一種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體是一種制備水生棲熱菌（Thermusaquaticus)TaqDNA聚合酶基因重組表達(dá)酶的方法。該基因核苷酸序列及編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別為SEQIDNO：1和SEQIDNO：2。本發(fā)明通過(guò)基因克隆技術(shù)克隆出基因序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體，利用已構(gòu)建的TaqDNA聚合酶基因的重組菌株，利用LB培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮，37℃培養(yǎng)4.5小時(shí)后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)16-20小時(shí)，離心收集菌體后使用2-4mg/ml溶菌酶解離得到蛋白液，通過(guò)層析柱和透析袋過(guò)濾，得到高純度活性蛋白TaqDNA聚合酶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性好，得到的TaqDNA聚合酶活力高，可有效地保證產(chǎn)品產(chǎn)量和純度，用于基因PCR擴(kuò)增效果良好。
【專利說(shuō)明】—種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種制備重組Taq DNA聚合酶的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]1985年,美國(guó)Cetus公司發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction, PCR)，是一種對(duì)特定的DNA片段在體外進(jìn)行快速擴(kuò)增的方法，即雙鏈DNA在高溫下變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶、dNTP、特異引物的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)制成同樣的兩分子拷貝。 [0003]原始菌YT-1 (Thermus aquatjcus)具有天然DNA聚合酶，但其Taq DNA聚合酶含量低，從其培養(yǎng)物純化酶需要進(jìn)行選擇性沉淀和離子交換色譜分離，難以滿足對(duì)Taq DNA聚合酶的需求。因此，市售的Taq DNA聚合酶大都是基因工程產(chǎn)品，可有效地提高其產(chǎn)率和分離效率。
[0004]雖然Taq DNA聚合酶己經(jīng)商品化生產(chǎn)多年，但為了提高該蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)量，簡(jiǎn)化純化工藝的嘗試一直沒(méi)有停止。Pluthme Fred利用Taq DNA聚合酶的熱穩(wěn)定性，提出凍融法去除雜蛋白等大分子，所制備的酶可用于PCR和測(cè)序反應(yīng)；孫亮先等利用該酶的熱穩(wěn)定性，經(jīng)兩輪_70°C深度冷凍和75°C水浴，使細(xì)菌裂解釋放內(nèi)容物，高速離心除去凍融變性的細(xì)胞碎片及核酸蛋白的復(fù)合物以達(dá)到快速純化Taq DNA聚合酶的目的，PCR擴(kuò)增反應(yīng)表明所制備的Taq DNA聚合酶的活力、敏感性、特異性均達(dá)到試驗(yàn)要求。包永明等在用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)后，采用聚乙烯亞胺沉淀Taq DNA聚合酶，離子交換柱Bio-Rex-70分離純化，完成Taq DNA聚合酶基因的超表達(dá)；趙美蓉等將含有Taq DNA聚合酶基因的E.coli經(jīng)發(fā)酵，細(xì)胞培養(yǎng)液經(jīng)破壁裂解，粗蛋白抽提經(jīng)Sephaeryl-s-100,CM-Sephadex C50柱層析等純化步驟，獲得了重組Taq DNA聚合酶；汪靖超等利用熱變性、親和層析、陽(yáng)離子交換層析獲得了電泳純的重組Taq DNA聚合酶；何鋼等嘗試對(duì)TaqDNA聚合酶的制備技術(shù)進(jìn)行整體優(yōu)化，以插入重組Taq DNA聚合酶基因的Pet_24a表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，以2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)8小時(shí)，可獲得較高的Taq DNA聚合酶表達(dá)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)目前現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種重組Taq DNA聚合酶及其制備方法，該制備方法可以得到高純度Taq DNA聚合酶。利用本發(fā)明建立的方法，可從500ml菌液中純化到約3.5ml Taq DNA聚合酶液，酶活達(dá)到16.1Mful0
[0006]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組Taq DNA聚合酶，其蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼所述Taq DNA聚合酶的基因，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種制備重組Taq DNA聚合酶的方法，具體步驟如下:
