNA 結合.Liu et al，Biol Signals6:166-174 (1997).盡管仍未完全了解eIF_5A的功能，但有證據(jù)表明它可能參與調節(jié)細胞分裂(Park et al, J BiolChem263:15264-15269(1998) ；Tome et al，Biol Signals6:150-156，(1997))及衰老(Wanget al, J.Biol.Chem.276(20):17541-17549(2001)).也可參見美國專利 6，538，182 和美國申請09/725，019，此處作為參考并入本申請.已知有幾種生物具有一種以上的eIF-5A同工型，這符合每種同工型特異穿梭運輸特定類群的參與細胞分裂和衰老過程的mRNA的假定.[0013]Wang等揭示了 DHS mRNA水平的提高與番茄果實軟化以及天然的和脅迫誘導的葉片衰老相關聯(lián).Wang et al, J.Biol.Chem.276(20):17541-17549(2001).此外，當通過導入位于組成型啟動子調控下的DHS反義cDNA片段來抑制轉基因番茄植株中DHS的表達時，來自這些轉基因植株的番茄果實表現(xiàn)出明顯的衰老延遲——證據(jù)就是延遲了的果實軟化與腐爛.參見2003年11月29日申請的美國專利6，538，182和美國申請09/725，019，此處作為參考并入本申請.由于已知DHS可活化eIF-5A，這些數(shù)據(jù)表明羥丁賴氨酸修飾的eIF-5A(活化的eIF-5A)可以通過選擇性翻譯衰老所需的mRNA種類來調控衰老。這通過在擬南芥("AT"")中用位于組成型啟動子之下的全長反義多核苷酸或者3’UTR cDNA下調DHS來進一步闡釋.通過下調擬南芥DHS (" AT-DHS")表達并減少其對eIF_5A的激活，可使衰老延遲約2周(參見U.S.6，538，182).在轉基因植物中，不僅觀察到衰老得到延遲，而且種子產(chǎn)量提高了，對脅迫耐受性增加了，生物量也增加了，其中每個表型的程度是由DHS下調的程度決定的.如Southern印跡(Wang et al, 2001)及BLAST分析所示，由于在番茄和擬南芥基因組中僅有一個DHS拷貝，為了專門作用于使衰老轉錄物穿梭出細胞核的特異的eIF-5A同工型，必須鑒定出衰老特異性的eIF-5A同工型并且通過衰老誘導eIF-5A(3/ UTR)的反義構建體、或通過植物可下調過表達基因的天然能力(即通過使用正義多核苷酸過表達)來進行特異性下調.[0014]植物缺乏免疫系統(tǒng)，并且因而具有獨特的對付病毒的途徑，稱 為共抑制，可導致病毒RNA的序列特異性降解.當轉基因位于強的組成型啟動子，譬如花椰菜花葉病毒雙35S啟動子下游時，對于植物而言其表現(xiàn)就像是病毒轉錄物，會發(fā)生序列特異性降解，但不僅僅是轉基因，內源基因也一樣(綜述參見Fagard and Vaucheret, Annual Review.PlantPhysiol.Plant Mo1.Biol.，June ；51:167-194(2000)).有一些共抑制可能同樣有效的證據(jù)，既便它未必比下調內源基因表達的反義抑制更有效.[0015]發(fā)明概述
[0016]本發(fā)明提供了分離的真核起始因子5A(" eIF_5A")的同工型:衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A和脅迫eIF_5A、以及編碼這些同工型的多核苷酸.本發(fā)明提供了 eIF-5A同工型的反義和正義多核苷酸.本發(fā)明也提供了含有eIF-5A同工型正義和反義多核苷酸的表達裁體.本發(fā)明還涉及在植物及植物部分以及具有eIF-5A修飾表達的子代中調節(jié)(提高/上調或者抑制/下調)這些因子表達的方法.此外，本發(fā)明考慮到了這些eIF-5A同工型的敲減(know down)突變體。
[0017]本發(fā)明還涉及Νε-(4_氨丁基)賴氨酸合酶("DHS")及編碼DHS的多核苷酸.本發(fā)明也提供了 DHS的反義和正義多核苷酸.本發(fā)明還提供了含有DHS正義和反義多核苷酸的表達載體.本發(fā)明還涉及在植物及植物部分以及具有DHS修飾表達的子代中調節(jié)(提高/上調或者抑制/下調)DHS表達的方法。此外，本發(fā)明考慮到了 DHS的敲減突變體。
[0018]附圖的簡要描述
[0019]圖1所示的是從擬南芥中分離的三種eIF_5A同工型——衰老誘導eIF_5A (SEQ IDNO:58 ;第一行)(先前在美國專利6，538，182和待審申請09/725，019中描述)、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A(SEQ ID NO:59 ;第二行)和生長eIF_5A(SEQ ID NO:60 ;第三行)——的序列比對。同一的氨基酸用虛線標識出來，用于肽設計的區(qū)域用實線標示出來。每個肽包含來自eIF-5A序列的11個氨基酸并在N末端帶有半胱氨酸以備在出現(xiàn)KLH時用于連接.[0020]圖2所示的是這三種擬南芥同工型編碼區(qū)的序列比對。行I是衰老誘導eIF-5A(SEQ ID NO:61).行 2 是創(chuàng)傷 / 病原體誘導 eIF_5A(SEQID NO:62)。行 3 是生長eIF-5A(SEQ ID NO:63).框中是在三個同工型中同一的堿基對.所述的序列只包含從甲硫氨酸(ATG)到終止密碼子的編碼區(qū)域.[0021]圖3提供了擬南芥衰老誘導eIF_5A的基因組序列(SEQ ID NO:78)。虛線標識的是用于設計引物的區(qū)域.5’末端引物包含HindIII酶切位點，3’末端引物包含SacI酶切位點以保證在連接到雙元載體是具有適宜的方向.框中的部分表示在Northern印跡中用作探針的3’末端.[0022]圖4提供了擬南芥創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A的基因組序列(5EQ ID NO:79).虛線標識的是用于設計引物的區(qū)域.5’末端引物包含XhoI酶切位點，3’末端引物包含SacI酶切位點以保證在連接到雙元裁體是具有適宜的方向.框中的部分表示在Northern印跡中用作探針的3’末端。
[0023]圖5提供了擬南芥生長eIF_5A的基因組序列(SEQ ID NO:52)。虛線標識的是用于設計引物的區(qū)域.5’末端引物包含XhoI酶切位點，3’末端引物包含SacI酶切位點以保證在連接到雙元裁體是具有適宜的方向.框中的部分表示在Northern印跡中用作探針的3’末端。[0024]圖6 是雙元載體(binary vector) pKYLX71_35S2 的圖譜(SEQ ID NO:80)。雙元載體pKYLX71-35S2包含用于在大腸桿茵中篩選轉化子的四環(huán)素抗性，以及在含卡那霉素的MS平板中篩選轉化子的卡那霉素抗性.啟動子是雙35S啟動子，其比單35S啟動子表達水平高。RbcS3’是I，5-二磷酸核酮糖羧化酶的UTR.[0025]圖7是雙元載體pGEM?-T Easy Vector的圖譜.多克隆位點中間的T突出端提供了 PCR產(chǎn)物的插入位點.Ampr基因用于在存在氨芐青霉素的條件下篩選轉化子.[0026]圖8所示的是哥倫比亞生態(tài)型的野生型擬南芥不同組織中所有三種eIF_5A同工型的Western印跡.各道的標識如下:2，3，4，5，6，7道分別表示收集的2，3，4，5，6，7周齡的總蓮座葉，Tr是用5% PEG處理的植物的葉；U是水洗的PEG對照植物的葉；B是關閉的未開花芽；F1是從未開的花芽到衰老的花的所有年齡范圍的花；Si是在第6周采集的長角果；Se是進行了 I天吸水飽和的種子；St是在第6周收集的莖.[0027]圖9是哥倫比亞生態(tài)型的野生型擬南芥葉子受感染72小時后衰老誘導eIF_5A和創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的Western印跡.在這些植物都在4周齡時衰老誘導At eIF_5A的表達水平保持恒定。創(chuàng)傷誘導AteIF-5A在有毒處理植株中被上調.生長AteIF_5A沒有檢測到，因此不包含在圖中.[0028]圖10是哥倫比亞生態(tài)型的野生型擬南芥葉子受損傷72小時后三種eIF_5A同工型的Northern印跡.葉片受到止血鉗的損傷。在受損傷后立刻、損傷后I小時及9小時進行收集.創(chuàng)傷誘導At eIF-5A轉錄物是在受損傷9小時后唯一增加的.生長At eIF_5A的表達水平，盡管在開始時較低，在創(chuàng)傷事件中還降低了.[0029]圖11所示的是來自基因組DNA的PCR產(chǎn)物，泳道1、2和3分別是擬南芥衰老誘導eIF-5A(ATeIF-5A)、創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A和生長AteIF_5A.單一的上部的帶被切出并純化用于連接到PGEM.[0030]圖12所示的是pGEM中衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A和生長AteIF-5A基因組序列的瓊脂糖凝膠。將pGEM.:衰老誘導At eIF_5A，pGEM:創(chuàng)傷誘導AteIF-5A ;pGEM生長AteIF-5A用EcoR I消化以鑒定含有合適大小的插入物的陽性轉化子克隆。對陽性質粒進行測序，以確認序列適合在植物中進行過表達.[0031]圖13所示的是PKYLX71中創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A和生長AteIF_5A基因組序列的瓊脂糖凝膠.用適當?shù)拿高M行雙酶切并用相應的引物進行PCR篩選能在含四環(huán)素的平板上生長的插入了創(chuàng)傷誘導At eIF-5A或生長AteIF_5A的克隆.[0032]圖14是用具有正義創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A的構建體所轉化的植株的Tl平板的圖片.平板上的兩個轉化子用黑色圈出，相應于植物系13和14.野生型對照用白色圈出.[0033]圖15是在4周齡時用正義創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A所轉化的Tl植株的圖片.轉基因系用P標記表示，野生植株用W標記表示，雙元裁體對照植物用Y標記表示.植物系6，8，10,13，14沒有產(chǎn)生種子.[0034]圖16是在5.5周齡時用正義創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A所轉化的Tl植株的圖片.圖中只包含很小的植物系.植物系1，4，12產(chǎn)生了種子，而余下的沒有產(chǎn)生種子最終
死亡.[0035]圖17是播種10天后用正義創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A所轉化的T2植株的圖片.卡那霉素抗性和(黑色植株)和非轉化的缺乏卡那霉素抗性的(淺色植株)的混合表明所有的T2系保持雜合.野生型對照植株用白圈示出.植物系12沒有包含在圖中，因為其只長成了一個轉化子.[0036]圖18是播種10天后用正義生長ATeIF_5A所轉化的Tl植株的圖片.讀平板上用黑圈標示三個轉化子， 相應于植物系6，7和8.野生型對照植株用白圈示出.[0037]圖19是在4周齡時用正義生長ATeIF_5A所轉化的Tl植株的圖片.轉化系用B標記標識，野生型對照用W標記或不用標記?？针p元裁體(Y標記)在圖的下部，其表現(xiàn)與野生型沒有區(qū)別.[0038]圖20是用正義生長ATeIF_5A系所轉化的T2植株的Western印跡.用一個母本株系的代表確定各植物系中的總體表達水平.[0039]圖21是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系1A-1D)所轉化的T2植株。轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓)?？针p元裁體用Y標記表示(黑圈).株系LinelA (在黑框中示出)要進行到T3。
[0040]圖22是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系2A-1D)所轉化的T2植株。轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓)?？针p元裁體用Y標記表示(黑圈).株系Line2D(在黑框中示出)要進行到T3.[0041]圖23是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系4A-D)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓).空雙元裁體用Y標記表示(黑圈)。株系Line4D (在黑框中示出)要進行到T3.[0042]圖24是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系15A-D)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓).空雙元載體用Y標記表示(黑圈).株系Linel5A(在黑框中示出)要進行到T3.[0043]圖25是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系8A-D)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用w標記表示(白色橢圓)。空雙元載體用Y標記表示(黑圈).株系LineSD (在黑框中示出)要進行到T3。
[0044]圖26是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系9E-H)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓).空雙元裁體用Y標記表示(黑圈).株系Line9H(在黑框中示出)要進行到T3。
[0045]圖27是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系11A-D)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色橢圓).空雙元載體用Y標記表示(黑圈).株系LinellC(在黑框中示出)要進行到T3。
[0046]圖28是在4周齡(上面)、5周齡(下左)和6周齡(下右)時用正義生長ATeIF-5A (系16A-D)所轉化的T2植株.轉化系用B標記表示(灰圈)野生型對照用W標記表示(白色 橢圓)?？针p元裁體用Y標記表示(黑圈).株系Linel6C(在黑框中示出)要進行到T3。
[0047]圖29是來源于多個植物系的擬南芥種子照片(包括野生型對照和使用正義生長ATeIF-5A轉化的植物系).植物系IlC和16C只有野生型種子平均大小的88%和87%，而植物系2D和2H比野生型大273%和299%。
[0048]圖30是用正義生長ATeIF_5A所轉化的每個植物亞系平均種子大小的條線圖.各植物系分成亞系A-H在圖中并沒有單獨標示出來。雙元裁體和野生型對照相應于最后的兩個bar.以n=10計算由誤差線表示的標準誤差。
[0049]圖31是用正義生長ATeIF_5A所轉化的每個植物亞系各自種子重量的條線圖.每個植物系具有亞系A-H.雙元裁體和野生型對照相應于最后的兩個bar.[0050]圖32是表現(xiàn)個體種子重量與個體種子體積之間比例關系的圖.[0051]圖33是表現(xiàn)每種用正義生長ATeIF_5A轉化的植物亞系中每個植株種子產(chǎn)量的條線圖.每個植物系具有亞系A-H.雙元載體和野生型對照相應于最后的兩個bar。
