一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，該方法將脂肪干細(xì)胞（ADSCs）誘導(dǎo)重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSCs）。具體包括如下步驟：（1）將多能性因子的cDNA導(dǎo)入ADSCs；（2）在無飼養(yǎng)層體系中，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟（1）得到的ADSCs；（3）出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞（ESCs）樣細(xì)胞克隆后，更換成添加有MEK與GSK3信號通路抑制劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，挑取細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)；（4）鑒定細(xì)胞克隆的多能性。本發(fā)明中，ADSCs成本低且易于大量獲取，重編程的速度與效率很高；無飼養(yǎng)層體系可以提高陽性iPSCs克隆的純度；無血清培養(yǎng)基避免了血清中未明確組分與批次差異帶來不穩(wěn)定因素；信號通路抑制劑能夠促進(jìn)細(xì)胞達(dá)到充分重編程的狀態(tài)，提高陽性iPSCs克隆的質(zhì)量。
【專利說明】一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及細(xì)胞領(lǐng)域，特別涉及一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是人體及其各種組織細(xì)胞的初始來源，其最顯著的生物學(xué)特征是既有自我更新和不斷增殖的能力，又有多向分化的潛能。干細(xì)胞根據(jù)不同的來源分為成體干細(xì)胞(Adult stem cells)和胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ESCs)。成體干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胰腺干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、脂肪干細(xì)胞等，在成體組織中存在的。
[0003]1981年，ESCs的分離和培養(yǎng)首先在小鼠中獲得成功，是至今研究最廣泛、最成熟的干細(xì)胞 體系。而人的干細(xì)胞的代始于1998年，美國科學(xué)家James A.Thomson帶領(lǐng)研究團(tuán)隊(duì)首次從人類胚胎組織中提取培養(yǎng)出ESCs株，并且證實(shí)此株細(xì)胞具有全能干細(xì)胞特征，此項(xiàng)研究論文發(fā)表在頂級學(xué)術(shù)期刊“Science”上面。人ESCs細(xì)胞研究的應(yīng)用前景主要是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，在組織工程學(xué)領(lǐng)域中以人ESCs作為種子細(xì)胞，可為臨床上細(xì)胞、組織或器官的移植治療提供大量的材料。通過控制人ESCs分化培養(yǎng)環(huán)境、轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn)人ESCs定向分化的關(guān)鍵分子基因等體外誘導(dǎo)分化策略，可獲得特異性的組織細(xì)胞類型。這類細(xì)胞用于移植治療，將給糖尿病、帕金森氏病、脊髓損傷、白血病、心肌損傷、腎衰竭、肝硬化等疾病的治療帶來新的希望。
[0004]然而，一直以來，人ESCs研究面臨著許多難題和爭議，主要包括以下幾個方面:
(I)供體卵母細(xì)胞的來源困難，人ESCs建系效率低。此外，體細(xì)胞核移植(Somatic cellnuclear transfer, SCNT)技術(shù)的不成熟必將需要進(jìn)一步耗費(fèi)更多的人類卵母細(xì)胞,故而其來源難以得到保證；(2)免疫排斥反應(yīng)，除非采用SCNT技術(shù)，否則患者對人ESCs分化而來的各種細(xì)胞和組織仍然存在免疫排斥反應(yīng)；(3)人ESCs具有成瘤性，移植到受體的體內(nèi)后有發(fā)展為腫瘤的可能性，即使采用SCNT技術(shù)、給移植細(xì)胞設(shè)置自殺基因等應(yīng)對措施，也不一定能夠很好地解決這個問題。
[0005]為避開人ESCs和治療性克隆研究的倫理學(xué)爭論，需要找到一種替代途徑，以便將人類的體細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為多潛能干細(xì)胞，為患者提供“個性化”的自體干細(xì)胞。2003年，英國劍橋大學(xué)Gurdon研究小組發(fā)現(xiàn),將已完全分化的小鼠胸腺細(xì)胞或成人外周血淋巴細(xì)胞的細(xì)胞核注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞后，哺乳動物細(xì)胞核的分化標(biāo)志物喪失，而哺乳動物干細(xì)胞中最具特征性的標(biāo)志物0ct4基因則呈高表達(dá)，提示哺乳動物細(xì)胞核可直接被兩棲動物卵母細(xì)胞核泡所重構(gòu)從而表達(dá)0ct4基因。