(1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列；
(2)將步驟(1)所得的核苷酸片段和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a_Taq ；
(3)將重組質(zhì)粒pET32a_Taq轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞疋coliBL21中，獲得表達(dá)菌
株;
(4)表達(dá)菌株利用LB培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)4.5小時(shí)后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)16-20小時(shí)后；解離菌體，過(guò)濾；獲得所述重組Taq DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]步驟(1)中,所述核苷酸序列是從水生棲熱菌中分離出來(lái)的Taq DNA聚合酶基因，所述基因編碼蛋白可用于制備重組Taq DNA聚合酶。所述基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO:1所示，所述基因編碼的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]進(jìn)一步地，在步驟(4)中，所述解離菌體為采用溶菌酶解離菌體；所述過(guò)濾為以層析柱和透析袋連續(xù)過(guò)濾。
[0011]在本發(fā)明更進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所述溶菌酶的濃度為4mg/ml ;所述層析柱為Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂；
本發(fā)明是在已構(gòu)建的重組Taq DNA聚合酶基因表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，進(jìn)行表達(dá)體系的優(yōu)化，提高其Taq DNA聚合酶表達(dá)和純化效率，以獲得穩(wěn)定、高活力的Taq DNA聚合酶。本發(fā)明通過(guò)基因克隆的方法，從水生棲熱菌中克隆到了一個(gè)Taq DNA聚合酶基因。通過(guò)制備重組Taq DNA聚合酶的方法，重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)制備出高活力Taq DNA聚合酶，酶活達(dá)到16.1Mful0
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1為本發(fā)明純化的Taq DNA聚合酶蛋白質(zhì)電泳圖(1-10為收集的Taq DNA聚合酶；11為市售Taq DNA聚合酶，作為陽(yáng)性對(duì)照；M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量)。
[0013]圖2為本發(fā)明制備的Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR檢測(cè)酶活性電泳圖(1_4泳道為本發(fā)明的提取制備的Taq DNA聚合酶對(duì)模板DNA的PCR反應(yīng)，分別稀釋40倍，30倍，20倍，10倍；5-7泳道為市售Taq DNA聚合酶(5U/ul)對(duì)模板DNA的PCR反應(yīng)，分別稀釋8倍，7倍，6倍，5倍；M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量)。
[0014]圖3為本發(fā)明制備的Taq DNA聚合酶和商售Taq DNA聚合酶進(jìn)行PCR檢測(cè)比較酶活性電泳圖(1-4泳道為商售Taq DNA聚合酶不同批次對(duì)模板DNA的PCR反應(yīng)；5_8泳道為本發(fā)明提取制備的不同批次Taq DNA聚合酶對(duì)模板DNA的PCR反應(yīng)；M為標(biāo)準(zhǔn)DNA分子量)。
【具體實(shí)施方式】
[0015]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(Sambrook J, et al.2008.Molecular Cloning: A LaboratoryManual, 3rd Ed.)中所述的條件,或按照制造廠商所建議的條件。
[0016]實(shí)施例1:基因全長(zhǎng)編碼區(qū)的克隆與分析采用市售的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒法提取水生棲熱菌(Thermusaquaticus)總DNA，采用Touchdown PCR技術(shù)和普通PCR技術(shù)進(jìn)行Taq DNA聚合酶基因的全長(zhǎng)序列擴(kuò)增，擴(kuò)增引物包括 2 組(5，-tatatgagggggatgctgccc-3，和 5，-tcactccttggcggagagc-3，)。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在紫外燈下切割含有目的條帶的膠塊，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段，于_20°C保存?