[0052]圖34在正義生長ATeIF_5A植株中所表現(xiàn)出的表型的總結.根據(jù)Western印跡確定的表達水平將表型分類.雙陰影線表示高水平表達的株系.單陰影線表示中等水平表達的株系.低水平或無表達的用白色表示。無表達的株系可能是由共抑制所導致.[0053]圖35所示的是轉基因擬南芥植株(用反義全長衰老誘導eIF_5A轉化)與野生型植株的比較.轉基因植株表現(xiàn)出衰老延遲.轉基因植物變矮，小蓮座葉數(shù)量增加，表現(xiàn)出衰老延遲.[0054]圖36-38所示的是植株(用反義生長eIF_5A轉化)的照片.[0055]圖39所示的是用來構建可產(chǎn)生反義擬南芥3’DHS的載體的引物(SEQ ID NOS:81-82).在SEQ ID NOS:83-84中分別給出了擴增的擬南芥序列，按出現(xiàn)順序排列.[0056]圖40所示的是裁體構造.[0057]圖41所示的是從擬南芥中分離到的創(chuàng)傷/病原體誘導的ATeIF_5A的序列(DNA序列如SEQ ID NO:54所示；蛋白如SEQ ID NO:55所示)，以及反義構建體上的位置.引物如 SEQ ID NOS:85-86 所示。
[0058]圖42所示的是載體構造(分別為SEQ ID NOS =87-89,按出現(xiàn)順序排列).[0059]圖43所示的是接種了假單胞菌的葉片的平皿計數(shù)。
[0060]圖44中的圖表所示的是在反義轉基因植株及野生型中CFUs.[0061]圖45描述的是從番茄葉cDNA文庫中獲得的番茄葉DHS cDNA序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)與所推定的氨基酸序列(SEQ ID NO:2).[0062]圖46描述的是通過將擬南芥基因庫中未鑒定的基因組序列(SEQ ID NO:5 ;蛋白如SEQ ID N0:6所示)與番茄DHS序列比對所獲得的擬南芥DHS基因的核苷酸序列.推定氨基酸序列間的空位是內含子。圖46B描述的是所推定的擬南芥DHS氨基酸序列(SEQ IDNO:6).圖46C描述的是通過PCR所獲得的600個堿基對的擬南芥DHS cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:26).圖46D描述的是所推定的擬南芥DHS cDNA片段的氨基酸序列(SEQ IDNO:92).[0063]圖47是所推定的全長番茄葉DHS氨基酸序列(SEQ ID NO:2的1-369殘基)及所推定的全長擬南芥衰老誘導的DHS氨基酸序列(SEQ ID NO:6)與人(SEQ ID NO:3)、酵母(SEQ ID N0:45)、真 菌(SEQ ID NO:44)和古細菌 DHS 蛋白序列(SEQ ID NO:46)的比對.三個或者四個序列都一致的氨基酸用方框標出.[0064]圖48是番茄DHS cDNA的限制性圖譜.[0065]圖49是以32P_dCTP標記的全長番茄DHS cDNA為探針、從番茄葉中分離的基因組DNA 的 Southern 印跡.[0066]圖50是在發(fā)育不同階段從番茄花中分離到的RNA的Northern印跡.上圖是用溴化乙錠染色的總RNA的凝膠.每個泳道含IOyg RNA0下圖是以32P_dCTP標記的全長番茄DHS cDNA為探針的Northern印跡的放射性自顯影圖.[0067]圖51是以32P_dCTP標記的全長番茄DHS cDNA為探針、在果實成熟的不同階段從番茄果實中分離到的RNA的Northern印跡.每個泳道含10 μ g RNA.[0068]圖52是從通過用2M山梨醇處理6小時導致干燥脅迫的番茄葉中分離到的RNA的Northern印跡.每個泳道含10 μ g RNA.印跡所用探針是用32P_dCTP標記的全長番茄DHScDNA.[0069]圖53是從暴露在冷凍溫度下的番茄葉中分離到的RNA的Northern印跡.圖53A是是用溴化乙錠染色的總RNA的凝膠.每個泳道含10 μ g RNA.圖53B是以32P_dCTP標記的全長番茄DHS cDNA為探針的Northern印跡的放射性自顯影圖.圖53C所示的是以葉滲出液為指示測定的相應滲漏數(shù)據(jù).[0070]圖54是不含PolyA尾和5’末端非編碼區(qū)的康乃馨DHS全長(1384個堿基對)cDNA克隆核苷酸序列(SEQ ID N0:9).在核苷酸序列下面所示的是推定的氨基酸序列(373氨基酸)(SEQ ID NO:10)。
[0071]圖55是以32P_dCTP標記的全長擬南芥DHS cDNA為探針、從正在衰老的擬南芥葉中分離到總RNA的Northern印跡.上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠.[0072]圖56是在發(fā)育不同階段從康乃馨花的花瓣中分離到的總RNA的Northern印跡.印跡所用探針是用32P-dCTP標記的全長康乃馨DHScDNA.上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠。
[0073]圖57是番茄果實衰老誘導eIF_5A基因的核苷酸序列(上面)(SEQ ID NO:11)和推定的氨基酸序列(下面)(SEQ ID NO: 12)。
[0074]圖58是康乃馨衰老誘導eIF_5A基因的核苷酸序列(上面)(SEQ ID NO: 13)和推定的氨基酸序列(下面)(SEQ ID NO:14).[0075]圖59是擬南芥衰老誘導eIF_5A基因的核苷酸序列(上面)(SEQ ID NO: 15)和推定的氨基酸序列(下面)(SEQ ID NO:16).[0076]圖60是在發(fā)育不同階段從擬南芥植株葉片中分離到的總RNA的Northern印跡.印跡所用探針是用32P-dCTP標記的全長擬南芥DHScDNA和全長衰老誘導eIF_5A.上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠。
[0077]圖61是在發(fā)育階段的顯色期(BK)、紅硬期(RF)和紅軟期(RS)從番茄果實中分離到的總RNA的Northern印跡.印跡所用探針是用32P_dCTP標記的全長DHS cDNA和全長衰老誘導eIF-5A。在紅軟果實中，隨著果實成熟DHS和eIF-5A均上調.上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠.[0078]圖62是從用山梨醇處理以誘導干旱脅迫的番茄葉片中分離到的總RNA的Northern印跡.C是對照，S是由山梨醇處理的.印跡所用探針是用32P_dCTP標記的全長DHS cDNA和全長衰老誘導eIF-5A。對干旱脅迫產(chǎn)生應答，eIF_5A與DHS均上調.上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠。
[0079] 圖63是從番茄植株的花蕾和已開花并正在衰老的花中分離到的總RNA的Northern印跡.印跡所用探針是用32P_dCTP標記的全長衰老誘導的DHS cDNA和全長衰老誘導eIF-5A。在已開花/正在衰老的花中eIF-5A與DHS均上調。上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠.[0080]圖64是從冷凍損傷的番爺葉片中分離到的總RNA的Northern印跡.印跡所用探針是用32P-dCTP標記的全長DHS cDNA和全長衰老誘導eIF-5A.在再升溫過程中隨著冷凍損傷的發(fā)展eIF-5A與DHS均上調。上面的是放射性自顯影圖，下面的是溴化乙錠染色的凝膠。
[0081]圖65是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸的3.1周齡的擬南芥野生型(左)和以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖80所示)的轉基因植株的照片.[0082]圖66是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸的4.6周齡的擬南芥野生型(左)和以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖80所示)的轉基因植株的照片.[0083]圖67是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸的5.6周齡的擬南芥野生型(左)和以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖80所示)的轉基因植株的照片.[0084]圖68是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸的6.1周齡的擬南芥野生型(左)和以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖80所示)的轉基因植株的照片.[0085]圖69是表明三種以反義方向表達DHS基因的Tj轉基因擬南芥植株系中種子產(chǎn)量增加的圖片.種子產(chǎn)量以種子體積來表示。顯示了野生型植株在ri=30時的SE.[0086]圖70是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸和增加植株大小的以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖80所示)的轉基因番茄植株(左)以及野生型植株(右)的照片.照片于植株幼苗轉移到土壤中后18天拍攝.[0087]圖71是表明轉基因植株具有增大葉片尺寸和增加植株大小的以反義方向表達DHS基因3’末端(序列如圖36所示)的轉基因番茄植株(左)以及野生型植株(右)的照片。照片于植株幼苗轉移到土壤中后32天拍攝.[0088]圖72至79是野生型(上圖)與以反義方向表達全長DHS基因的轉基因植株(下圖)的番茄果實的照片.在發(fā)育的顯色期階段采集果實，使其在生長箱中成熟.在每個圖的左上角所示的是采集后的天數(shù)。
[0089]圖80是以反義方向用于轉化植株的擬南芥衰老誘導的DHS基因3’末端的核苷酸(上)(SEQ ID NO:30)和推定的氨基酸(下)(SEQ ID NO:90)序列.[0090]圖81是以反義方向用于轉化植株的番茄DHS基因3’末端的核苷酸(上)(SEQ IDNO:31)和推定的氨基酸(下)(SEQ ID NO:91)序列.[0091]圖82是用于分離全長擬南芥基因的長600個堿基對的擬南芥DHS探針的核苷酸(上)(SEQ ID NO:26)和推定的氨基酸(下)(SEQ ID NO:92)序列.[0092]圖83是用于分離全長康乃馨基因的長483個堿基對的康乃馨DHS探針的核苷酸(上)(SEQ ID NO:27)和推定的氨基酸(下)(SEQ ID NO:93)序列.[0093]圖84 (a)和(b)是以反乂方向表達DHS基因3’末端(序列如圖81所不)的轉基因番茄植株的番茄果實(右)與野生型植株的番茄果實(左)的照片.然而野生型果實出現(xiàn)了蒂腐，轉基因果實卻沒有。[0094]圖85所示的是來自幾種植物的多種eIF_5A同工型的序列比對。也提供了羥丁賴氨酸保守區(qū)的序列比對.SEQ ID NO:S4，94-106和108-125分別如圖所示，按出現(xiàn)順序排列.[0095]圖86提供了番茄衰老誘導eIF-5A多核苷酸(SEQ ID NO:126)和氨基酸序列(SEQID NO:127).[0096]圖87提供了擬南芥衰老誘導eIF_5A及pKYLX71-正義衰老誘導eIF_5A的構造.引物序列分別如SEQ ID N0S128-129所示，按出現(xiàn)順序排列.裁體序列分別如SEQ IDN0S130-132所示，按出現(xiàn)順序排列.[0097]圖88提供了番茄衰老誘導eIF_5A及pKYLX71-正義衰老誘導eIF_5A的構造.引物序列分別如SEQ ID N0S133-134所示，按出現(xiàn)順序排列.裁體序列分別如SEQ IDN0S135-137所示，按出現(xiàn)順序排列.[0098]圖89提供了擬南芥對照株與含衰老誘導eIF_5A正義多核苷酸的轉基因植株的比較照片。轉基因植株比對照植株具有更粗的花梗.[0099]圖90和91所示的是含衰老誘導eIF_5A正義多核苷酸的轉基因植株(圖90-擬南芥，圖91-番茄)木質化程度更高，其表現(xiàn)是在轉基因植株中木質部增加了。木質部區(qū)域被藤黃酹-HCl染成灰色,bar=100 μ m.[0100]圖92提供了擬南芥對照株與含衰老誘導eIF_5A正義多核苷酸的轉基因植株的比較照片.在擬南芥中使用了番茄衰老誘導eIF-5A正義多核苷酸.轉基因植株比對照植株具有更粗的花梗.[0101]圖93和94是表明在含衰老誘導eIF_5A正義多核苷酸的轉基因植株中木質化程度更高的條線圖.圖94所關注的是番茄衰老誘導eIF-5A正義多核苷酸.[0102]圖95提供了油菜生長eIF-5A氨基酸序列(SEQ ID NO:67)和多核苷酸序列(SEQID NO:66).[0103]圖96提供了油菜生長eIF_5A及pKYLX71-正義生長eIF_5A的構造。引物如SEQID NO:138所示.裁體序列分別如SEQ ID N0S139-141所示，按出現(xiàn)順序排列.[0104]圖97提供了油菜DHS氨基酸序列(SEQ ID NO:71)和和多核苷酸序列(SEQ IDNO:70).[0105]圖98提供了油菜生長DHS及pKYLX71-正義DHS的構造.3’UTR如SEQ ID NO:142所示.裁體序列分別如SEQ ID N0S143-145所示。
[0106]圖99以條線圖的形式表現(xiàn)了 DHS表達抑制可在油菜中增加種子產(chǎn)量.[0107]圖100以條線圖的形式表現(xiàn)了生長eIF_5A同工型的上調——從左到右為擬南芥、油菜、番茄，以及番茄DHS的上調.[0108]圖101提供了番茄生長eIF-5A氨基酸序列(SEQ ID NO:65)和多核苷酸序列(SEQID NO:64).[0109]圖102提供了番茄生長eIF_5A及pKYLX71-正義番茄生長eIF_5A的構造.引物序列分別如SEQ ID N0S146-147所示，按出現(xiàn)順序排列。載體序列分別如SEQ ID N0S148-150所示，按出現(xiàn)順序排列.[0110]圖103提供了番茄創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A氨基酸序列(SEQ ID NO:57)和多核苷酸序列(SEQ ID NO:56).[0111]圖104a和b提供了番茄創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A及PKYLX71-正義番茄創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的構造。引物序列分別如SEQ ID N0S151-152所示，按出現(xiàn)順序排列.載體序列分別如SEQ ID N0S153-155所示，按出現(xiàn)順序排列。
[0112]圖105提供了萵苣DHS多核苷酸序列的一部分。引物序列分別如SEQ IDN0S156-157所示，按出現(xiàn)順序排列.萵苣序列分別如SEQ ID N0S158-159所示，按出現(xiàn)順序排列.[0113]圖106提供了 PTA7001-3' UTR反義萵苣DHS的構造.[0114]圖107A和B提供了苜蓿DHS氨基酸和多核苷酸序列.圖107A給出了編碼SEQ IDNO:73 的 SEQ ID NO:72 的 1-1861 位核苷酸.圖 107B 給出了 SEQ ID NOS:72 (核苷酸)和73(蛋白).[0115]圖108A和B提供了香蕉DHS氨基酸序列(SEQ ID NO:75)和多核苷酸序列(SEQID NO:74).[0116]圖109A和B提供了三角葉楊DHS氨基酸序列(SEQ ID NO:77)和多核苷酸序列(SEQ ID NO:76).[0117]圖110提供了部分香蕉黑條葉斑病菌DHS氨基酸序列和多核苷酸序列.圖中分別給出了編碼 164/53，47(引物)，107 和 53 的 SEQ ID NOS:68，160，69，161-163，165，163，按出現(xiàn)順序排列.[0118]圖111所示的是eIF_5A活化的示意圖.[0119]圖112是康乃馨老化及eIF_5A表達的Northern分析。[0120]圖113所示的是轉基因康乃馨(反義衰老誘導eIF_5A)表現(xiàn)出更長的切花保存期限.[0121]圖114所示的是香蕉(使用了反義DHS的轉基因植株)延遲腐爛。