[0006]2006年，日本京都大學(xué)Yamanaka研究小組采用體外基因轉(zhuǎn)染技術(shù),從24個因子中篩選出0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因等4個多能性因子，通過逆轉(zhuǎn)錄病毒將上述4個多能性因子導(dǎo)入小鼠胎兒成纖維細(xì)胞或成年小鼠尾部皮膚成纖維細(xì)胞，在小鼠ESCs的培養(yǎng)條件下獲得了多潛能干細(xì)胞系，該細(xì)胞系在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、基因表達(dá)譜、表面抗原標(biāo)記物、多潛能干細(xì)胞特異性基因的表觀遺傳學(xué)狀態(tài)、端粒酶活性、形成畸胎瘤等方面與小鼠ESCs非常相似，故將其命名為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)。[0007]接著，Yamanaka研究小組利用相同的技術(shù)，將上述同樣的4個多能性因子導(dǎo)入到人皮膚成纖維細(xì)胞中，成功獲得了人iPSCs。原代人類成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和源自新生兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞系同樣也可被重構(gòu)成為人iPSCs。這類iPSCs的各方面特性與人ESCs非常相似，并且在體外培養(yǎng)形成的擬胚體時和在小鼠體內(nèi)形成的畸胎瘤中均可分化為三個胚層的不同細(xì)胞類型。與此同時，威斯康辛大學(xué)Thomson研究小組也報(bào)道了成功誘導(dǎo)胎兒成纖維細(xì)胞重編程為具有人ESCs基本特征的iPSCs，所不同的是他們使用慢病毒作為載體，并在14個候選基因中選擇了 0ct4、Sox2、Nanog、Lin28等4個基因進(jìn)行轉(zhuǎn)染。這一被學(xué)界稱為生物科學(xué)“里程碑”的重大突破有望幫助科學(xué)家繞過克隆技術(shù)的倫理、道德紛爭，為醫(yī)學(xué)應(yīng)用打開大門。
[0008]盡管科學(xué)家們在人ESCs方面做出了顯著的成績，但從ESCs，或者說iPSCs到可以移植用的組織和器官，路途仍然艱辛而遙遠(yuǎn)。從另一個角度來講，部分科學(xué)家已經(jīng)開始尋找可以直接移植的器官。但由于人體器官來源的局限性，其它物種，尤其是有蹄類哺乳動物的器官開始進(jìn)入研究者的視野中，而豬就是其中一個典型的例子。由于豬在器官形態(tài)、體積及生理功能方面與人的相似性，且壽命較長，和目前使用廣泛的小鼠相比，更利于人類進(jìn)行透徹深入且有針對性的科學(xué)實(shí)驗(yàn)。小鼠ESCs廣泛的運(yùn)用實(shí)例告訴我們，在ESCs上，能夠很高效地實(shí)現(xiàn)遺傳修飾與生殖嵌合，進(jìn)而生產(chǎn)出具有特定性狀動物后代。同樣，運(yùn)用基因工程手段對豬的ESCs進(jìn)行基因操作，可以培育出有醫(yī)用前景的豬如抗超急性免疫排斥反應(yīng)的群體，有望實(shí)現(xiàn)人類的器官移植治療。在過去的幾十年中，對于豬的科學(xué)研究已經(jīng)取得了可喜進(jìn)步。然而，盡管許多科學(xué)家曾嘗試分離豬的ESCs，但都以失敗而告終，包括牛、羊等在內(nèi)，得到的也僅僅是類ESCs，這些細(xì)胞無法在體外長期維持多能性與自我更新的狀態(tài)。因此，目前對于豬細(xì)胞的遺傳操作大多基于體 細(xì)胞核移植技術(shù)。不過，由于卵母細(xì)胞對于體細(xì)胞核的重編程不徹底，產(chǎn)生的后代常有畸形，且核移植生產(chǎn)周期長，從而效率上偏低、費(fèi)時費(fèi)力。由此，豬iPSCs成為當(dāng)下極具應(yīng)用前景的選擇。
[0009]此外，將人iPSCs應(yīng)用到臨床之前，其所發(fā)揮的醫(yī)療效果有待于動物試驗(yàn)評估，安全問題即成瘤性問題也需要被嚴(yán)格檢測。由于小鼠的壽命較短，而靈長類動物猴的飼養(yǎng)又較為困難、成本很高，還涉及倫理道德問題。因而，除了用于器官移植，豬作為另一個可候選的生物模型，也開始受到很多科學(xué)家和臨床醫(yī)生的推崇，如通過建立人類多種遺傳性疾病性狀的豬模型來監(jiān)測分析iPSCs在組織再生醫(yī)學(xué)研究上的臨床療效、安全性，為加速人類iPSCs的臨床應(yīng)用提供科學(xué)數(shù)據(jù)。另外，在制藥領(lǐng)域，長期是以小鼠為實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行藥理、藥效研究，基于豬iPSCs生產(chǎn)得到的疾病模型的推廣，無疑也將大大加強(qiáng)藥物臨床前試驗(yàn)的可靠性，提高醫(yī)學(xué)試驗(yàn)的質(zhì)量。
[0010]當(dāng)前，已經(jīng)有多個國家的研究小組獲得了豬iPSCs，盡管經(jīng)證明轉(zhuǎn)染一系列外源因子可以使得豬成纖維細(xì)胞的表觀遺傳修飾和基因轉(zhuǎn)錄重置成接近ESCs的狀態(tài)，但豬iPSCs的誘導(dǎo)效率仍然十分低下，效率值約為0.1-0.2%，且陽性iPSCs克隆形成所需的周期較長，一般約在2周以上。同時，受制于對豬ESCs培養(yǎng)缺乏足夠的認(rèn)識與經(jīng)驗(yàn)，體細(xì)胞重編程條件設(shè)置上的不完善，所建立細(xì)胞系的多能性水平也并不充分，這些都將有礙于其在產(chǎn)業(yè)上的后續(xù)應(yīng)用。不同的細(xì)胞類型在重編程效率上不同，相同的細(xì)胞類型在不同的誘導(dǎo)條件下重編程效率也不同，因而尋找更為高效的豬iPSCs重編程技術(shù)體系，在今后的研究中是亟需克服的問題。