；厥盏哪康钠?，于16°C金屬浴過(guò)夜連接至克隆載體PMD19-T (寶生物工程有限公司，TaKaRa)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞萬(wàn).ToplO (北京天根生化科技有限公司)中，涂布于含有l(wèi)OOmg/mL Amp的LB固體培養(yǎng)基上，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)IPTG/X-gal藍(lán)白斑篩選后，挑取4_10個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果通過(guò)序列比對(duì)，分離到了一個(gè)Taq DNA聚合酶基因。Taq DNA聚合酶基因序列全長(zhǎng)為2499bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，編碼832個(gè)氨基酸，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子。Taq DNA聚合酶基因PCR回收產(chǎn)物和pET32a質(zhì)粒(寶生物工程有限公司，TaKaRa)進(jìn)行EcoRI和NotI雙酶切，在37°C金屬浴3_4h后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收。將目的片段Taq DNA聚合酶基因和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，16°C過(guò)夜，構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pET32a_Taq。轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞疋coliBL21 (北京天根生化科技有限公司)中，獲得表達(dá)菌株，命名為Taq DNA聚合酶菌株。
[0017]實(shí)施例2:重組Taq DNA聚合酶菌株的培養(yǎng)及誘導(dǎo)
配制LB液體搖瓶(500 ml的LB液體培養(yǎng)基，分裝在2個(gè)500 ml的三角瓶中，即每瓶裝250 ml，滅菌后待用)。取出Taq DNA聚合酶 菌種，接種在4 ml的LB + Amp (100 Ug/ml)液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)16-20小時(shí)。每個(gè)三角瓶裝250 ml的LB液體培養(yǎng)基，加入Amp (抗生素的終濃度為100 yg/ml)，并用1.25 ml的培養(yǎng)的菌種接種；37°C培養(yǎng)4.5小時(shí)。
[0018]加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)，在37°C繼續(xù)培養(yǎng)16-20小時(shí)。
[0019]實(shí)施例3:重組Taq DNA聚合酶純化器具準(zhǔn)備
層析柱選用Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂(干粉的大小是mesh size 100-200。溶脹后的結(jié)合能力為5-10 mg蛋白質(zhì)/ml)。稱取7g的Bio-Rex 70的干樹脂,放在小燒杯中，用dd H20洗，去掉漂浮的小顆粒，室溫溶脹2小時(shí)，期間換幾次dd H2O;用含50 mM KCl的溶液C預(yù)平衡，待用；用含50 mM KCl的溶液C平衡好的樹脂。裝好樹脂后再用6_10倍柱床體積的含50 mM KCl的溶液C平衡柱子。檢查進(jìn)入柱子和流出柱子的溶液C的pH值不變。
[0020]實(shí)施例4:蛋白質(zhì)提取
4°C,4000 rpm，離心20分鐘收集菌體；重懸在30 ml的溶液A中，沖洗收集的菌體；4°C,8000 rpm，離心10分鐘收集菌體；重懸在20 ml溶液A中，混勻。加入80 mg的溶菌酶，使終濃度達(dá)到4 mg/ml ;在室溫(25°C)下保持15分鐘；加入20 ml的溶液B，75°C水浴保溫I小時(shí)，期間晃動(dòng)幾次；4°C，10000 rpm,離心20分鐘，棄沉淀，收集收集上清液；磁力攪拌器攪拌，在上清液中逐滴加入5% PEI，使終濃度達(dá)到0.15% (體積);室溫下(25°C)繼續(xù)攪拌10分鐘；4°C，10000 rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4°C，8000 rpm，離心15分鐘，收集沉淀；用12 ml的含25 mM KCl的溶液C重懸，并洗滌沉淀；4°C，5000 rpm,離心10分鐘，收集上清液，測(cè)量收集上清液的體積；加入2倍體積的不含KCl的溶液C，使收集上清液的最終KCl的濃度達(dá)到50mM。
[0021]實(shí)施例5:蛋白質(zhì)純化及檢測(cè)將上清液裝在平衡好的層析柱上；層析柱平衡使用6倍體積(約60 ml)以上的含50 mMKCl的溶液C，再次平衡；樣品用含200 mM KCl的溶液C洗脫，一般準(zhǔn)備50ml洗脫液。
[0022]將收集的每個(gè)部分在SDS-PAGE上電泳，用市售的Taq DNA聚合酶做對(duì)照(詳見圖