[0122]圖115所示的是番茄(使用了反義DHS的轉基因植株)延遲腐爛。
[0123]圖116所示的是在子葉、葉片和花中擬南芥衰老誘導eIF-5A(AteIF-5Al)的表達.[0124]圖117所示的是在轉基因擬南芥中(擬南芥反義衰老誘導eIF_5A) (AteIF_5Al)擬南芥葉片的延遲衰老.[0125]圖118所示的是在第一對真葉中擬南芥衰老誘導eIF_5A::GUS的表達.[0126]圖119所示的是轉基因植株(反義衰老誘導eIF_5A)比野生型植株具有更少的木質部.[0127]圖120所示的是在轉基因植株(衰老誘導eIF_5A的正義構建體)中增強的木質部形成。
[0128]圖121所示的是轉基因植株(通過反義構建體減少了脅迫誘導eIF_5A的表達)對干旱的抗性。
[0129]圖122是表現(xiàn)在干旱壓力下野生型與轉基因擬南芥存活的條線圖。轉基因植株(通過反義構建體減少了脅迫誘導eIF-5A的表達)的存活增加了。
[0130]圖123所示的是野生型油菜與轉基因油菜(通過反義構建體減少了脅迫誘導eIF-5A的表達) 的比較，表明轉基因油菜具有增高了的生物量.[0131]圖124所示的是轉基因油菜系(通過反義構建體減少了脅迫誘導eIF_5A的表達)種子產(chǎn)量增加了，超過了野生型植株.[0132]圖125表明在受到丁香假單胞菌感染之后創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A被上調。
[0133]圖126所示的是創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A同工型的反義抑制阻止了致命病原體的感染.轉基因植株在感染抑制上表現(xiàn)出超過對照植株99%的提高.[0134]圖127-130所示的是轉基因油菜(反義創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A同工型)對核盤茵感染表現(xiàn)出抗性.“WT”是來自野生型植株的葉片?！癟G-1”和“TG-5”是來自轉基因植株的葉片.[0135]圖131所示的是轉基因香蕉(反義DHS)(左邊)和野生型香蕉(右邊)的照片，表明轉基因植株比野生型對照具有更多的生物量。
[0136]圖132所示的是轉基因番茄(正義方向的生長eIF_5A)(左邊)比野生型對照植株(右邊)的生物量增加了.[0137]圖133所示的是轉基因油菜(正義方向的生長eIF_5A)比野生型對照植株的生物量增加了.[0138]圖134所示的是轉基因油菜(正義方向的生長eIF_5A)比野生型對照植株的種子產(chǎn)量增加了。
[0139]圖135提供了萵苣DHS序列.核酸序列為SEQ ID NO:166，氨基酸序列為SEQ IDNO:167.[0140]圖136提供了部分矮牽牛DHS核苷酸(SEQ ID NO:170)和氨基酸序列(SEQ IDNO:171)，以及用于分離讀DHS序列的兩條引物(SEQ ID NO =168-169).[0141]圖137提供了苜蓿創(chuàng)傷/病原體eIF_5A的核酸序列(SEQ ID NO:172)和氨基酸序列(SEQ ID NO:173).[0142]圖138提供了苜蓿衰老eIF_5A的核酸序列(SEQ ID NO:174)和氨基酸序列(SEQID NO:175)。
[0143]圖139提供了苜蓿脅迫eIF_5A的核酸序列(SEQ ID NO:176)和氨基酸序列(SEQID NO:177)。
[0144]圖140提供了苜蓿生長eIF_5A的核酸序列(SEQ ID NO:178)和氨基酸序列(SEQID NO:179).[0145]圖141-144 提供了萵苣中不同 eIF_5A 同工型(LF5A-1、LF5A-3、LFA-2 和 LFA-1)的部分序列.圖141給出了 SEQ ID NOS:180(核苷酸)和181 (蛋白).圖142給出了 SEQID NOS:182(核苷酸)和 183(蛋白).圖 143 給出了 SEQ ID NOS:184(核苷酸)和 185(?白)。圖144分別給出了 SEQ ID NOS =186-187和210-211，按出現(xiàn)順序排列.[0146]圖145提供了番茄生長eIF_5A的序列(核酸為SEQ ID NO:188)和氨基酸序列(SEQ ID NO:189).[0147]圖146提供了番茄脅迫eIF_5A的序列(核酸為SEQ ID NO:190)和氨基酸序列(SEQ ID NO:191).[0148]圖147A-C提供了從三角葉楊樹的4種eIF_5A(" Fl "(編碼SEQ ID NO:193的SEQ ID NO:192)、" F2"(編碼 SEQ ID NO:195 的 SEQ ID NO:194)、" F3"(編碼 SEQID NO:197 的 SEQ ID NO:196)和"F4"(編碼 SEQ ID NO:199 的 SEQ ID NO:198))中分離的eIF-5A核酸和氨基酸序列.[0149]圖148(a)和(b)提供了多種DHS的氨基酸序列比對，表明DHS在物種間具有很高保守性.圖中分別給出了 SEQ ID NOS:45，2，200，73，77，201，10，167，75，202 和 3，按出現(xiàn)順序排列.[0150]圖149所示的是用于培養(yǎng)DHS下調的萵苣的液體培養(yǎng)條件。萵苣植株在液體中培養(yǎng)，因為該條件對獲得可控的持續(xù)的通過糖皮質激素誘導的啟動子進行轉基因誘導是比較理想的誘導物，地塞米松直接加到液體培養(yǎng)液中(A)6周齡植株，在收獲前；(B)在罐中氣泡石的觀察；(C)具有3個開口用來支持植株的蓋子及中心的空氣譜線。
[0151]圖150所示的是在切開的、萵苣DHS被下調表達的萵苣中的延遲褐變.[0152]圖151所示的是表明具有萵苣DHS反義3’末端的轉基因萵苣表現(xiàn)出DHS表達下降的Western印跡.[0153]圖152所示的是所構建的用于使用DHS反義3’末端來轉化擬南芥的載體.[0154]圖153所示的是DHS被下調的擬南芥植株比野生型植株的生長速率/生物量提高了(用圖152中所示的載體來產(chǎn)生轉基因擬南芥).[0155]圖154所示的是DHS被下調的擬南芥植株比野生型植株的生長速率/生物量提高了(用圖152中所示的載體來產(chǎn)生轉基因擬南芥)。
[0156]圖155所示的是DHS被下調的擬南芥植株比野生型植株的種子產(chǎn)量提高了(用圖152中所示的裁體來產(chǎn)生轉基因擬南芥).[0157]圖156所示的是DHS被下調的擬南芥植株比野生型植株的根部發(fā)育提高了(用圖152中所示的裁體來產(chǎn)生轉基因擬南芥).[0158]圖157所示的是DHS被下調的油菜植株比野生型植株的生長速率/生物量提高了.[0159]圖158所示的是表明反義DHS導致DHS表達降低的Western印跡.[0160]圖159所示的是DHS被下調的油菜植株比野生型植株的長角果大小提高了.[0161]圖160所示的是DHS被下調的油菜植株比野生型植株的種子產(chǎn)量提高了
[0162]圖161(a)和(b)所示的是DHS被下調的油萊植株，每粒種子的油量沒有變化，油中脂肪酸的成分也沒有變化.[0163]圖162所示的是將三角葉楊生長eIF_5A以正義方向導入擬南芥從而使生長eIF-5A上調的效果.所獲得的植株的生長速率/生物量均提高了。
[0164]圖163所示的是將三角葉楊生長eIF_5A以正義方向導入擬南芥從而使生長eIF-5A上調的效果.所獲得的植株的生長速率/生物量均提高了。
[0165]圖164所示的是將三角葉楊生長eIF_5A以正義方向導入擬南芥從而使生長eIF-5A上調的效果.所獲得的植株的生長速率/生物量均提高了.[0166]圖165所示的是當在油菜植株中以正義方向使用油菜或者擬南芥生長eIF_5A時，油菜植株中的種子產(chǎn)量會提高.[0167]圖166所示的是用突變的衰老eIF_5A (不能被羥丁賴氨酸化)轉化的轉基因擬南芥比野生型擬南芥的生物量提高了.[0168]圖167所示的是用突變的衰老eIF_5A (不能被羥丁賴氨酸化)轉化的轉基因擬南芥比野生型擬南芥的生物量提高了.[0169]圖168所示的是在擬南芥中以正義方向表達的、從三角葉楊(Populasdeltoides)中分離的生長eIF_5A，可使得種子產(chǎn)量高于對照植株。[0170]圖169比較了具有以正義方向表達的三角葉楊生長因子eIF_5A的三種不同轉基因擬南芥系的種子產(chǎn)量，表明這三系的種子產(chǎn)量均提高了。
[0171]圖170 提供了 Populas deltoides (三角葉楊)生長 eIF_5A 全長 cDNA (SEQ IDNO:203)和該蛋白全長氨基酸序列(SEQ ID NO:204)。圖片說明給出了 SEQ ID NO:203的40-57 及 530-550 核苷酸.[0172]圖171提供了所構建的用于以正義方向使用三角葉楊生長eIF_5A轉化擬南芥的載體.引物序列分別如SEQ ID N0S205-206所示，按出現(xiàn)順序排列.載體序列分別如SEQID N0S207-209所示，按出現(xiàn)順序排列.[0173]圖172和173所示的是當使用不同水平的肥料——包括最佳的、未達最佳的、超最佳的濃度——處理時，轉基因擬南芥植株(已使用圖171中所示的載體轉化)比對照植株的生物量提聞了.[0174]圖174和175所示的是當使用不同水平的肥料——包括最佳的、未達最佳的、超最佳的濃度——處理時，轉基因擬南芥植株(已使用突變的衰老誘導eIF-5A轉化)比對照植株的生物量提高了。
[0175]詳細描述
[0176]本文所用術語“植物”是指完整的植物、植物的一部分、植物細胞或者植物細胞群.可以用于本發(fā)明方法的植物類型沒有限制，包括，譬如，乙烯敏感及乙烯不敏感的植物；諸如杏、蘋果、桔子、香蕉、柚子、梨、番茄、草莓、鱷梨等這樣的結果實的植物；諸如胡蘿
卜、豌豆、萵苣、卷心菜、蕪菁、馬鈴薯、椰菜、蘆筍等這樣的蔬菜；諸如康乃馨、玫瑰、菊花等這樣的花；諸如玉米、水稻、大豆、苜蓿等這樣的農作物植物；諸如落葉樹、針葉樹、常青樹等這樣的森林物種，一般而言，可以是任何可吸收并表達本發(fā)明DNA分子的植物?？砂ú煌稊?shù)水平的植物，包括單倍體、二倍體、四倍體和多倍體。植物可以是單子葉植物或者雙子葉植物.[0177]本文中轉基因植物的定義是以某種途徑進行了遺傳修飾的植物，包括但不限定于其基因組中整合了異源或同源衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF_5A、脅迫eIF-5A或者DHS的植物。被改變的遺傳物質可編碼蛋白、含有調節(jié)或控制序列，或
者，本身是或包含反義序列或正義序列或編碼反義RNA或正義RNA-是植物衰老誘導
eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF-5A或者DHS DNA或mRNA序列或其一部分的反義或正義部分。
[0178]本文所用術語“雜交”通常用來指在合適嚴謹條件下——對本領域的技術人員而言這個條件是顯而易見的，依賴于探針序列與靶序列性質的核酸的雜交.雜交和洗脫條件在本領域是眾所周知的，根據(jù)所期望的嚴謹度通過調整溫育時間、溫度和/或溶液離子強度可容易地對條件進行調節(jié).參見，例如，Sambrook, J.et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Press，ColdSpring Harbor, NewYork, 1989.根據(jù)所雜交序列的長度，尤其是探針序列的長度、核酸相對G-C含量及允許發(fā)生錯配的數(shù)目來選擇條件。當在具有較低程度互補性的鏈間進行部分雜交時，低嚴謹度條件是優(yōu)選的。當期望完全或近乎完全互補時，高嚴謹度條件是優(yōu)選的.本文所示的高嚴謹度條件如下:雜交液含有6XSSC、0.01M EDTA、I XDenhardt溶液和0.5% SDS.對于克隆DNA片段，雜交于68°C進行約3到4小時，對于總真桉DNA進行約12到約16小時。對于低嚴謹度，雜交溫 度降低到處于雙鏈體融解溫度(TM)之下的約42°C。已知Tm是G-C含量和雙鏈體長度以及溶液離子強度的函數(shù).[0179]本文所用術語“基本上序列同一”或者“基本上同源”是用來表示核苷酸序列或者氨基酸序列與另一個核苷酸或者氨基酸序列在基本上結構或功能上等價.具有基本上序列同一性或者基本上同源性的序列其結構或功能上的差異是微不足道的；也就是說，不會影響序列在預期應用中發(fā)揮功能的能力。例如，差異可能是由于不同物種間在密碼子使用上的固有變化.如果存在相當數(shù)量的序列交迭、或者兩個或多個序列具有相似性、或者即便序列在長度或結構上有差異但不同序列仍表現(xiàn)出相似的物理特性，則結構上的差異可忽略。這類特性包括，例如，在特定條件下雜交的能力，或者對于蛋白而言的免疫交叉反應性，相似的酶活等。本領域的技術人員根據(jù)本領域已知方法可輕易確定這些特性中的每一個。
[0180]此外，如果兩個核酸序列具有至少約百分之70，更優(yōu)選的為百分之80，最優(yōu)選的為百分之90序列相似性，則它們是“基本上互補”的。兩個氨基酸序列如果在多肽活性部位具有至少百分之70的相似性則是基本上同源的.[0181]本文所用術語與DNA或RNA分子的“相應部分雜交”，是指與譬如寡聚核苷酸、多核苷酸或者任何核苷酸序列(以正義或者反義方向)雜交的分子可識別另一個具有大約相同大小并有足夠序列相似性的序列，并可在合適條件下進行有效雜交.例如，100個核苷酸長度的來自番茄創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A3’編碼或非編碼區(qū)的反義分子可識別分別來自AT創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A基因或者任何其它植物的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A基因內部3’編碼或非編碼區(qū)的100個核苷酸長度的核苷酸序列部分并與之雜交，一只要在兩個序列之間具有約70%或者更高的序列相似性.可以了解“相應部分”的大小可以在雜交中容忍某些錯配，因此“相應部分’’可小于或者大于所雜交的分子，例如，大于或小于20-30%，優(yōu)選地只大于或小于12-15%.[0182]本文所用術語核酸(或多核苷酸)的“功能衍生物”編碼衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或DHS的基因或者核苷酸序列的片段、變異體、同源物或類似物。功能衍生物至少保留了衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或DHS編碼DNA的一部分功能，這使得它的用途與本發(fā)明一致.這種功能包括在高嚴謹度條件下與天然分離的衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或DHS、或者來自另一種植物的基本上同源的DNA、或者其RNA轉錄物進行雜交的能力，而且以反義方向存在的衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或DHS可抑制衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或DHS的表達。