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]為克服上述誘導(dǎo)豬iPSCs效率低、周期長的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種高效獲取豬iPSCs的技術(shù)方法，該方法為在無飼養(yǎng)層、無血清培養(yǎng)條件下，將ADSCs誘導(dǎo)重編程為多能干細(xì)胞，并且在重編程過程中的特定階段，使用MEK信號通路抑制劑PD0325901與GSK3信號通路抑制劑CHIR99021處理細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明所述的一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，所用于將來源于豬的脂肪干細(xì)胞(ADSCs)誘導(dǎo)重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞，其特征在于，包括如下步驟:
[0013](I)將多能性因子的cDNA導(dǎo)入ADSCs，其中所述的多能性因子為Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因；
[0014](2)在無飼養(yǎng)層體系中，使用無血清培養(yǎng)基或者加入代血清添加劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(1)得到的ADSCs ；
[0015](3)出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆后，在所述培養(yǎng)基中添加MEK信號通路抑制劑PD0325901與GSK3信號通路抑制劑CHIR99021，繼續(xù)培養(yǎng)3天，再挑取細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng);
[0016](4)鑒定細(xì)胞克隆的多能性，包括檢測細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、內(nèi)源多能性基因的表達(dá)、胚胎干細(xì)胞(Embryonic stem cells, ESCs)標(biāo)記物的表達(dá)、體內(nèi)分化形成畸胎瘤的能力。
[0017]根據(jù)本發(fā)明所述的方法的進(jìn)一步特征，所述步驟(1)中多能性因子的cDNA通過病毒載體導(dǎo)入所述ADSCs。優(yōu)選地，所述病毒載體為慢病毒載體。更優(yōu)選地，所述慢病毒載體為藥物可誘導(dǎo)的RevTet-On型表達(dá)載體。RevTet-On型慢病毒表達(dá)載體使得重編程獲得的iPSCs中外源多能性因子的表達(dá)具有隨時的可調(diào)控性，如在對iPSCs進(jìn)行基因修飾等遺傳操作后，即能夠選擇保持原有狀態(tài)，又能夠分化為正常的體細(xì)胞，便于根據(jù)需要進(jìn)行相應(yīng)的運(yùn)用處理。
[0018]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，在步驟(2)中，采用無飼養(yǎng)層體系，可以提高陽性iPSCs克隆的純度。優(yōu)選地，對于所述的無飼養(yǎng)層體系，需要在培養(yǎng)皿上預(yù)先包被基質(zhì)膠?；|(zhì)膠可自動聚集形成具有生物學(xué)活性的三維基質(zhì)，模擬體內(nèi)細(xì)胞基底膜的結(jié)構(gòu)、組成、物理特性和功能，有利于體外細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0019]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，在步驟(2)中，優(yōu)選采用無血清的培養(yǎng)基，它是由為化學(xué)限定性的各組分配制而成，成分清晰、明確，便于進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化改良、改造。優(yōu)選地，
[0020]根據(jù)本發(fā)明所述的方法的進(jìn)一步特征，所述步驟(2)中的無血清培養(yǎng)基可加入代血清添加劑，優(yōu)選是15% (體積百分比)血清替代物(例如KnockOutTMSR)或5mg/mL高脂牛血清白蛋白(例如AIbuMAX'11 II)。代血清添加劑可避免血清中的未明確組分以及批次差異給iPSCs培養(yǎng)狀態(tài)帶來不穩(wěn)定因素。
[0021]根據(jù)本發(fā)明所述的方法的進(jìn)一步特征，所述無血清培養(yǎng)基還包含:40%DMEM/F-12培養(yǎng)基、40% Neurobasal?培養(yǎng)基、1%N-2添加劑、l%B-27添加劑、1% GlutaMAX?添加劑、
0.1mMβ-巰基乙醇、1000U/ml白血病抑制因子、g/mL強(qiáng)力霉素。
[0022]根據(jù)本發(fā)明所述的方法的進(jìn)一步特征，所述白血病抑制因子為小鼠來源的。本發(fā)明也可采用其它物種來源的白血病抑制因子，但是小鼠源的白血病抑制因子在成本上相對地更為低廉。
[0023]根據(jù)本發(fā)明所述的方法，所述步驟(2)中培養(yǎng)的ADSCs的接種密度是本發(fā)明的關(guān)鍵因素之一。如果細(xì)胞接種密度過低，重編程的細(xì)胞基數(shù)很小，會降低陽性iPSCs克隆的得率，同時不利于細(xì)胞間有益因子的分泌互作行為；反之，如果細(xì)胞接種密度過高而間距過小，則在重編程期間不同單細(xì)胞增殖而來的細(xì)胞克隆會發(fā)生接觸以至于匯合到一起，從而造成不同重編程水平的細(xì)胞間產(chǎn)生交叉污染，無法得到完全重編程的陽性iPSCs克隆。優(yōu)選地，所述步驟(2)中培養(yǎng)的ADSCs是以2，500個細(xì)胞/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿上。實(shí)驗(yàn)表明，該接種密度下的ADSCs則能夠保證順利地完成重編程進(jìn)程，得到單純的陽性iPSCs克隆。