1)，進(jìn)行蛋白質(zhì)大小和純度檢測(cè)；電泳較亮的泳道表示Taq DNA聚合酶高含量，將這些部分(3，4，5，6)收集在一起；放在透析袋中使用500 ml溶液D透析，4°C，20小時(shí)左右，期間換一次透析液；最后收集得到高純度Taq DNA聚合酶，經(jīng)檢測(cè)所得高純度Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0023]實(shí)施例6:Taq DNA聚合酶功能的PCR驗(yàn)證及瓊脂糖電泳檢測(cè) 以質(zhì)粒PBI121作為PCR反應(yīng)的DNA模板，以Kana標(biāo)簽引物作為PCR引物。
[0024]PCR反應(yīng)體系總體積為25W，其中:10XPCR緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 9.0 ；500 mmol/L KCl ；20 mmol/L MgCl2,0.1% 明膠，1% Triton X-100) 2.5 Pl，dNTPMixture (各2.5 mM)4ul，引物1.0 uM, Taq DNA聚合酶包括實(shí)施例5制備的Taq DNA聚合酶和市售的Taq DNA聚合酶，(制備的Taq DNA聚合酶分別稀釋40倍，30倍，20倍，10倍；市售的Taq DNA聚合酶分別稀釋8倍，7倍，6倍，5倍);DNA模板I W (20 ng);加滅菌雙蒸水至25 W。應(yīng)用ABI 9700 PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序如下:首先94 V預(yù)變性5min，之后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括94 V變性30s、退火溫度(退火溫度視引物而定)30s、72°C延伸 I min，最后 72°C延伸 IOmin0
[0025]PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠，I X TAE緩沖液中進(jìn)行電泳；DNA標(biāo)記為DL2000。電壓90 V，時(shí)間40 min;凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察拍照，結(jié)果如圖2所示。將獲得的PCR成像結(jié)果使用SensiAnsysl.0.3分析軟件進(jìn)行PCR產(chǎn)物定量統(tǒng)計(jì)，獲得的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)結(jié)果如表1所示。根據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)計(jì)算出自制的Taq DNA聚合酶液的酶活達(dá)到16.7U/ul。
[0026]表1本發(fā)明制備的Taq` DNA聚合酶進(jìn)行PCR檢測(cè)獲得的PCR產(chǎn)物片段定量統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(樣品1-8對(duì)應(yīng)圖2中1-8泳道產(chǎn)物)
【權(quán)利要求】
1.一種重組Taq DNA聚合酶，其特征在于，其蛋白氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.一種編碼權(quán)利要求1所述的重組Taq DNA聚合酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的重組Taq DNA聚合酶的方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)克隆SEQID NO:1所示的核苷酸序列； (2)將步驟(1)所得的核苷酸片段和質(zhì)粒pET32a進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET32a_Taq ；(3)將重組質(zhì)粒pET32a_Taq轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞疋coliBL21中，獲得表達(dá)菌株; (4)表達(dá)菌株利用LB培養(yǎng)液進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，37°C培養(yǎng)4.5小時(shí)后，加入終濃度為0.5mM的IPTG誘導(dǎo)16-20小時(shí)后；解離菌體，過(guò)濾；獲得所述重組Taq DNA聚合酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述解離菌體為采用溶菌酶解離菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，在步驟(4)中，所述過(guò)濾為以層析柱和透析袋連續(xù)過(guò)濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述`的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述溶菌酶的濃度為4mg/ml。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備重組TaqDNA聚合酶的方法，其特征在于，所述層析柱為Bio-Rex 70的離子交換柱樹脂。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103602643SQ201310576003
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】劉濤, 馬秀芬 申請(qǐng)人:青島思能基因生物技術(shù)有限公司