[0183]基因或DNA的“片段”指的是分子的任一亞單元(subset)，譬如，更短的多核苷酸或寡聚核苷酸.“變異體”指的是與整個基因或其片段本質上相似的分子，譬如具有一個或多個替代核苷酸的核苷酸替換變異體，但它保持了與特定基因進行雜交的能力或者編碼可同天然DNA進行雜交的mRNA轉錄物.“同源物”指的是來源于不同植物屬或種的片段或者變異序列.“類似物”指的是同整個分子、變異體或其片段本質上類似或者功能上相關的非天然分子.[0184]“調節(jié)表達”是指表達被抑制或者上調.“表達抑制”是指諸如衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF_5A或者DHS這樣的目標基因在蛋白和/或mRNA產(chǎn)物水平上的缺失或者可檢測的降低.“上調”或者“過表達”是指諸如衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF_5A、脅迫eIF_5A或DHS這樣的目標基因在蛋白和/或mRNA產(chǎn)物水平上的可檢測的增高。調節(jié)表達所包括的含意中，包括降低DHS或者任一 eIF-5A同工型的活性.例如，可以在植物中產(chǎn)生DHS的敲減突變，所得到的植株其DHS會在較低水平或者以低于野生型DHS的效率來活化eIF-5A.調節(jié)表達也包括使用可抑制或降低DHS或eIF-5A活性的化學品或藥品.[0185]本發(fā)明中分離的多核苷酸和肽包括那些天然來源的、重組生產(chǎn)的或合成的.本發(fā)明中分離的蛋白包括以融合蛋白形式表達的衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A、脅迫eIF-5A或者DHS，優(yōu)選的是含與麥芽糖結合蛋白相融合的eIF_5A或DHS.[0186]本發(fā)明中衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A、生長eIF_5A、脅迫eIF_5A或DHS肽的“功能衍生物”包括保持了至少一部分活性或者與特異針對eIF-5A同工型或DHS的抗體具有免疫交叉反應的片段、變異體、類似物或化學衍生物.eIF-5A或DHS片段是指讀分子的任一子集.變異肽可通過直接化學合成來制備，例如，使用本領域中周知的方法.eIF-5A或DHS肽的類似物是指與整個蛋白或其片段本質上相似的非天然蛋白.eIF_5A的化學衍生物含有通常不屬于肽或肽段一部分的化學修飾基團.可用能夠與所選擇的側鏈或末端殘基反應的有機衍生試劑與肽的目標氨基酸殘基反應，將修飾引入到肽或其片段中。
[0187]通過培養(yǎng)用本發(fā)明中核苷酸序列(以正義方向)轉化的細胞、使細胞合成蛋白、然后依據(jù)所用的克隆方案從培養(yǎng)基或細胞提取物中分離以游離蛋白或者融合蛋白形式存在的蛋白的方式，可生產(chǎn)本發(fā)明的eIF-5A或DHS肽.作為選擇，也可在無細胞體系中生產(chǎn)蛋白。Ranu, etal, Meth.EnzymoL, 60:459-484, (1979).[0188]質粒DNA的制備、限制性內切酶消化、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳、PCR、RT-PCR> Southern印跡、Northern印跡、DNA連接及細菌轉化均通過本領域中眾所周知的常規(guī)方法來進行。參見，例如，Sambrook, J.et al, Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY, 1989.Sambrook還描述了核酸雜交的技術.[0189]在 Sambrook, et al., In:Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 2nd ed.,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)和 Maniatis, T.et al.,Molecular mechanisms in the Control of Gene expression, eds., Nierlich, et al,eds.,Acad.Press,N.Y.(1976)中描述了與本發(fā)明相一致的構建重組核苷酸分子的過程,二者完全整合在本文中。
[0190] 使用本領域已知的植物轉化方法通過DNA轉化可制備本發(fā)明的轉基因植物.植物轉化方法包括，但并不限于，植物、組織或細胞與根癌農桿茵直接協(xié)同培養(yǎng)、或者直接感染(Miki, et al, Meth.1n Plant Mo1.Biol, and Biotechnology, (1993), p.67-88);直接將基因轉入原生質體或者原生質體吸收(Paszkowski，et al, EMBO J.,12:2717(1984));電穿孔(Fromm, et al., Nature, 319:719(1986));粒子轟擊(Klein et al., BioTechnology,6:559-563(1988));注射到幼苗或植株的分生組織中(DeLaPena, et al, Nature, 325:274-276(1987));注射到培養(yǎng)的細胞或組織的原生質體中(Reich，et al, BioTechnology,4:1001-1004(1986))ο
[0191]通常從轉化過程可獲得完整的植株。從原生質體、愈傷組織、組織部分或外植體等可再生植株.從表達eIF-5A同工型或DHS的再生轉基因植株中獲得的植物部分可以發(fā)生諸如葉片、花、果實、種子、花粉以及其它本文“植物”定義內的改變.再生植株的后裔、變異體或突變體也包括在“植物”的定義內。
[0192]eIF_5A 概述
[0193]本發(fā)明涉及eIF_5A(真核翻譯起始因子5A).eIF_5A在葉片、花和果實的自然衰老中調節(jié)程序性細胞死亡、脅迫誘導的成熟前衰老、與木質化相關的細胞死亡以及與病原體入侵相關的細胞死亡.eIF-5A由兩個酶一Νε-(4-氨丁基)賴氨酸合酶(DHS)和Νε-(4-氨丁基)賴氨酸水解酶(DHH)在翻譯后活化.參見圖111.eIF-5A并不是通常的翻譯起始因子，更是作為穿梭蛋白來發(fā)揮功能的.已鑒定了 eIF-5A的3或4種不同的同工型.三種不同的同工型選擇性地將不同亞類的mRNAs從細胞核轉運到核糖體以進行翻譯.一種同工型控制細胞分裂與生長，2或3種同工型控制細胞死亡.例如，圖1所示的是從擬南芥中分離的3種不同的eIF-5A同工型.圖8_10所示的是以針對eIF_5A的同工型特異抗體為探針的Western印跡(“At”指擬南芥)。這些圖顯示了擬南芥中三種不同同工型的表達水平以及不同的生命周期與事件.在具有較大基因組的植物一譬如玉米植株中，有四種eIF-5A同工型.一種同工型參與細胞分裂與細胞生長，三種同工型參與細胞死亡.[0194]本發(fā)明涉及不同的eIF_5A同工型:衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷誘導eIF_5A、脅迫eIF-5A和生長eIF-5A.衰老誘導eIF_5A在植物或植物組織的生命末期誘導衰老.脅迫eIF-5A也是一種死亡同工型，誘導成熟前衰老以對環(huán)境脅迫一譬如干旱逆境產(chǎn)生應答.疾病/創(chuàng)傷eIF-5A是死亡同工型，誘導細胞死亡以對病原體入侵或者損傷事件產(chǎn)生應答。生長eIF-5A促進植物生長.eIF-5A似乎作為生物開關發(fā)揮作用，在一個部位調節(jié)生長而在另一個部位調節(jié)死亡.在死亡部位，強表達一種或多種死亡同工型，而生長同工型只是弱表達或者根本不表達.在生長部位，強表達生長同工型，而死亡同工型只是弱表達或者根本不表達.[0195]盡管有3到4種eIF_5A同工型，但確信僅有一種DHS同工型，而且這個單一的同工型激活(羥丁賴氨酸化)所有eIF-5A的同工型.[0196]本發(fā)明提供了從多種植物物種中分離的多種eIF_5A同工型，以及分離eIF_5A同工型的方法.本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明中多種eIF-5A同工型的多核苷酸.本發(fā)明還提供了 eIF-5A同工型的反義多核苷酸以及含這些多核苷酸或者反義多核苷酸的表達載體.在某些技術方案中，提供了通過使用含eIF-5A同工型反義多核苷酸的表達載體來轉化植物從而抑制內源eIF-5A表達的方法.在某些技術方案中，提供了通過使用以正義方向含eIF-5A同工型多桉苷酸的表達載體來上調內源eIF-5A同工型的方法.[0197]不同的同工型根據(jù)植物的生命階段或者植物所處環(huán)境可天然上調或下調。例如，在衰老的組織中，衰老誘導eIF-5A同工型被上調.認為衰老誘導eIF-5A通過將特定亞類的mRNA (它們參與衰老途徑)從細胞核穿梭運往細胞質以進行翻譯，從而參與植物或者植物組織的進一步衰老.通過下調或抑制衰老誘導eIF-5A的表達,在植物和/或植物組織中可以延遲衰老.在轉化/轉基因植物中明顯出現(xiàn)了延遲衰老，同未轉化或者野生型植物相t匕，其生物量更大、果實的上架時間增加、花的上架時間增加、種子大小增大并且種子產(chǎn)量增加了.[0198]當植物或者植物組織遭受諸如冷凍、脫水或機械力這樣的創(chuàng)傷事件或者病原體時，創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A同工型被上調.通過下調創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的表達，植物對由于病原體 入侵所造成的病毒破壞的抗性，與非轉化或者野生型植物對病毒破壞的抗性相比，有所提聞。
[0199]當植物處于生長期時，生長eIF_5A同工型被上調.通過上調生長eIF_5A，所獲得的轉基因植物具有增加的種子大小、增加的生物量以及增加的種子產(chǎn)量.[0200]當某種植物處于逆境時，脅迫eIF_5A同工型被上調。通過下調脅迫eIF_5A，所獲得的轉基因植物對逆境表現(xiàn)出更高的承受力，譬如對干旱具有更高的承受力.此外，植物比野生型植物具有更高的種子產(chǎn)量.[0201]圖1所示的是從擬南芥(“At”)中分離的eIF_5A三種同工型的序列比對.圖2所示的是這三種同工型編碼區(qū)的序列比對.圖3-5提供了三種同工型的基因組序列.[0202]Western印跡(參見圖8)所示的是三種eIF_5A同工型在植物不同生命階段的表達.圖8揭示了衰老誘導因子eIF-5A同工型的量隨著葉片年齡的增加而增長.這在未開放的花蕾、長角果或莖中沒有觀察到，但在吸水飽和的種子中觀察到了.在吸水飽和的種子中，存在子葉組織以及發(fā)育的胚.由于子葉組織隨著胚的發(fā)育而變老，因此在吸水飽和的種子中存在衰老誘導eIF-5A.由于胚正在活躍生長，因此在吸水飽和的種子中觀察到生長eIF-5A.在長角果、種子和莖中觀察到了創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A，是因為采收這些組織引起了某些創(chuàng)傷。[0203]盡管在不同的同工型以及不同植物物種的同工型之間存在高度的同源性(約85%)，不同的同工型在3’UTR上彼此存在差異。在同工型以及物種之間一個高度保守區(qū)被認為是羥丁賴氨酸位點的區(qū)域。認為羥丁賴氨酸位點有下列氨基酸:5' -CKVVEVSTSKTGKHGHAKCHFV-S; (SEQ ID NO:32)。參見圖85的多種eIF_5A同工型及幾個植物物種的序列比對.[0204]衰老誘導eIF_5A
[0205]衰老誘導eIF_5A的在衰老的組織中表達.參見圖116。本發(fā)明涉及在包括擬南芥、番茄、康乃馨、萵苣和苜蓿在內的多種植物中發(fā)現(xiàn)了衰老誘導eIF-5A.衰老誘導eIF-5A的在衰老的組織中被上調，并參與誘導與植物及植物組織形態(tài)改變相關的衰老.當衰老同工型被下調時，天然的衰老被推遲.衰老誘導eIF-5A的下調(通過使用衰老誘導eIF-5A的反義構建體、使用可實現(xiàn)共抑制的正義構建體、衰老誘導eIF-5A的敲減突變、DHS(它是激活eIF-5A所需的)的減少表達、DHS的敲減突變、或者DHS抑制劑的使用)會導致轉基因植物發(fā)生多種形態(tài)改變，包括增加植株生物量、延遲果實軟化或腐爛、延遲切花或諸如萵苣葉這樣的植物組織的褐變、增加種子產(chǎn)量并增加種子大小.參見圖35、36和117 (在擬南芥中延遲葉片衰老)、圖112和113(延長康乃馨切花的上架時間)、圖114(延遲香蕉褐變)、圖115 (延遲番茄腐爛)和圖119 (減少木質部形成)
[0206]當使用衰老誘導eIF_5A的正義構建體上調衰老誘導eIF_5A時，可導致功能獲得型表型.例如，注意到木質部形成的增加。參見圖120。
[0207]為了進一步說明DHS及衰老誘導eIF_5A的作用，使用⑶S作為報告基因鑒定了轉基因擬南芥植株生長及發(fā)育期DHS與衰老誘導eIF-5A的啟動子活性。圖118所示的是在脈管組織中表達衰老誘導eIF-5A。DHS: AUS以及衰老誘導eIF_5A::⑶S的水平在葉片衰老一開始時就強烈上調，并且這種高表達一直維持到葉片衰老結束。此外，出乎意料地，在發(fā)育中的子葉、蓮座葉和莖的脈管組織中，瞬時并同等表達DHS與衰老誘導eIF-5A。⑶S表達的定時與定位表明衰老誘導eIF-5A在木質化中的作用.此外，在產(chǎn)生花粉的衰退階段在另一個組織中DHS與衰老誘導eIF-5A也同等表達.綜合，這些結果表明DHS和衰老誘導eIF-5A調節(jié)擬南芥中與木質化、葉片衰老及花衰老相關的程序性細胞死亡.[0208]在發(fā)育的木質部中也表達衰老誘導eIF_5A.為了確定是否衰老誘導eIF_5A在木質部形成中發(fā)揮作用，在轉基因擬南芥植株中以組成型過表達其全長cDNA.這些植株與對照植株相比，具有更大的蓮座葉以及更高更厚的花梗，反映出更快的生長速度.此外，它們主要的花梗均表現(xiàn)出木質部發(fā)育的明顯增強。在脈管和雛管束區(qū)，根據(jù)譜系，細胞層與組織厚度分別增加了 80%和60%.木質部生長的增強在次級木質部中比在初級木質部中更為顯著.而且，同對照植株相比，衰老誘導eIF-5A組成型反義抑制會導致植株高度矮小與葉片衰老延遲以及木質部組織有~30%的減少.[0209]eIF-5A通過將保守的賴氨酸轉化為羥丁賴氨酸進行翻譯后修飾。為了確認就是衰老誘導eIF-5A的羥丁賴氨酸形式才可調節(jié)木質化，我們也生成了組成型過表達不能被羥丁賴氨酸化的衰老誘導eIF-5A突變型的轉基因擬南芥植株，通過將保守的賴氨酸的密碼子AAG轉變?yōu)镚CG (丙氨酸)來實現(xiàn)突變，從而使衰老誘導eIF-5A不會被羥丁賴氨酸化。在突變群體中，相對于對照植株，木質部的發(fā)育沒有變化。因此，衰老誘導eIF-5A可能是通過促進管狀分子(treachery elements)的程序性死亡來正調節(jié)木質化的,這種功能需要通過羥丁賴氨酸化來活化蛋白.[0210]因此，本發(fā)明一個技術方案是從擬南芥中分離的衰老誘導eIF_5A.在圖59中提供了為SEQ ID NO:16的氨基酸序列.在圖59中提供了為SEQ ID NO:15的編碼讀氨基酸的多核苷酸.[0211]本發(fā)明的另一個技術方案是從番茄中分離的衰老誘導eIF_5A。在圖57和86中提供了為SEQ ID NO: * *的氨基酸序列.在圖57和86中提供了為SEQ ID NO: * *的編碼該氨基酸的多核苷酸.[0212]本發(fā)明的另一個技術方案是從康乃馨中分離的衰老誘導eIF_5A。