[0024]根據(jù)本發(fā)明所述的方法的進(jìn)一步特征，所述步驟(3)中所添加的MEK信號通路抑制劑可以是Selleckchem公司的PD0325901產(chǎn)品(商品號為S1036);所添加的GSK3信號通路抑制劑可以是Selleckchem公司的CHIR99021產(chǎn)品(商品號為S2924)。實(shí)驗(yàn)表明，0.5uM的MEK與3 y M的GSK3信號通路抑制劑，不僅可以促進(jìn)細(xì)胞重編程的發(fā)生，在誘導(dǎo)重編程的后期階段，MEK抑制劑還能夠促使未被重編程的以及部分重編程轉(zhuǎn)而又走向分化的細(xì)胞發(fā)生凋亡。
[0025]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)公開的其它用于獲取豬iPSCs的策略不同，本發(fā)明所述的方法較之以往進(jìn)行了全面的優(yōu)化，在源頭細(xì)胞材料上選取了易于高效重編程的成體干細(xì)胞ADSCs，在重編程環(huán)境中使用了更為安全的無飼養(yǎng)層、無血清體系，在重編程進(jìn)程的后期階段應(yīng)用了屏蔽細(xì)胞分化信號的通路抑制劑。因此，所用的ADSCs不僅可以誘導(dǎo)形成豬iPSCs，而且誘導(dǎo)重編程的效率顯著大于常用的成纖維細(xì)胞，豬ADSCs轉(zhuǎn)錄多能性因子后，在無飼養(yǎng)層、無血清條件下，可以高效、高純地誘導(dǎo)為iPSCs，效率約為1.53%左右，與成纖維細(xì)胞相比，誘導(dǎo)重編程的效率提高超過6倍，且細(xì)胞完成重編程進(jìn)程所需的周期縮短至少4天以上；產(chǎn)生的這些iPSCs多能性標(biāo)記物的表達(dá)情況與ESCs (參考小鼠、人)相近，同時外源因子的表達(dá)可以被完全沉默；在ADSCs重編的特定階段使用特定的信號通路抑制劑進(jìn)行處理，明顯提高了豬iPSCs的質(zhì)量，與重編程水平關(guān)聯(lián)的若干基因、表觀遺傳修飾位點(diǎn)的表達(dá)情況顯示出細(xì)胞已達(dá)到充分重編程狀態(tài)，為該豬多能干細(xì)胞領(lǐng)域的研究提供了良好平臺。此外，相對于目前難以直接從豬的胚胎提取出ESCs，及其提取過程中所需較高的人力、物力、時間成本，該方法將通過高效獲取豬的iPSCs，為遺傳操作提供了很大的便利，促進(jìn)基于豬iPSCs建立的器官移植用豬、人類遺傳性疾病模型豬的生產(chǎn)與推廣 ，服務(wù)于人類醫(yī)學(xué)的臨床實(shí)踐。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1是ADSCs及其誘導(dǎo)重編程得到的豬iPSCs形態(tài)圖。
[0028]圖2是豬iPSCs誘導(dǎo)重編程過程的不意圖。
[0029]圖3是豬iPSCs的堿性磷酸酶染色結(jié)果及其重編程效率分析圖。
[0030]圖4是豬iPSCs的多能性基因與ESCs標(biāo)記物表達(dá)鑒定圖。
[0031]圖5是豬iPSCs的畸胎瘤分化鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】[0032]1.定義和技術(shù):
[0033]除非另外指明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)的傳統(tǒng)技術(shù)，其屬于本領(lǐng)域技術(shù)范圍。參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.Sambrook等人編著(2008);《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》，F(xiàn).M.Ausubel等人編著(2008);《動物細(xì)胞培養(yǎng)——基本技術(shù)指南》，R.1.Freshney等人編著(2008)；《干細(xì)胞手冊》，R.Lanza等人編著(2013)。
[0034]本發(fā)明中使用的一些術(shù)語具有下列定義的含義:所有的數(shù)字標(biāo)識，例如pH、溫度、時間、濃度和分子量，包括范圍，都是近似值。要了解，雖然不總是明確的敘述，所有的數(shù)字標(biāo)識之前都加上術(shù)語“約”。也要了解，雖然不總是明確的敘述，本發(fā)明中描述的試劑僅僅是示例，其等價物是本領(lǐng)域已知的。
[0035]本發(fā)明所述的“誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)”是這樣的細(xì)胞，其在胚胎干細(xì)胞(ESCs)培養(yǎng)條件下，與ESCs在細(xì)胞形態(tài)、生長特性、表面標(biāo)記物表達(dá)、體內(nèi)外可分化形成包含三個胚層細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)等方面非常相似，而且在基因組DNA甲基化方式、基因表達(dá)譜、染色質(zhì)狀態(tài)等方面也也十分相似。
[0036]本發(fā)明所述的脂肪干細(xì)胞(ADSCs)是來自哺乳動物的ADSCs，它是從背、腹部皮下脂肪組織中分離提取獲得，具有可塑性。脂肪組織位于皮膚下方，屬于一種松散的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)，在動物體內(nèi)大量分布，根據(jù)脂肪細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的不同，將脂肪組織分為白色(黃色)脂肪組織、棕色脂肪組織，實(shí)驗(yàn)取材所用的屬于前者。脂肪組織除了由大量群集的脂肪細(xì)胞構(gòu)成，還富含具有自我更新能力的ADSCs，能夠參與皮膚等組織的損傷修復(fù)。
[0037]培養(yǎng)的ADSCs呈成纖維細(xì)胞樣的短梭形貼壁、渦旋狀生長，形態(tài)飽滿且折光性很強(qiáng)；分泌一些粘附分子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)、干細(xì)胞因子和生長因子，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)記物⑶44、⑶90、⑶29 ;在一定的誘導(dǎo)條件下能夠?qū)崿F(xiàn)可塑性，表現(xiàn)為橫向或縱向的分化能力，如向脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞分化。
[0038]各種動物來源的ADSCs均可以從動物中容易地分離，便于處理，對其研究也不會涉及倫理道德問題。例如從人類醫(yī)學(xué)美容相關(guān)手術(shù)術(shù)后的脂肪組織廢棄物中分離得到，或者從育肥家畜的脂肪組織中提取。
[0039]本發(fā)明所述的術(shù)語“誘導(dǎo)重編程”是指將體細(xì)胞去分化為多能性干細(xì)胞的過程。優(yōu)選地，通過將維持干細(xì)胞多能性所需的多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞即所述的ADSCs，可以誘導(dǎo)體細(xì)胞去分化成為多能性干細(xì)胞。其中，優(yōu)選地，所述的多能性因子包括0ct4、Sox2、Klf4,以及c-Myc基因。最優(yōu)選地，所述多能性因子為人源0ct4、Sox2、Klf4，以及c_Myc基因。具體地，所述多能性因子為0ct4，NCBI登錄號為NM_002701 ；Sox2, NCBI登錄號為NP_003097 ；Klf4, NCBI 登錄號為 NP_004226 ；c-Myc, NCBI 登錄號為 NP_002458。
[0040]將所述多能性因子cDNA導(dǎo)入體細(xì)胞的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的多種技術(shù)，包括病毒感染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔等各種將DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法。優(yōu)選地，使用包含cDNA的病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染，所述病毒載體包括慢病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體等多種病毒載體。優(yōu)選地慢病毒載體(例如可以受到特定藥物隨時調(diào)控表達(dá)的RevTet-On型載體)，如實(shí)施例中所述的。 [0041]本發(fā)明所述的“無飼養(yǎng)層、無血清培養(yǎng)條件”是在本領(lǐng)域常規(guī)干細(xì)胞培養(yǎng)條件基礎(chǔ)上的優(yōu)化處理，并且包括一些適宜各個具體細(xì)胞系，但是不影響細(xì)胞基本性質(zhì)的修飾。培養(yǎng)方法以及培養(yǎng)條件參見《干細(xì)胞手冊》，R.Lanza等人編著(2013)。[0042]本發(fā)明的高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的技術(shù)方法優(yōu)選實(shí)施例的過程如下，圖1是ADSCs及其誘導(dǎo)重編程得到的豬iPSCs形態(tài)圖；圖2是豬iPSCs誘導(dǎo)重編程過程的示意圖；圖3是豬iPSCs的堿性磷酸酶染色結(jié)果及其重編程效率分析圖；圖4是豬iPSCs的多能性基因與ESCs標(biāo)記物表達(dá)鑒定圖；圖5是豬iPSCs的畸胎瘤分化鑒定圖。
[0043]2.實(shí)施例
[0044]為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。
[0045]下列實(shí)施列舉例了發(fā)明人的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室實(shí)踐，用于示例本發(fā)明的模式，而不應(yīng)將本發(fā)明理解為限定于這些實(shí)施例的范圍。這些實(shí)施例，根據(jù)本發(fā)明公開和本領(lǐng)域技術(shù)人員的普遍水平，技術(shù)人員將理解下列僅用于示例，可以在不超過本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行各種變動、修飾和改造。其中所涉及的技術(shù)，除非特別說明，均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等方面的常規(guī)技術(shù)。
[0046]實(shí)施例1.細(xì)胞的制備和培養(yǎng)
[0047]1.1豬脂肪干細(xì)胞(ADSCs)的培養(yǎng)