在圖58中提供了為SEQ ID NO:14的氨基酸序列.在圖58中提供了為SEQ ID NO:13的編碼該氨基酸的多核苷酸.[0213]本發(fā)明的另一個技術方案是從苜蓿中分離的衰老誘導eIF_5A。在圖138中提供了為SEQ ID NO:175的氨基酸序列.在圖138中提供了為SEQ ID NO: 174的編碼讀氨基酸的多桉苷酸.[0214]本發(fā)明還提供了與上述列舉的SEQ ID NOs具有65-100%序列同源性的衰老誘導eIF-5A的分離的多核苷酸，它可在高嚴謹度條件下與所列舉的的SEQ ID NOs的互補序列雜交、并編碼衰老誘導的的eIf-5A。[0215]本發(fā)明還提供了與上述列舉的SEQ ID NOs具有65_100%氨基酸序列同源性的衰老誘導eIF-5A的衰老誘導eIF-5A分離多肽.[0216]本發(fā)明也提供了衰老誘導eIF_5As的反義多核苷酸.反義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠抑制表達即可。在某些技術方案中，反義多核苷酸含有全長的編碼序列，在其它特別優(yōu)選的技術方案中，反義多核苷酸位于3’ UTR——因為eIF-5A不同同工型在3’ UTR具有更高程度的變異.在某些技術方案中，反義多核苷酸位于5’非編碼序列。已知主要與5’非編碼序列互補的反義多核苷酸可有效抑制編碼轉錄因子的基因的表達.Branch,M.A.，Molec.Cell Biol.，13:4284-4290(1993).[0217]此處及權利要求中所用的術語“衰老誘導eIF_5A的反義多核苷酸”，不僅包含那些與所列舉的SEQ ID NO的互補序列具有100%同源性的反義多核苷酸，而且包括功能變異體的反義多核苷酸.功能變異體是指那些天然的或人工制造的、與衰老誘導eIF-5A的相應部分至少有80%序列同源性并且可在高嚴謹度條件下雜交的變異體.進一步地，變異體必須具有本發(fā)明所需的功能，也就是說，當它導入到表達裁體并且該載體整合到至少一個植物細胞的基因組中時，能夠調節(jié)內源衰老誘導eIF-5A的表達.本領域的技術人員知道，在序列中可生成對反義多核苷酸與轉錄物結合無不利影響的、以及降低或抑制基因表達的非實質性改變.這樣，術語“反義多核苷酸”包括那些與轉錄物充分互補、仍具有與轉錄物特異結合的能力并抑制或降低基因表達的多核苷酸.關于反義的一般性討論，可參見Alberts，et al.，Molecular Biology of the Cell，2nd ed.，Garland Publishing，Inc.New Yorlk, New York，1989 (特別是195-196頁，作為參考并入本申請).[0218]本發(fā)明的一個技術方案提供了含衰老誘導eIF_5A多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)或者衰老誘導eIF-5A反義多桉苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)的表達裁體.裁體可以是質粒，優(yōu)選地，可以是本領域已知的在植物細胞或細菌細胞中復制并表達其上編碼基因的病毒或其它裁體。裁體可整合到染色體上，這樣它可以轉錄并產(chǎn)生所需的衰老誘導eIF-5A反義多核苷酸RNA.這類質粒或病毒載體可通過本領域標準的重組DNA技術方法來構建.例如，載體可以是含有在原核宿主中有功能的復制系統(tǒng)以及根據(jù)本發(fā)明的反義多核苷酸的質粒載體.選擇性地，裁體可以是含有在根癌農桿菌中有功能的復制系統(tǒng)與根據(jù)本發(fā)明的反義多核苷酸的質粒.能夠在根癌農桿菌中復制的質粒在本領域是眾所周知的.參見，Miki, et al, Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants, Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology,, Eds.B.R.Glick and J.E.Thompson.CRCPress (1993)，PP.67-83.[0219]載體進一步含有與多核苷酸可操作連接的調控序列，以表達該多核苷酸.調控序列可包括在轉化植物細胞中具有功能的啟動子。啟動子可以是誘導型、組成型或組織特異型的.這類啟動子是本領域的技術人員所已知的.[0220]用于與本發(fā)明中多種eIF_5A同工型及DHS聯(lián)合使用以產(chǎn)生基因正義或反義轉錄物的啟動子調控元件包括所有普通的植物啟動子，更特別地，諸如玄參花葉病毒35S啟動子、花椰菜花葉病毒啟動子——CaMV35S啟動子或MAS啟動子這樣的病毒啟動子，或者諸如康乃馨花瓣GSTl啟動子或擬南芥SAG12啟動子這樣的組織特異性或衰老誘導的啟動子(參見，例如 J.C.Palaqui et al, Plant Physiol., 112:1447-1456(1996)；Morton et al, Molecular Breeding,1:123-132(1995) ；Fobert et al, Plant Journal,6:567-577(1994) ；and Gan et al, Plant PhysioL，113:313 (1997)，作為參考并入本申請).優(yōu)選地，本發(fā)明所用啟動子是組成型啟動子.當使用衰老誘導eIF-5A的反義多核苷酸時，SAG12啟動子是更為優(yōu)選的.參見實施例23.[0221]可使用常規(guī)表達系統(tǒng)，例如通過 測定報告基因產(chǎn)物——譬如導入了啟動子/報告基因的轉基因植物的葉片、花、果實或其它組織提取物中的蛋白或mRNA——的水平，來檢測用于本發(fā)明的啟動子的表達水平.一個典型的報告基因是GUS.[0222]可選地，調控序列包括5’非翻譯引導序列或者多聚腺苷酸化信號或者增強子.本發(fā)明進一步考慮到本領域技術人員已知的其它調控序列.[0223]發(fā)明還提供了用以正義或反義方向含衰老誘導eIF_5A多核苷酸的本發(fā)明中的載體或載體組合所轉化的轉基因植物細胞、從這種細胞生成的轉基因幼苗或成熟的轉基因植株、或者諸如花、果實、葉片、種子等這樣的轉基因植株的植物部分。
[0224]本發(fā)明也提供了抑制內源衰老誘導eIF_5A表達的方法。這些方法包括將含有衰老誘導eIF-5A反義多核苷酸的本發(fā)明中的表達載體，整合到植株至少一個細胞的基因組中.衰老誘導eIF-5A反義多核苷酸被轉錄，并抑制內源衰老誘導eIF-5A的表達.[0225]在另一個抑制內源衰老誘導eIF-5A表達的方法中，將以正義方向含有本發(fā)明衰老誘導eIF-5A多核苷酸的表達載體整合到植株至少一個細胞的基因組中.衰老誘導eIF-5A多核苷酸被轉錄，所產(chǎn)生的外源衰老誘導eIF-5A的共表達會導致內源衰老誘導eIF-5A表達的下調或抑制。
[0226]脅迫誘導eIF_5A
[0227]本發(fā)明涉及在包括苜蓿、番茄和萵苣在內的多種植物中發(fā)現(xiàn)了脅迫誘導eIF_5A。下調eIF-5A的脅迫同工型會改善脅迫誘導的衰老。下調eIF-5A的脅迫同工型提供了對壓力更高的耐受，從而增強生長。圖121-123所示的是轉基因植物(脅迫誘導eIF-5A的表達降低了)對干旱表現(xiàn)出更高抗性.圖124所示的是轉基因植物(脅迫誘導eIF-5A的表達降低了)比對照(野生型)植物的種子產(chǎn)量提高了.[0228]因此，本發(fā)明的一個技術方案是從苜蓿中分離的脅迫eIF_5A。在圖139中提供了為SEQ ID NO:177的氨基酸序列.在圖139中提供了為SEQ ID NO: 176的編碼氨基酸的多核苷酸.[0229]因此，本發(fā)明的一個技術方案是從番茄中分離的脅迫eIF_5A。在圖146中提供了為SEQ ID NO:191的氨基酸序列.在圖146中提供了為SEQ ID NO:190的編碼氨基酸的多核苷酸.[0230]本發(fā)明也提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%序列同源性的分離的脅迫eIF-5A多核苷酸，它可在高嚴謹度條件下與列舉的SEQ ID NOs的互補序列雜交，并編碼脅迫 eIF-5A.[0231]本發(fā)明還提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%氨基酸序列同源性的脅迫eIF-5A的分離的脅迫eIF-5A多肽.[0232]本發(fā)明也提供了脅迫eIF_5As的反義多核苷酸。反義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠抑制表達即可。在某些技術方案中，反義多核苷酸含有全長的編碼序列，在其它特別優(yōu)選的技術方案中，反義多核苷酸位于3’ UTR——因為eIF-5A不同同工型在3’ UTR具有更高程度的變異.在某些技術方案中，反義多核苷酸位于5’非編碼序列。已知主要與5’非編碼序列互補的反義多核苷酸可有效抑制編碼轉錄因子的基因的表達.Branch,M.A.，Molec.Cell Biol.，13:4284-4290(1993).[0233]此處及權利要求中所用的術語“脅迫eIF_5A的反義多核苷酸”，不僅包含那些與所列舉的SEQ ID NO的互補序列具有100%同源性的反義多核苷酸，而且包括功能變異體的反義多核苷酸.功能變異體是指那些天然的或人工制造的、與脅迫eIF-5A的相應部分至少有80%序列同源性并且可在高嚴謹度條件下雜交的變異體.進一步地，變異體必須具有本發(fā)明所需的功能，也就是說，當它導入到表達載體并且該載體整合到至少一個植物細胞的基因組中時,能夠調節(jié)內源脅迫eIF-5A的表達.本領域的技術人員知道，在序列中可生成對反義多核 苷酸與轉錄物結合無不利影響的、以及降低或抑制基因表達的非實質性改變.這樣，術語“反義多核苷酸”包括那些與轉錄物充分互補、仍具有與轉錄物特異結合的能力并抑制或降低基因表達的多核苷酸。關于反義的一般性討論，可參見AlbertS，et al.，Molecular Biology of the Cell,2nd ed.,Garland Publishing,Inc.New YorkiNew York，1989 (特別是195-196頁，作為參考并入本申請)。
[0234]本發(fā)明的一個技術方案提供了含脅迫eIF_5A多核苷酸(本發(fā)明中的,如上所述)或者脅迫eIF_5A反義多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)的表達載體.載體可以是質粒，優(yōu)選地，可以是本領域已知的在植物細胞或細菌細胞中復制并表達其上編碼基因的病毒或其它載體。裁體可整合到染色體上，這樣它可以轉錄并產(chǎn)生所需的脅迫eIF_5A反義多核苷酸RNA。這類質?；虿《静皿w可通過本領域標準的重組DNA技術方法來構建.例如，載體可以是含有在原核宿主中有功能的復制系統(tǒng)以及根據(jù)本發(fā)明的反義多核苷酸的質粒裁體.選擇性地，裁體可以是含有在根癌農桿茵中有功能的復制系統(tǒng)與根據(jù)本發(fā)明的反義多核苷酸的質粒.能夠在根癌農桿茵中復制的質粒在本領域是眾所周知的。參見，Miki，et al,Procedures for Introducing Foreign DNA Into Plants， Methods in Plant MolecularBiology and Biotechnology, , Eds.B.R.Glick and J.E.Thompson.CRC Press (1993),PP.67-83.[0235]載體進一步含有如上所述的調控序列及啟動子調控元件。
[0236]發(fā)明還提供了用以正義或反義方向含脅迫eIF_5A多核苷酸的本發(fā)明中的裁體或載體組合所轉化的轉基因植物細胞、從這種細胞生成的轉基因幼苗或成熟的轉基因植株、或者諸如花、果實、葉片、種子等這樣的轉基因植株的植物部分.[0237]本發(fā)明也提供了抑制內源脅迫eIF_5A表達的方法.這些方法包括將含有脅迫eIF-5A反義多核苷酸的本發(fā)明中的表達載體，整合到植株至少一個細胞的基因組中.脅迫eIF-5A反義多核苷酸被轉錄，并抑制內源脅迫eIF-5A的表達.[0238]在另一個抑制內源脅迫eIF_5A表達的方法中，將以正義方向含有本發(fā)明脅迫eIF-5A多核苷酸的表達裁體整合到植株至少一個細胞的基因組中.脅迫eIF-5A多核苷酸被轉錄，所產(chǎn)生的外源脅迫eIF-5A的共表達會導致內源脅迫eIF-5A表達的下調或抑制.[0239]創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A
[0240]在受損傷組織及受感染組織中表達創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A (也稱為eIF_5A3).本發(fā)明涉及在包括擬南芥、番茄、苜蓿和萵苣在內的多種植物中發(fā)現(xiàn)了創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A。本發(fā)明已發(fā)現(xiàn)在植物受損傷或者病原體入侵期間這種同工型被上調.圖125表明在受到丁香假單胞菌感染后創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A被上調.上調發(fā)生在轉錄水平上.此外，遭受有毒感染后上調專一發(fā)生在蛋白水平上，然后造成細胞死亡，得出的推論是創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A在發(fā)生病原體入侵事件時會促使細胞死亡.[0241]下調創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A可抑制病原體誘導的細胞死亡.圖126所示的是eIF_5A的創(chuàng)傷/病原體誘導同工型的反義抑制可抑制由于有毒病原體造成的感染。轉基因植物比對照植物在抑制感染上表現(xiàn)出99%的增加.圖127-130所示的是轉基因油菜(反義/ eIF-5A的病原體誘導同工型)對油菜核盤菌感染表現(xiàn)出抗性.[0242]創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A調控與嗜神經(jīng)組織的細菌及真菌病原體感染相伴隨的程序性細胞死亡。在受到烈性丁香假單胞菌pv Tomato DC3000感染后72小時內，創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A蛋白在擬南芥野生型植物的葉片中被強烈上調.上調與疾病發(fā)展的可見癥狀相一致.而且，創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A是在感染后唯一表達增加的eIF-5A同工型.此外，上調似乎是轉錄后調節(jié)的.為了進一步檢驗創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A在疾病發(fā)展過程中的作用，利用反義T-DNA插入獲得創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的表達受到組成型抑制的轉基因擬南芥植株。受抑制的植株對烈性丁香假單胞茵pv Tomato DC3000表現(xiàn)出顯著的抗性，某些譜系相對于野生型植株在細菌數(shù)目上表現(xiàn)出99%的降低.這種病原體生長上的抑制與疾病癥狀的缺失相關.相同譜系對嗜神經(jīng)組織的真茵病原體——油菜核盤茵的感染也表現(xiàn)出強烈抗性.這些結果被解釋為:創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A調節(jié)由嗜神經(jīng)組織的病原體所誘導的程序性細胞死亡，降低創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A可抑制宿主細胞由于感染而死亡及隨后的營養(yǎng)物質的釋放——這通常會幫助病原體生長.[0243]圖9所示的是衰老誘導eIF_5A在對照植株、空白處理植株、無毒處理植株及有毒處理植株中保持恒定(在植株4周齡時檢測)。但創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A在有毒處理植株中被上調.[0244]圖10所示的是實驗結果，其中植株的葉片受到止血鉗的損傷。在受損傷后立刻、損傷后I小時及9小時測量擬南芥(“At”)中衰老誘導eIF-5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A和生長eIF-5A的水平。Northern印跡表明衰老誘導eIF_5A保持不變，但創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A表達水平有明顯增加.生長eIF-5A的表達水平在創(chuàng)傷事件中開始降低。