[0048]從豬背、腹部皮下分離出脂肪組織，清除血管、肌肉殘留物，DPBS緩沖液(Gibco公司)洗滌充分洗滌，然后用外科手術(shù)剪將脂肪組織充分剪碎至幾乎無剪切阻力，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，加入相當(dāng)于脂肪組織總體積2~3倍的0.09%的I型膠原酶消化液(Sigma公司)，置于37°C水浴上振蕩、消化處理；組織懸液糊化后，用巴斯德吸管反復(fù)吹打以分散組織碎屑，l，200rpm室溫離心5min，棄掉離心管上層的成熟脂肪組織、中層的消化液，再用含10%胎牛血清的DMEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HyClone公司)充分地重懸離心管底層的細(xì)胞；依次用孔徑為250 u m、80 um,25um的尼龍網(wǎng)篩過濾細(xì)胞懸液，離心后棄掉基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用新鮮的基礎(chǔ)培養(yǎng)基反復(fù)洗滌離心管底層的細(xì)胞沉淀物；再次離心并棄掉基礎(chǔ)培養(yǎng)基后，用豬ADSCs完全培養(yǎng)基充分重懸細(xì)胞沉淀物，并接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)，放入37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。所述豬ADSCs完全培養(yǎng)基中包含DMEM/F-12培養(yǎng)基(HyClone公司)、10%胎牛血清(Gibco公司)、10ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長因子(Peprotech公司)、50 u g/mL L-抗壞血酸(Sigma公司)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco公司)。
[0049]1.2豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)的培養(yǎng)
[0050]豬iPSCs無血清完全培養(yǎng)基中包含40%DMEM/F-12培養(yǎng)基(Gibco公司)、40%Neurobasal&培養(yǎng)基(Gibco公司)、15%血清替代物(KnockOut? SR)或5mg/mL高脂牛血清白蛋白(AlbllMAX? IIXGibco 公司)、1%N_2添加劑(Gibco 公司)、1%B_27添加劑(Gibco公司)、l%GlutalVIAXK'添加劑(Gibco 公司)、()? ImM & -巰基乙醇(Gibco 公司)、1000U/mL 白血病抑制因子(Millipore公司)、2 y g/mL強(qiáng)力霉素(Clontech公司)。此外,處理細(xì)胞克隆用的小分子抑制劑H)0325901的工作濃度為0.5 ii M，CHIR99021的工作濃度為3 y M。
[0051]1.3其它細(xì)胞的培養(yǎng)
[0052]293T細(xì)胞用作慢病毒的包裝細(xì)胞系，使用與成纖維細(xì)胞相同的培養(yǎng)基，所有細(xì)胞一直放在37°C、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0053]實(shí)施例2.病毒載體感染豬ADSCs
[0054]根據(jù)實(shí)施例1所述的方法，在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接種低代次的豬ADSCs，37°C、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)至匯合度達(dá)80~90%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco公司)于37°C消化為單細(xì)胞懸液后，用收集的病毒上清液感染I X IO5個ADSCs，感染復(fù)數(shù)(MOI)為3(所用病毒的滴度為5~IOX 106IU/mL，攜帶多能性因子cDNA的四種病毒按1:1:1:1混合)，然后接種到6孔培養(yǎng)板中，繼續(xù)在37°C、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。所述病毒上清液是通過用包含人0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的cDNA的藥物可誘導(dǎo)(RevTet-On)型慢病毒表達(dá)載體(SiDanSai公司)按常規(guī)方法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞(Fugene HD, Roche公司)獲得的(參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，J.Sambrook等人編著(2008))。
[0055]實(shí)施例3.感染細(xì)胞的繼續(xù)培養(yǎng)和克隆篩選
[0056]在感染后的第2天，使用DPBS緩沖液清洗培養(yǎng)孔兩次，再將感染后的ADSCs用
0.25 %胰蛋白酶-EDTA (Gibco公司)于37 °C消化為單細(xì)胞懸液后，按2，500個細(xì)胞/cm2的密度接種到新的6孔培養(yǎng)板中，共接種4個培養(yǎng)孔，培養(yǎng)板皿面預(yù)先包被基質(zhì)膠(BDPharmingen公司),繼續(xù)使用ADSCs完全培養(yǎng)基。這里4個板孔的平行樣中，I個板孔用于堿性磷酸酶(AP)染色(SiDanSai公司)，統(tǒng)計(jì)陽性克隆數(shù)，另3個板孔用于克隆挑選，實(shí)驗(yàn)重復(fù)了三次。在感染后的第3天，將ADSCs完全培養(yǎng)基更換為實(shí)施例1中所述的豬iPSCs無血清完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在37°C、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至第5天左右，會有典型的細(xì)胞集落出現(xiàn)，約第6~8天出現(xiàn)ESCs樣細(xì)胞克隆后，在豬iPSCs無血清完全培養(yǎng)基中添加0.5 ii M的MEK信號通路抑制劑PD0325901與3 y M的GSK3信號通路抑制劑CHIR99021，處理重編程過程中的細(xì)胞。
[0057]需要特別指出的是，感染后的ADSCs以過高或者過低的密度接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，以及過早或者過晚添加PD0 325901和CHIR99021，還包括僅僅使用其中的一個小分子抑制劑，豬iPSCs陽性克隆的形成率均會大大降低。
[0058]培養(yǎng)至第10天左右，將用于克隆挑選的3個板孔，使用玻璃針分割邊緣光滑、細(xì)胞核清晰、形態(tài)緊致的典型ESCs樣的單個克隆，然后用玻璃管吸取這些分割開的克隆按一式兩樣接種到兩塊96孔培養(yǎng)板對應(yīng)的孔中，每個孔接種一個克隆，培養(yǎng)板皿面預(yù)先用小鼠胎兒成纖維細(xì)胞制備的飼養(yǎng)層細(xì)胞包被，37°C、5% CO2的常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。在96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)約一周后，選取其中的一塊培養(yǎng)板進(jìn)行AP染色。將AP陽性的克隆使用TryPLEExpress (Gibco公司)于37°C消化為單細(xì)胞懸液后，按1:6-12的比例傳代，依次從96孔、24孔、12孔培養(yǎng)板，向6孔培養(yǎng)板擴(kuò)增。在這些iPSCs候選克隆中，我們選擇了 2個做進(jìn)一步的鑒定。
[0059]未進(jìn)行克隆挑取的那I個6孔培養(yǎng)板板孔，直接進(jìn)行AP染色，依據(jù)克隆形態(tài)及AP染色結(jié)果對典型ESCs的克隆計(jì)數(shù)(使用單鏡頭反光照相機(jī)在微距下拍照，然后用“ImageJ”軟件統(tǒng)計(jì))，計(jì)算誘導(dǎo)效率公式:誘導(dǎo)效率=AP陽性克隆數(shù)量+被感染細(xì)胞數(shù)量X 100%。經(jīng)試驗(yàn)重復(fù)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，接種2.5X IO4個感染后的豬ADSCs，能夠形成382個AP陽性克隆，即我們這種方法總體的效率為大約1.53%，與同期設(shè)置的對照組成纖維細(xì)胞約0.25%的效率相比超過6倍。
[0060]實(shí)施例4.Real-Time PCR鑒定豬iPSCs克隆中多能性基因的表達(dá)水平
[0061]使用RNeasy MiniCQIAGEN公司)試劑盒，按照制造商說明提取豬iPSCs總RNA ;用QuantiTect Reverse Transcription (QIAGEN 公司)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，并使用 FastStartSYBR Green Master (Rox)試劑盒(Roche 公司)，StepOnePlus 突光定量 PCR 儀(AppliedBiosystems公司)進(jìn)行Real-Time PCR0所有上述PCR條件均使用常規(guī)PCR條件，按照制造商說明進(jìn)行。[0062]使用本申請的方法獲得的豬iPSCs克隆中，不僅內(nèi)源性的0ct4、Sox2、Nanog、Dnmt3b、Tert基因被激活，與細(xì)胞重編程程度關(guān)聯(lián)的Lin28、Esrrb、Utf l、Dppa5基因也充分上調(diào)表達(dá)，而這些多能性因子在未經(jīng)誘導(dǎo)重編程的ADSCs中均沒有可檢測到的表達(dá)或較低表達(dá)。
[0063]實(shí)施例5.蛋白免疫熒光染色鑒定豬iPSCs克隆中ESCs標(biāo)記物的表達(dá)
[0064]DPBS緩沖液洗滌培養(yǎng)2~3天的豬iPSCs克隆后，使用4%多聚甲醛(Solarbio公司)固定；使用0.5%Triton X-1OO (Solarbio公司)通透細(xì)胞(限核內(nèi)標(biāo)記物檢測),然后用含1%BSA (Sigma公司)的DPBS緩沖液封閉處理；期間反復(fù)洗滌后，依次加入一抗(抗0ct4和Nanog的抗體購自Abcam公司、抗Sox2的抗體購自Cell Signaling公司、抗SSEA-3和SSEA-4 的抗體購自 Developmental Studies Hybridoma Bank 公司)、二抗(Alexa Fluor594購自Molecular Probes公司)孵育；最后用DAPI染料(Sigma公司)定位細(xì)胞核，使用常規(guī)的熒光顯微鏡觀察。結(jié)果顯示豬iPSCs克隆高表達(dá)ESCs標(biāo)記物0ct4、Sox2、Nanog、SSEA3和SSEA4蛋白。
[0065]實(shí)施例6.鑒定豬iPSCs克隆在體內(nèi)分化形成三個胚層組織結(jié)構(gòu)的能力
[0066]為確認(rèn)所檢測豬iPSCs克隆是否具有長期維持細(xì)胞多向分化潛能的特性，我們基于傳代10代次以上的細(xì)胞來進(jìn)行的畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)。