[0245]本發(fā)明已揭示當創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A被上調及植物發(fā)生創(chuàng)傷事件(諸如移植幼苗時所發(fā)生的)時，這種創(chuàng)傷會導致非常強烈的生長eIF-5A的抑制.參見圖14-17.所獲得的植株生長非常遲緩.但當種子浸泡在卡那霉素并直接種植在土壤中時(不需移植，這樣就沒有移植創(chuàng)傷)，種子發(fā)育成正常大小的這種.[0246]多種測試植物——它們都整合了正義創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A構建體(圖15)——之間的差異是由于創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A表達的變化程度所致.本領域的技術人員知道，當導入基因(正義或者反義)時，植株中基因上調或下調的程度會不同.差異的程度依賴于基因整合位點以及整合了多少拷貝數(shù).由于表達程度不同，基因表達可與多種表型相關聯(lián).一旦產(chǎn)生了預期表型，可以挑選這個植株用于生成想獲得的子代.因此在圖15中，創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A強烈上調的植株在創(chuàng)傷事件(植物標簽10)后幾乎沒有生長，而生長略好(但沒有野生型那么好)的植株(植物標簽4)沒有強烈上調.[0247]本發(fā)明的一個技術方案是從擬南芥中分離的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A.在圖41中提供了為SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在圖41中提供了為SEQ ID NO:54的編碼氨基酸的多核苷酸.[0248]本發(fā)明的另一個技術方案是從番爺中分離的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A.在圖103中提供了為SEQ ID NO:57的氨基酸序列.在圖103中提供了為SEQ ID NO:56的編碼氨基酸的多核苷酸.[0249]本發(fā)明的另一個技術方案是從苜蓿中分離的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A.在圖137中提供了為SEQ ID NO: 173的氨基酸序列。在圖137中提供了為SEQ ID NO: 172的編碼氨基酸的多核苷酸.[0250]本發(fā)明也提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%序列同源性的分離的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-SA多核苷酸，它可在高嚴謹度條件下與列舉的SEQ ID NOs的互補序列雜交，并編碼創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-SA.[0251]本發(fā)明還提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%氨基酸序列同源性的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的分離的創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A多肽.[0252]本發(fā)明也提供了創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5As的反義多核苷酸.反義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠抑制表達即可.在某些技術方案中，反義多核苷酸含有全長的編碼序列，在其它特別優(yōu)選的技術方案中，反義多核苷酸位于3’ UTR—因為eIF-5A不同同工型在3’UTR具有更高程度的變異。在某些技術方案中，反義多核苷酸位于5’非編碼序列。已知主要與5’非編碼序列互補的反義多桉苷酸可有效抑制編碼轉錄因子的基因的表達.Branch, M.A.，Molec.Cell Biol.，13:4284-4290(1993).[0253]此處及權利要求中所用的術語“創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A的反義多核苷酸”，不僅包含那些與所列舉的SEQ ID NO的互補序列具有100%同源性的反義多核苷酸，而且包括功能變異體的反義多核苷酸.功能變異體是指那些天然的或人工制造的、與創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的相應部分至少有80%序列同源性并且可在高嚴謹度條件下雜交的變異體。進一步地，變異體必須具有本發(fā)明所需的功能，也就是說，當它導入到表達載體并且該裁體整合到至少一個植物細胞的基因組中時，能夠調節(jié)內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的表達.本領域的技術人員知道，在序列中可生成對反義多核苷酸與轉錄物結合無不利影響的、以及降低或抑制基因表達的非實質性改變.這樣，術語“反義多核苷酸”包括那些與轉錄物充分互補、仍具有與轉錄物特異結合的能力并抑制或降低基因表達的多核苷酸.[0254]本發(fā)明的一個技術方案提供了含創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)或者創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A反義多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)的表達載體.裁體、調控序列和啟動子調控元件均如上所述.[0255]本發(fā)明還提供了用以正義或反義方向含創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A多核苷酸的本發(fā)明中的載體或載體組合所轉化的轉基因植物細胞、從這種細胞生成的轉基因幼苗或成熟的轉基因植株、或者諸如花、果實、葉片、種子等這樣的轉基因植株的植物部分.[0256]本發(fā)明也提供了抑制內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A表達的方法.這些方法包括將含有創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A反義多核苷酸的本發(fā)明中的表達裁體，整合到植株至少一個細胞的基因組中.創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A反義多核苷酸被轉錄，并抑制內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的表達.[0257]在另一個抑制內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A表達的方法中，將以正義方向含有本發(fā)明創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A多核苷酸的表達裁體整合到植株至少一個細胞的基因組中.創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A多核苷酸被轉錄，所產(chǎn)生的外源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的共表達會導致內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A表達的下調或抑制.[0258]通過抑制內源創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A的表達，所獲得的轉基因植株對由于病原體入侵導致的惡性損傷具有更高抗性.病原體包括，但不限定于:香蕉黑斑型尾孢茵、油菜核盤菌(萵苣及草皮中主要的真茵疾病)、腐霉(在溫室蔬菜作物中主要的真菌疾病)及丁香假單胞茵。參見實施例16及圖43與44.[0259]生長eIF_5A
[0260]本發(fā)明也涉及生長eIF_5A.生長eIF_5A在生長中的組織表達。當用以正義方向的生長eIF-5A多核苷酸來上調生長eIF-5A時，注意到3種表現(xiàn)改變:增加的種子大小、增加的生物量以及增加 的種子產(chǎn)量。參見圖132-134.[0261]本發(fā)明的一個技術方案是從擬南芥中分離的生長eIF_5A.在圖1中提供了為SEQID NO:**的氨基酸序列.在圖2中提供了為SEQ ID NO:**的編碼氨基酸的多核苷酸.[0262]本發(fā)明的另一個技術方案是從番茄中分離的生長eIF_5A.在圖101中提供了為SEQ ID NO:65的氨基酸序列.在圖101中提供了為SEQ ID NO:64的編碼氨基酸的多核苷酸.[0263]本發(fā)明的另一個技術方案是從油菜中分離的生長eIF_5A.在圖95中提供了為SEQID NO:67的氨基酸序列.在圖95中提供了為SEQ ID NO:66的編碼氨基酸的多核苷酸.[0264]本發(fā)明的另一個技術方案是從苜蓿中分離的生長eIF_5A.在圖140中提供了為SEQ ID NO:179的氨基酸序列.在圖140中提供了為SEQ ID NO:178的編碼氨基酸的多核苷酸.[0265]本發(fā)明也提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%序列同源性的分離的生長eIF-5A多核苷酸，它可在高嚴謹度條件下與列舉的SEQ ID NOs的互補序列雜交，并編碼生長 eIF-5A.[0266]本發(fā)明還提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%氨基酸序列同源性的分離的生長eIF-5A多肽.[0267]本發(fā)明也提供了生長eIF_5As的反義多核苷酸.反義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠抑制表達即可.在某些技術方案中，反義多核苷酸含有全長的編碼序列，在其它特別優(yōu)選的技術方案中，反義多核苷酸位于3’ UTR——因為eIF-5A不同同工型在3’ UTR具有更高程度的變異.在某些技術方案中，反義多核苷酸位于5’非編碼序列.已知主要與5’非編碼序列互補的反義多核苷酸可有效抑制編碼轉錄因子的基因的表達。Branch，M.A.，Molec.Cell Biol.，13:4284-4290(1993).[0268]此處及權利要求中所用的術語“生長eIF_5A的反義多核苷酸”，不僅包含那些與所列舉的SEQ ID NO的互補序列具有100%同源性的反義多核苷酸，而且包括功能變異體的反義多核苷酸.功能變異體是指那些天然的或人工制造的、與生長eIF-5A的相應部分至少有80%序列同源性并且可在高嚴謹度條件下雜交的變異體.進一步地，變異體必須具有本發(fā)明所需的功能，也就是說，當它導入到表達裁體并且該裁體整合到至少一個植物細胞的基因組中時，能夠調節(jié)內源生長eIF-5A的表達。本領域的技術人員知道，在序列中可生成對反義多核苷酸與轉錄物結合無不利影響的、以及降低或抑制基因表達的非實質性改變。這樣，術語“反義多核苷酸”包括那些與轉錄物充分互補、仍具有與轉錄物特異結合的能力并抑制或降低基因表達的多核苷酸。
[0269]本發(fā)明的一個技術方案提供了含生長eIF_5A多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)或者生長eIF-5A反義多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)的表達載體.載體、調控序列和啟動子調控元件均如上所述.[0270]本發(fā)明還提供了用以正義或反義方向含生長eIF_5A多核苷酸的本發(fā)明中的裁體或裁體組合所轉化的轉基因植物細胞、從這種細胞生成的轉基因幼苗或成熟的轉基因植株、或者諸如花、果實、葉片、種子等這樣的轉基因植株的植物部分。
[0271]本發(fā)明也提供了抑制內源生長eIF_5A表達的方法.這些方法包括將含有生長eIF-5A反義多核苷酸的本發(fā)明中的表達裁體，整合到植株至少一個細胞的基因組中.生長eIF-5A反義多核苷酸被轉錄，并抑制內源生長eIF-5A的表達。
[0272]在另一個抑制內源生長eIF_5A表達的方法中，將以正義方向含有本發(fā)明生長eIF-5A多核苷酸的表達載體整合到植株至少一個細胞的基因組中。生長eIF-5A多核苷酸被轉錄，所產(chǎn)生的外源生長eIF-5A的共表達會導致內源生長eIF-5A表達的下調或抑制.[0273]在本發(fā)明的另一個技術方案中，提供了上調生長eIF_5A表達的方法。將以正義方向含有本發(fā)明生長eIF-5A多核苷酸的表達載體整合到植株至少一個細胞的基因組中.生長eIF-5A多核苷酸被轉錄，所產(chǎn)生的外源生長eIF-5A的共表達會導致細胞比非轉基因細胞表達更多的生長eIF-5A。
[0274]圖19所示的是生長eIF_5A被上調的植株比對照植株的生物量增加了.生長eIF-5A以正義方向插入到擬南芥中以上調生長eIF-5A的表達。檢驗了 16個母本(1_16)以確定生長eIF-5A表達的一般水平。從每個母本產(chǎn)生了 8個姊妹系(A-H).檢測了每個母本中生長eIF-5A的表達水平，結果如圖20所示。通過母本觀察到了不同程度的表達。例如，系2和10具有非常高的表達水平，而系11和16表達很低或者沒有。
[0275]圖21和22所示的是來自系I和2的植株.這些植株比對照植株要大.因為生長eIF-5A是細胞分裂同工型，并且因為它是組成型表達的，所以細胞分裂增加了。由于植物被鎖定在生長模式，不能啟動衰老途徑，所以減少了衰老發(fā)生。
[0276]圖23和24來自生長eIF_5A具有中等表達水平的譜系。它們看上去具有更大的葉片，并且衰老延遲了.[0277]圖25和26是來自低水平上調的譜系.它們具有大葉片與大蓮座葉。