[0067]將豬iPSCs克隆使用TryPLE Express于37°C消化為單細(xì)胞懸液后，重新接種到新的培養(yǎng)皿中，置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱靜置45分鐘，取上層未貼壁的細(xì)胞(飼養(yǎng)層細(xì)胞貼壁快，故可將飼養(yǎng)層細(xì)胞與豬iPSCs分離)；計(jì)數(shù)，取500萬豬iPSCs單細(xì)胞懸浮于300 ii L含15% KnockOut? SR的DMEM/F-12中，對N0D/SCID先天性免疫缺陷小鼠進(jìn)行后腿根部肌肉無菌注射；小鼠注射后，置于SPF級層流間中飼養(yǎng)，期間不停飼喂2mg/mL的強(qiáng)力霉素(溶解于無菌蔗糖溶液)，約3~5天換次水，逐漸有米粒大小的硬塊長出，待瘤塊長大到可以取后將藥物撤掉；撤藥后正常喂養(yǎng)3~4周，用眼科剪、手術(shù)鑷將畸胎瘤取出，固定在4%多聚甲醛中；固定后的畸胎瘤，經(jīng)石蠟包埋、切片，以及蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin)染色觀察畸胎瘤分化情況。結(jié)果顯示，豬iPSCs成功分化出具有三個胚層的不同類型細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)，如內(nèi)胚層的腸上皮結(jié)構(gòu)、中胚層的脂肪結(jié)構(gòu)以及外胚層的角質(zhì)上皮結(jié)構(gòu)，
[0068]由上結(jié)果進(jìn)一步證明使用本申請的方法能夠高效獲取豬iPSCs，且具有ESCs的特性。
[0069]最后所應(yīng)當(dāng)說明的是， 以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種高效獲取豬誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞的方法，用于將來源于豬的脂肪干細(xì)胞(ADSCs)誘導(dǎo)重編程為誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(iPSCs)，其特征在于，包括如下步驟: (1)將多能性因子的cDNA導(dǎo)入ADSCs，其中所述的多能性因子為0ct4、Sox2、Klf4、c-Myc基因； (2)在無飼養(yǎng)層體系中，使用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟(1)得到的ADSCs； (3)出現(xiàn)胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞克隆后，在所述培養(yǎng)基中添加MEK信號通路抑制劑與GSK3信號通路抑制劑，繼續(xù)培養(yǎng)3天，再挑取細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)；以及 (4)鑒定細(xì)胞克隆的多能性，包括檢測細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、內(nèi)源多能性基因的表達(dá)、胚胎干細(xì)胞(ESCs)標(biāo)記物的表達(dá)、體內(nèi)分化形成畸胎瘤的能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(1)中多能性因子的cDNA通過病毒載體導(dǎo)入所述ADSCs。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述病毒載體為慢病毒載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述慢病毒載體為藥物可誘導(dǎo)的RevTet-On型表達(dá)載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的無飼養(yǎng)層體系需要在培養(yǎng)皿上預(yù)先包被基質(zhì)膠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，所述無血清培養(yǎng)基中加入代血清添加劑，優(yōu)選是15% (體積百分比)血清替代物或5mg/mL高脂牛血清白蛋白。`
7.根據(jù)權(quán)利要求1或6的方法，其特征在于，所述無血清培養(yǎng)基還包含:40%DMEM/F-12培養(yǎng)基、40% Neurobasal?培養(yǎng)基、l%N-2添加劑、l%B-27添加劑、1% GlutaMAX?添加劑、0.1禮3-巰基乙醇、100(^/1^白血病抑制因子、g/mL強(qiáng)力霉素。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述白血病抑制因子為小鼠來源的。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中培養(yǎng)的ADSCs是以2，500個細(xì)胞/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿上。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中MEK信號通路抑制劑的工作濃度為0.5 ii M ;所述GSK3信號通路抑制劑的工作濃度為3 u M。
【文檔編號】C12N5/10GK103667349SQ201310576436
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月15日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月15日
【發(fā)明者】張運(yùn)海, 張宇, 魏超, 章孝榮 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)