[0278]圖27和28是來自沒有上調的譜系(可能是由于基因共抑制的原因)。因為植株是卡那霉素抗性的，因此一定存在該基因以使植株在培養(yǎng)基上生長.似乎衰老誘導eIF-5A也被共抑制，這樣導致了大小增加.[0279]除了增加的生物量之外，生長eIF_5A被上調的植株中種子大小也增加了.測定了所有譜系的種子大小.在生長eIF-5A表達水平最高的譜系中，觀察到種子大小有3X倍增加.這是因為生長eIF-5A的上調增加了細胞分裂，從而增加了種子大小.[0280]在上面示例中的生長eIF_5A(來自擬南芥)是組成型表達的，譬如，可通過使用通用啟動子在植物任何部位表達.相反，通過使用組織特異性啟動子，可以在特定組織中指導上調.例如，通過使用種子特異性啟動子，可只在種子中上調生長eIF-5A，使葉片正常生長，但種子量卻增加了.這樣，通過使用特異啟動子，可在期望的植物部位上調生長eIF-5A，獲得期望的表型.[0281]通過上調生長eIF_5A，獲得至少3種表型:增加了的生物量、增加了的種子產(chǎn)量、或增加了的種子大小，但并非全部3種表型都是同時(或在相同植株中)存在的.例如，雖然植株種子大小增加了，但植株卻更小。在生長eIF-5A上調最高的植物譜系中，產(chǎn)生了最大的種子，但植株卻更小——這是因為在整個植株中始終進行著大量細胞分裂，在細胞增大(大葉片所必需)上付出了代價.在較低水平上上調生長eIF-5A的表達，在葉片上觀察到了效果(更大)，對種子卻沒有影響。這樣，可使用組織特異性表達，選擇期望的表型。例如,可將生長eIF-5A至于木質部特異啟動子之下，以增加生成的木質部的量。這樣，可使用任何期望的啟動子來獲得期望的組織特異性上調。
[0282]生長eIF_5A以及其它eIF_5A同工型在植物物種間是高度保守的.圖85所示的是來自幾個植物物種的多種eIF-5A同工型的氨基酸序列比對，表明羥丁賴氨酸區(qū)是高度保守的.實際上，eIF-5A高度保守，編碼某個植物生長eIF-5A的分離的多核苷酸可以以正義方向插入到另一個植物物種中，并實現(xiàn)生長eIF-5A的上調.圖162所示的是以正義方向將三角葉楊生長eIF-5A導入擬南芥的效果.圖162所示的是7周齡時的Tl植株.較大的植株來自兩個不同的轉基因系.較小的植株是對照.圖163所示的是來自三個分離譜系(標記為系2、3和4)的T2植株，標記為“BIN”的植株是空載體對照.植株是28天齡的。同對照植株相比，轉基因擬南芥生長速率增加了。圖164所示的是與對照植株相比較的32天齡時的T2植株(系3).[0283]在圖165中給出了生長eIF_5A可交換性的進一步證據(jù).在油菜中，可用以正義方向位于35S啟動子控制下的油菜生長因子eIF-5A或者擬南芥生長eIF_5A(全長)來上調生長因子eIF-5A.所獲得的轉基因植株比野生型對照植株的種子產(chǎn)量增加了.以正義方向具有擬南芥生長eIF-5A的轉基因油菜植株中種子產(chǎn)量的增加，與以正義方向具有外源油菜eIF-5A的轉基因油萊植株中非常相象.[0284]DHS
[0285] DHS是eIF_5A活化所必需的，在衰老組織中表達.本發(fā)明提供了從擬南芥、番茄、康乃馨、油菜、萵苣、苜蓿、香蕉、三角葉楊、酵母、矮牽牛和球腔菌中分離的DHS.[0286]因此本發(fā)明的一個技術方案是從擬南芥中分離的DHS。在圖46中提供了為SEQ IDNO:6的氨基酸序列.在圖46中提供了為SEQ ID NO:5的編碼氨基酸的多核苷酸.[0287]本發(fā)明的另一個技術方案是從番茄中分離的DHS.在圖45A和B中提供了為SEQ IDNO:2的氨基酸序列.在圖45A和B中提供了為SEQ ID NO:1的編碼氨基酸的多核苷酸.[0288]本發(fā)明的另一個技術方案是從康乃馨中分離的DHS.在圖54中提供了為SEQ IDNO:10的氨基酸序列.在圖54中提供了為SEQ ID NO:9的編碼氨基酸的多核苷酸.[0289]本發(fā)明的另一個技術方案是從油菜中分離的DHS。在圖97中提供了為SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在圖97中提供了為SEQ ID NO:70的編碼氨基酸的多核苷酸.[0290]本發(fā)明的另一個技術方案是從萵苣中分離的DHS。圖105提供了萵苣DHS多核苷酸序列的一部分。
[0291]本發(fā)明的另一個技術方案是從苜蓿中分離的DHS.在圖107A和B中提供了為SEQID NO:73的氨基酸序列。在圖107A和B中提供了為SEQ ID NO:72的編碼氨基酸的多核苷酸.[0292]本發(fā)明的另一個技術方案是從香蕉中分離的DHS。在圖108A和B中提供了為SEQID NO:75的氨基酸序列.在圖108A和B中提供了為SEQ ID NO:74的編碼氨基酸的多核苷酸.[0293]本發(fā)明的另一個技術方案是從三角葉楊中分離的DHS。在圖109A和B中提供了為SEQ ID NO:76的氨基酸序列.在圖109A和B中提供了為SEQ ID NO:77的編碼氨基酸的多核苷酸.[0294]本發(fā)明的另一個技術方案是從球腔茵中分離的DHS。在圖110中提供了其序列.[0295]本發(fā)明也提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%序列同源性的分離的DHS多核苷酸，它可在高嚴謹度條件下與列舉的SEQ ID NOs的互補序列雜交，并編碼DHS.[0296]本發(fā)明還提供了與上面列舉的SEQ ID NOs具有65_100%氨基酸序列同源性的分離的DRS多肽。 圖47與圖148(a)和(b)提供了表明DHS在物種間具有高保守性的多種DHS的氨基酸序列比對。
[0297]本發(fā)明也提供了 DHS的反義多核苷酸。反義多核苷酸可含有全長編碼序列，或者位于3’ UTR或位于5’非編碼序列.已知主要與5’非編碼序列互補的反義多核苷酸可有效抑制編碼轉錄因子的基因的表達。Branch，M.A.,Molec.Cell Biol.,13:4284-4290(1993).反義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠抑制表達即可.[0298]此處及權利要求中所用的術語“生長eIF_5A的反義多核苷酸”，不僅包含那些與所列舉的SEQ ID NO的互補序列具有100%同源性的反義多核苷酸，而且包括功能變異體的反義多核苷酸.功能變異體如上所述。本發(fā)明中的變異體的功能，是當導入到表達載體并且該裁體整合到至少一個植物細胞的基因組中時，能夠調節(jié)內源DHS的表達。
[0299]本發(fā)明也提供了 DHS的正義多核苷酸.正義多核苷酸可含有全長編碼序列，或者位于3’UTR或位于5’非編碼序列.正義多核苷酸長度可任意，只要它們能夠通過共抑制來下調表達、或者選擇性地，上調表達即可.[0300]本發(fā)明的一個技術方案提供了含有DHS多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)或DHS反義多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)或DHS正義多核苷酸(本發(fā)明中的，如上所述)的表達載體。載體如上所述。
[0301]發(fā)明還提供了用以正義或反義方向含DHS多核苷酸的本發(fā)明中的裁體或載體組合所轉化的轉基因植物細胞、從這種細胞生成的轉基因幼苗或成熟的轉基因植株、或者諸如花、果實、葉片、種子等這樣的轉基因植株的植物部分.[0302]本發(fā)明也提供了抑制/降低內源DHS表達的方法。這些方法包括將含有DHS反義多核苷酸的本發(fā)明中的表達載體，整合到植株至少一個細胞的基因組中。DHS反義多核苷酸被轉錄，并抑制/降低內源DHS的表達.所獲得的植株具有增加的生物量、增加的種子產(chǎn)量及延長的上架時間.[0303]例如，圖65-68所示的是野生型擬南芥植株與由于使用反義構建體導致DHS被下調的擬南芥植株的比較圖.使用反義擬南芥DHS構建體下調DHS的擬南芥植株與野生型擬南芥(DHS沒有下調)相比生物量增加了.參見圖153和154.此外，圖69和155闡述了DHS被下調的擬南芥植株比野生型植株種子產(chǎn)量提高了。圖156所示的是DHS的下調導致根部發(fā)育的增加.參見實施例13中以反義方向用全長擬南芥DHS(SEQ ID NO:30)或者其3’區(qū)轉化擬南芥的多種構建體的描述.[0304]實施例14和15描述了以反義方向用全長番茄DHS或者其3’區(qū)來轉化番茄。圖70-79所示的是所獲得的番茄植株與野生型番茄植株相比，番茄的軟化和腐爛都延遲了.圖84(a)和84(b)是番茄果實的照片，表明以反義方向用番茄DHS轉化的番茄其蒂腐病發(fā)病率降低了，因此說明 降低DHS表達可預防由于生理性疾病引發(fā)的組織與細胞死亡的發(fā)作。
[0305]在油菜中抑制DHS表達可增加植物生物量并增加種子產(chǎn)量。參見實施例28和圖157-161.圖157所示的是轉基因油菜具有增加的生物量——是由增加的葉片質量所顯示出的.圖158所示的是表明在油菜一個轉基因系中DHS部分下調的Western印跡結果.圖159所示的是油菜中DHS的下調導致更大的長角果.圖160所示的是油菜中DHS的下調導致種子產(chǎn)量增加.圖161(a)列出了以“每種子重量”來表示的三酰基甘油總產(chǎn)量.這表明在每個種子中油的量沒有變化.因此，種子產(chǎn)量增加~65%意味著種子油增加~65%.圖161 (b)表明在DHS被下調的油菜植株中油的脂肪酸組成沒有變化.[0306]圖99所示的是一個實驗結果，其中油菜植株生長在小罐中，這可使植株受到少量脅迫(亞致死).當DHS被下調時，可觀察到種子產(chǎn)量增加.油菜DHS的3’UTR被用作反義核苷酸.反義寡聚核苷酸使用35S啟動子進行組成型表達.使用組成型啟動子，DHS反義多核苷酸在整個植株的生長和發(fā)育期間均表達.當植株處于亞致死脅迫事件(諸如生長在太小的罐子中、或者處于生長條件不理想的時期等)時，植株可進入衰老途徑.不過，如果植株是減少了 DHS表達的轉基因植株，當其遭受亞致死脅迫時，植株不進入衰老模式.圖99所示的是DHS被下調的植株中油菜產(chǎn)量的增加.圖99給出了 Tl到T4代、及特定植物系的兩個特別的T4代(命名為“P”和“T”系).[0307]在康乃馨中下調DHS會使花具有延長的瓶插壽命.實施例29所示的是使用反義構建體進行下調，以及使用DHS反應抑制物，會使花的上架壽命延長83%。
[0308]具有反義DHS的轉基因香蕉的生物量增加了，其證據(jù)就是同野生型相比植株更大.參見圖131.來自轉基因植株的果實與野生型相比表現(xiàn)出延遲腐爛.參見圖114.編碼香蕉DHS的桉苷酸以反義方向插入到載體中——處于35S啟動子或果實特異性啟動子(pPDK)的控制下?？墒褂萌L香蕉DHS或其3’ UTR.[0309]已商品化的預先包裝的沙拉通常存儲在空氣可控的條件下，其中氧氣的水平大大低于大氣中的濃度，以延長產(chǎn)品的上架壽命.預先包裝的沙拉發(fā)生腐敗的最常見癥狀就是萵苣的切面發(fā)生褐變.盡管控制了空氣的包裝會使褐變延遲，但也會產(chǎn)生難聞的氣味和異味.下調DHS已表現(xiàn)出作為延遲萵苣的切面發(fā)生褐變的可選策略.DHS催化真核翻譯起始因子5A(eIF5A)的活化，后者的作用是作為桉質穿梭蛋白來選擇mRNAs群體。DHS似乎在切開的萵苣的褐變中發(fā)揮作用——因為如果抑制DHS表達(通過反義技術)在空氣條件下可使得褐變的發(fā)生顯著延遲.具體地，80%的野生型萵苣植株的切開片段在切開6天后出現(xiàn)褐變，而來自5個分離譜系的轉基因植株中平均僅有27%的切開片段在相同的時間內發(fā)生褐變，某些個體植株的褐變?yōu)?%。在萵苣中通過使用反義構建體來抑制DHS表達可使得切開的萵苣與野生型萵苣相比，褐變的發(fā)生延遲了.參見實施例27與圖149-151。[0310]麻瘋樹(Jatropha curcas.L)因其高含油量而聞名，可作為生物燃料的可能來源.從種子中所榨取的清油已經(jīng)用于照明和潤滑，而且最近已被建議用于能源，一噸堅果可產(chǎn)生70kg精煉石油、40kg “氣油底(gasoil Ieger) ” (照明用染料油)、40kg正規(guī)燃油、34kg干焦油/浙青/松脂、270kg焦碳狀木炭及200kg氨水、天然氣、雜酚油等，因此，增加種子產(chǎn)量(這樣油產(chǎn)量也增加)的能力可提供更大價值。可通過三個策略來實現(xiàn)種子產(chǎn)量增加.第一個策略涉及組成型上調生長eIF-5A。優(yōu)選地，這可通過使用異源生長eIF-5A同工型(也就是使用油菜或者擬南芥生長eIF-5A)將共抑制可能性降到最低來實現(xiàn).這具有雙重效果一上調了羥丁賴氨酸化的生長eIF-5A，并且也上調了未羥丁賴氨酸化的衰老eIF-5A——因為產(chǎn)生了比DHS可活化(羥丁賴氨酸化)的eIF_5A更多的eIF_5A.可使用任何植物的生長eIF-5A，例如，番茄或三角葉楊生長eIF-5A可用于麻瘋樹中.第二個策略涉及組成型上調突變的衰老eIF-5A，其中通常被羥丁賴氨酸化的保守的賴氨酸被轉換為丙氨酸.這種突變的eIF-5A不能被羥丁賴氨酸化(活化)，以其未羥丁賴氨酸化的形式可促進生長.參見圖166和167——所示的是具有突變衰老eIF-5A的轉基因擬南芥植株要大于野生型擬南芥植株.更大的植株具有更多花梗和更多種子.此外，未羥丁賴氨酸化的衰老eIF-5A可增強植株利用氮的效率，因此使它們在土壤中低氮的條件下勝過對照植株.第三個策略涉及組成型下調DHS。由于植物需要某些DHS以正確行使功能，因此這必須是DHS的部分下調。但如上所述，部分下調DHS可充分促進生長并增加種子產(chǎn)量，這大概是由于未羥丁賴氨酸化的衰老eIF-5A的累積.[0311]圖47與148 (a)和(b)所示的是多種DHS的氨基酸序列比對，表明DHS是高度保守的.圖148(a)和(b)表明了 DHS非常保守的賴氨酸以及其它區(qū)域.實際上，DHS非常保守，編碼一種植物DHS的分離的多核苷酸可以正義方向插入到另一個植物物種中，并仍可下調DHS.[0312]圖100所示的是測量油菜產(chǎn)量(通過提高植物生長的生長量來測定)的條線圖.該圖表明可通過提高生長eIF-5A表達(使用正義構建體)或通過提高DHS表達(使用正義構建體)來增加產(chǎn)量.標記了“油菜”的第二個條線圖所示的是當通過使用正義方向的油菜DHS來上調油菜DHS時可實現(xiàn)增加.第四個條線圖所示的是在油菜植物中通過以正義方向使用番茄DHS可增加油菜產(chǎn)量.[0313]在另一個抑制內源DHS表達的方法中，將以正義方向含有本發(fā)明DHS多核苷酸的表達載體整合到植株至少一個細胞的基因組中.DHS多核苷酸被轉錄，由此引發(fā)的外源DHS共表達導致內源DHS表達的下調或抑制.[0314]通過抑制內源DHS的表達，所獲得的轉基因植物沒有或只有很少DHS蛋白來活化eIF-5A.如先前所討論，eIF-5A必須活化才能使其具有生物學用途。因此，通過抑制或降低DHS的表達——通過反義多核苷酸或者正義多核苷酸造成的共抑制，所獲得的轉基因植物沒有活化eIF-5A或者活化eIF-5A減少了.這些轉基因植物會表現(xiàn)出植物生物量上有所增加、增加的種子產(chǎn)量和/或增加的種子大小.具有DHS反義多核苷酸的轉基因植株在光合作用中也表現(xiàn)出增加，并且淀粉含量也增加了。參見實施例24和25.[0315]本發(fā)明也提供了 DHS上調.通過提供導入植物中可引發(fā)上調的正義DHS核苷酸，所獲得的植物的DHS量增加了.所獲得的轉基因植物具有增加的生物量和種子產(chǎn)量.[0316]通過用特異性針對DHS的抑制物來處理康乃馨花，提供了支持論點一DHS和eIF-5A在衰老中發(fā)揮調控作用——的進一步的證據(jù)。亞精胺和eIF-5A是DHS反應的底物(Park et al, 1993 ；Park et al, 1997).幾種與亞精胺結構特征類似的單、二、及多胺可在體外抑制DHS活性(Jakus et al，1993).某些多胺，譬如亞精胺、腐胺和精胺通常用于延長康乃馨的瓶插壽命(Wang and Baker, 1980).通過用不同多胺在不同濃度下的處理，Wang等(unpublished b)能 夠將康乃馨花的瓶插壽命延長2倍.進一步的使用瞬時感染系統(tǒng)來下調DHS的研究也在進行中.初步數(shù)據(jù)表明在第8天時，在用表達反義DHS的瞬時感染系統(tǒng)真空滲入轉化的切開的康乃馨中，百分比存活率幾乎高于未處理花的4倍(Wang et al,unpublished b)。
[0317]除了生長損失外，農藝學上另一個由于脅迫造成的主要損失是收割后脅迫誘導的衰老(McCabe et al，2001).對于諸如切開的萵苣這樣的需要進行部分加工的植物尤為如此.切開的萵苣的一個癥狀是褐變，這是產(chǎn)生了酚類的結果(Matile et al，1999).用含萵苣eIF-5A (LeIF-5A)反義多核苷酸或者反義全長DHS的萵苣的田間實驗表明，在切開后，轉基因萵苣比對照萵苣對褐變的有更為顯著抗性.參見圖149-151.似乎即便是脅迫誘導的由于收割產(chǎn)生的衰老也有獨特的線路(Page et al，2001)，褐變的翻譯控制上游與其它可能的衰老癥狀至少部分由DHS和eIF-5A來調節(jié)。衰老調控的下游是執(zhí)行基因。這些是衰老的效應物，可導致引發(fā)衰老綜合癥狀的新陳代謝改變.看起來當eIF-5A和DHS被下調時，能夠消除由于衰老導致的一系列綜合癥狀。
[0318]實施例1描述了分離在多種植物中編碼DHS的mRNA。實施例2描述了在番茄中通過用山梨醇處理番茄葉片來誘導衰老誘導的DHS。圖52和62所示的是當葉片用山梨醇處理時DHS表達增加了。實施例3與圖50和63所示的是DHS在衰老的花中被上調.實施例4與圖51和61所示的是DHS在成熟果實中被上調.[0319]本發(fā)明還涉及識別三種eIF_5A同工型——(衰老誘導因子eIF_5A)、(創(chuàng)傷因子eIF-5A)和(生長因子eIF-5A)——的抗體。
[0320]本發(fā)明還提供了在其它植物和真茵中鑒定衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A、生長eIF-5A和DHS的方法.通過使用本文所述方法以及所提供的序列，可以設計用來分離/鑒定所需同工型或DHS的探針.由于eIF-5A同工型(衰老誘導eIF_5A、創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A和生長eIF-5A)在編碼區(qū)通常是高度同源的(參見圖2)，為了確保鑒定，甚至改變期望同工型的放大倍數(shù)，優(yōu)選地從5’UTR起始處到3’UTR末端設計探針或引物(參見圖3、4和5).—套優(yōu)選的用于擴增創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的引物或者用于鑒定創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A的探針如下所示.下游引物是Y GAG CTC AAG AAT AAC ATCTCA TAA GAAAC3' (SEQ ID NO:33).上游引物是 5' CTC GAG TGC TCA CTT CTC TCT CTTAGG3，(SEQ ID NO:34).[0321]在從植物或植物部分分離創(chuàng)傷/病原體誘導eIF_5A之前，最好先引入創(chuàng)傷事件，使植物開始表達創(chuàng)傷/病原體誘導eIF-5A。任何創(chuàng)傷事件都是允許的，這類可示例的創(chuàng)傷事件包括在中央脈管擠壓葉片。類似地，在分離衰老誘導eIF-5A前，最好脅迫植物組織以誘發(fā)衰老。
[0322]現(xiàn)在已基本描述了本發(fā)明，將通過參考以下實施例來更好了解本發(fā)明，提供這些實施例是為了作為示例，并不意味著限定本發(fā)明.實施例
[0323]實施例1
[0324]信使RNA (mRNA)的分離
[0325]在不同的發(fā)育階段從番茄花和番茄果實中以及從葉片(未處理或者經(jīng)冷凍或山梨醇處理后)中分離總RNA.在液氮中簡單研磨組織(5g).研磨后的粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍,2.5mM NaOAc pH8.5,0.8%.-巰基乙醇)混合.混合物用四層粗棉布過濾，于4°C在10000Xg離心30分鐘.然后將上清進行氯化銫密度梯度離心，于26000Xg離心20小時.離下的RNA用75%的乙醇洗滌，重懸在600 μ IDEPC-處理過的水中，于-70°C用0.75ml95%乙醇和30 μ 13Μ NaOAc沉淀RNA.在1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上分離10 μ gRNA，轉移到尼龍膜上.用隨機引物引導的32p-dCTP標記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO:1)為探針與膜在42°C過夜.然后于室溫下在含0.1% SDS的IXSSC中洗膜一次，時間為15分鐘，再于65°C在含0.1% SDS的0.2X SSC中洗膜三次，每次15分鐘.然后于_70°C將膜置于X-射線膠片上過夜.[0326]使用Promega商品化的PolyA+tractmRNA Isolation System來分離PolyA+mRNA.通過使用 Stratagene (La Jolla, Calif.)商品化的 ZAP ExpreSI? cDNA synthesissystem可將PolyA+mRNA用作cDNA合成的模板.[0327]番茄葉片cDNA文庫的篩選
[0328]將使用從已用2M山梨醇處理6小時的Match Fl雜和番茄葉片中分離的mRNA所構建的cDNA文庫稀釋到約5 X IO6PFU / ml。用32p-標記的600bp的RT-PCR片段來篩選cDNA文庫.分離到 3個陽性cDNA克隆，并根據(jù)操作手冊上的方法與pBK-CMV? (Stratagene)噬粒重新環(huán)化。將全長cDNA插入到pBK-CMV載體中.[0329]質粒DNA分離，DNA測序
[0330] 使用Sambrook等(同上)所述的堿裂解法來分離質粒DNA。用雙脫氧測序法來對全長陽性 cDNA 進行測序。Sanger, et al, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 74:5463-5467.使用BLAST 搜索(GenBank, Bethesda, MD)來編輯并分析開放閱讀框，用 BCM Search Launcher:Multiple Sequence Alignments Pattern-1nduced Multiple Alignment Method(參見F.Corpet, Nuc.Acids Res., 16:10881-10890, (1987))獲得了與由編碼基因所推定的氨基酸序列同源性最高的5個蛋白的序列比對。使用MultiFinder鑒定了推定氨基酸序列中的功能結構域.[0331]番爺RNA的Northern印跡雜交
[0332]在不同階段(蓓蕾、開花及充分開花或正在枯萎的衰老花瓣)從番茄花、在不同成熟階段(顯色期，也就是紅色少于10%的綠色果實；粉色期，也就是整個果實噬橙色或者粉色；及紅色期，軟或者堅固)從番茄葉片和番茄果實中分離的?ο μ g總RNA，在1%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上進行分離，并固定在尼龍膜上.用隨機引物試劑盒(BoehringerMannheim)進行32p-標記的全長番爺cDNA來檢測濾膜(7 X 107cpm)。于室溫下在I X SSC,0.1%505中洗膜一次，再于65°〇在0.2\55(:，0.1 % SDS中洗膜三次.干燥濾膜，并于_70°C將膜置于X-射線膠片上過夜.結果如圖50-52所示.[0333]擬南芥RNA的Northern印跡雜交
[0334]按上述方法于5周齡(泳道I)、6周(泳道2)和7周(泳道3)時從擬南芥植株葉片中分離總RNA，在1%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上進行分離，并固定在尼龍膜上.用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)進行32P_dCTP標記的全長擬南芥衰老誘導的DHS cDNA來檢測濾膜(7 X 107cpm).于室溫下在1XSSC，0.1%SDS中洗膜一次，再于65°C在0.2XSSC，0.1% SDS中洗膜三次.干燥濾膜，并于-70°c將膜置于X-射線膠片上過夜.結果如圖55所示.[0335]康乃馨RNA的Northern印跡雜交
[0336] 按上述方法在花發(fā)育的不同階段一即蓓蕾緊密的花(泳道I)、開始開放(泳道2)、完全開放的花(泳道3)、花瓣內卷的花(泳道4)——從康乃馨植株花瓣中分離總RNA，在1%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上進行分離，并固定在尼龍膜上。用隨機引物試劑盒(Boehringer Mannheim)進行32p_dCTP標記的全長康乃馨衰老誘導的DHS cDNA來檢測濾膜(7X 107cpm).于室溫下在 1XSSC,0.1% SDS 中洗膜一次，再于 65。。在 0.2X SSC, 0.1%SDS中洗膜三次.干燥濾膜，并于_70°C將膜置于X-射線膠片上過夜.結果如圖56所示.[0337]實施例2
[0338]山梨醇誘導番茄衰老誘導的DHS基因
[0339]用2M山梨醇在密閉腔中處理番茄葉片6小時.按如下所述從山梨醇處理過的葉片中提取RNA.[0340]在液氮中研磨葉片(5g).研磨后的粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mMNaOAc pH8.5,0.8%.-巰基乙醇)混合.混合物用四層粗棉布過濾,于4°C在10000 X g離心30分鐘.然后將上清進行氯化銫密度梯度離心，于26000 Xg離心20小時.離下的RNA用75%的乙醇洗滌，重懸在600μ I DEPC-處理過的水中，于-70°C用0.75ml95%乙醇和30 μ 13Μ NaOAc沉淀RNA.在1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上分離10 μ g RNA，轉移到尼龍膜上.用隨機引物引導的32P-dCTP標記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO: I)為探針與膜在42°C過夜。然后于室溫下在含0.1% SDS的IXSSC中洗膜一次，時間為15分鐘，再于65°C在含0.1% SDS的0.2 X SSC中洗膜三次，每次15分鐘.然后于_70°C將膜置于χ-射線膠片上過夜。
[0341]結果如圖52所示。可以觀察到，山梨醇誘導了葉片中DHS的轉錄.[0342]實施例3
[0343]在衰老的花中誘導番茄DHS基因[0344]采摘番茄植株緊密的花蓓蕾以及開放的、衰老的花，按實施例2中方法分離RNA.在1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上分離IOyg RNA，轉移到尼龍膜上.用隨機引物引導的32p-dCTP標記的全長DHS cDNA (SEQ ID NO:1)為探針與膜在42°C過夜。然后于室溫下在含0.1% SDS的IXSSC中洗膜一次，時間為15分鐘，再于65°C在含0.1% SDS的0.2 X SSC中洗膜三次，每次15分鐘.然后于-70°C將膜置于χ-射線膠片上過夜。
[0345]結果如圖50所示.可以觀察到，在衰老的花中誘導了 DHS的轉錄。
[0346]實施例4
[0347]在成熟果實中誘導番茄DHS基因
[0348]按實施例2中方法從顯色的、粉色的和成熟的果實中分離RNA。在1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上分離IOyg RNA，轉移到尼龍膜上。用隨機引物引導的32P-dCTP標記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO:1)(圖45)為探針與膜在42°C過夜.然后于室溫下在含0.1% SDS的IXSSC中洗膜一次，時間為15分鐘，再于65°C在含0.1% SDS的0.2XSSC中洗膜三次，每次15分鐘.然后于_70°C將膜置于χ-射線膠片上過夜.[0349]結果如圖51所示.可以觀察到，在發(fā)生導致腐爛的衰老之前的成熟的紅色果實中DHS的轉錄最強.[0350]實施例5
[0351]通過冷 凍來誘導番茄衰老誘導的DHS基因
[0352]將罐中的番茄植株(7-8周齡)于6°C的培養(yǎng)箱中放置兩天、3天或6天.光循環(huán)設置位8小時黑暗16小時光照.通過將植株移回溫室使植株再次變暖.在從培養(yǎng)箱移走后立刻采集未再次變暖的植株。按如下所述從葉片中提前RNA.[0353]在液氮中研磨葉片(5g).研磨后的粉末與30ml胍鹽緩沖液(4M異硫氰酸胍，2.5mMNaOAc pH8.5,0.8%.-巰基乙醇)混合?；旌衔镉盟膶哟置薏歼^濾,于4°C在10000 X g離心30分鐘。然后將上清進行氯化銫密度梯度離心，于26000 Xg離心20小時.離下的RNA用75%的乙醇洗滌，重懸在600 μ I DEPC-處理過的水中，于-70°C用0.75ml95%乙醇和30 μ 13Μ NaOAc沉淀RNA.在1.2%甲醛變性的瓊脂糖凝膠上分離10 μ g RNA，轉移到尼龍膜上.用隨機引物引導的32p-dCTP標記的全長DHS cDNA(SEQ ID NO:1)為探針與膜在42°C過夜.然后于室溫下在含0.1% SDS的IXSSC中洗膜一次，時間為15分鐘，再于65°C在含0.1% SDS的0.2X SSC中洗膜三次，每次15分鐘。然后于_70°C將膜置于χ-射線膠片上過夜。
[0354]結果如圖53所示?？梢杂^察到，在處于冷凍溫度并隨后再次變暖的葉片中誘導了DHS的轉錄，并且，增強的轉錄于通過膜泄漏所測量的冷凍損傷相關.[0355]實施例6
[0356]使用基于未鑒定的擬南芥基因組序列的引物來生成擬南芥PCR產(chǎn)物
[0357]使用一對由擬南芥基因組序列設計的寡聚核苷酸引物，通過PCR從擬南芥cDNA模板生成部分長度的衰老誘導的DHS的序列。5’引物長19-mer，序列為 5’-GGTGGTGT5TGAGGAAGATC(SEQ ID NO:7) ;3’ 引物長 20-mer，序列為GGTGCACGCCCTGATGAAGC-3’ (SEQ ID NO:8).按如下所述進行以擬南芥葉片cDNA文庫為模板的、使用 Expand High Fidelity PCR System (Boehringer Mannheim)的聚合酶鏈反應.[0358]反應組分:[0359]
【權利要求】
1.一種提高植物中種子產(chǎn)量的方法，其中所述植物至少一個細胞的基因組中整合了含有DHS反義多核苷酸以及與該反義多核苷酸可操作連接以使該反義多核苷酸轉錄的調控序列的載體，所述反義多核苷酸的轉錄降低了植物內源DHS的表達，從而提高了種子產(chǎn)量。
2.一種提高植物中種子產(chǎn)量的方法，其中所述植物至少一個細胞的基因組中整合了含有生長eIF-5A正義多核苷酸以及與該正義多核苷酸可操作連接以使該正義多核苷酸轉錄的調控序列的載體，所述正義多核苷酸的轉錄增加了植物內源eIF-5A的表達，從而提高了種子產(chǎn)量。
【文檔編號】C12N15/82GK103911391SQ201310573295
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2005年12月5日 優(yōu)先權日:2004年12月3日
【發(fā)明者】J.E.湯普森, T.-W.王, W.吳, L.諾沃克 申請人:森尼斯科技術公司