G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于：來源于真核生物，其中，所述G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白選自APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白；或RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白；或DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白。本發(fā)明涉及的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，通過把這些融合表達(dá)蛋白與G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行融合表達(dá)從而達(dá)到增加G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)產(chǎn)率及G蛋白偶聯(lián)受體的體外穩(wěn)定性，本發(fā)明所涉及的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白可廣泛應(yīng)用于G蛋白偶聯(lián)受體的研究。
【專利說明】G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地是涉及G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白。
【背景技術(shù)】
[0002]G蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR)是一大類膜蛋白受體的統(tǒng)稱，這類受體的共同點(diǎn)是每個(gè)受體結(jié)構(gòu)都包含七個(gè)α螺旋組成的跨膜結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)⑹荏w分割為膜外N端(N-terminus),膜內(nèi)C端(C-terminus), 3個(gè)膜外環(huán)(Loop)和3個(gè)膜內(nèi)環(huán)，受體的膜外部分常有糖基化修飾位點(diǎn)，其肽鏈的C端和連接第5和第6個(gè)跨膜螺旋的胞內(nèi)環(huán)上共同構(gòu)成G蛋白(鳥苷酸結(jié)合蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)受體已超過800個(gè)，這些G蛋白偶聯(lián)受體可以被劃分為六個(gè)類型，分別為.Λ類(或第一類)
(視紫紅質(zhì)樣受體)；B類(或第二類)(分泌素受體家族)；C類(或第三類)(代謝型谷氨酸受體)；D類(或第四類)(真菌交配信息素受體)；E類(或第五類)(環(huán)腺苷酸受體)；F類(或第六類)(Frizzled/Smoothened 家族)[Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.63 (6):1256-1272，2003;and Friedricksson et al.Mol.Pharmacol.67(5):1414-1425，2005]。分屬其中的G蛋白偶聯(lián)受體的基因序列之間沒有同源關(guān)系。
[0003]不同的G蛋白偶聯(lián)受體通過和相應(yīng)的G蛋白(G protein)偶聯(lián)可以對細(xì)胞外的多種刺激信號(hào)作出反應(yīng)，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生神經(jīng)傳遞、味覺、嗅覺、視覺及細(xì)胞的新陳代謝、分化、增殖、分泌等一 系列生理效應(yīng)。
[0004]與G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)的疾病為數(shù)眾多，并且大約40%的現(xiàn)代藥物都以G蛋白偶聯(lián)受體作為Μ，上千種已上市藥物中接近一半是針對G蛋白偶聯(lián)受體靶標(biāo)，作用于G蛋白偶聯(lián)受體的藥物對疼痛、認(rèn)知障礙、高血壓、胃潰瘍、鼻炎、哮喘等各類疾病均有良好的治療作用。
[0005]由于G蛋白偶聯(lián)受體在體內(nèi)具有重要的生理功能，對G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)構(gòu)和功能研究一直是一個(gè)很重要的研究熱點(diǎn)。
[0006]然而，天然的G蛋白偶聯(lián)受體在體外并不穩(wěn)定，很難得到高純度的穩(wěn)定的天然G蛋白偶聯(lián)受體，近年來，有多個(gè)研究小組報(bào)道了不同的方法用于解決G蛋白偶聯(lián)受體的穩(wěn)定性，包括①.在G蛋白偶聯(lián)受體的膜內(nèi)環(huán)區(qū)3(ICL3)和N-末端插入大腸桿菌T4溶菌酶，這種技術(shù)先后成功應(yīng)用于腺苷A2a受體，CXCR4受體，b2腎上腺素能受體，D3多巴胺受體，SlPl受體等多個(gè)受體的研究中，通過用T4溶菌酶改造后，這些受體都能夠被很好地表達(dá)，得到了較高產(chǎn)率的蛋白，并最終得到了高分辨率的晶體結(jié)構(gòu)[Rasmussen，S.G.F.et.al.Crystal structure of the human beta2adrenergic G-protein-coupled receptor, Nature450:383-387, 2007;Wu B.et.al.Structures of the CXCR4chemokine GPCRwith small-molecule and cyclic peptide antagonists Science330:1066—1071，2010.ChienjE.Y.et.al.Structure of the human dopamine D3receptor in complex witha D2/D3selective antagonist,Science330:1091-1095，2010.XujF et.al.Structureof an agonist-bound human A2A adenosine receptor，Science332:322-327，201Land Hanson, M.A.et.al.Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptorScience335:851-855, 2012.ZoujY.et.al.N-terminal T41ysozyme fusion facilitatescrystallization of a G protein coupled receptor Plos One7:e46039_e460392012]；②.在G蛋白偶聯(lián)受體的膜內(nèi)環(huán)區(qū)3(ICL3)或N-末端插入細(xì)菌BriL蛋白，這種技術(shù)在腺苷A2a受體，nociceptin/orphanin FQ受體，5HTlb, 5HT2b和SMO受體的結(jié)晶研究中獲得了成功[Liu, W.et.al.Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodiumions, Science337:232-236, 2012.Thompson, A.A.et.al.Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic Nature485:395-399, 2012.Wang, C.et.al.Structural Basis for Molecular Recognition at Serotonin ReceptorsScience2013.Wang, C.Structure of the human smoothened7TM receptor in complexwith an anti tumor agent Nature2013] !③.通過對G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行突變篩選，找到不影響結(jié)構(gòu)和功能但又能增加穩(wěn)定性的一些突變，從而在表達(dá)過程中得到穩(wěn)定的G蛋白偶聯(lián)受體，這個(gè)方法在腺苷A2a受體，bl腎上腺素能受體的研究中均獲得了成功，實(shí)現(xiàn)了受體蛋白的高表達(dá)，拿到了高純度的受體蛋白，并最終獲得了受體蛋白的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)[Lebon, G.et.al.Agonist-bound adenosine A2A receptor structures revealcommon features of GPCR activation.Nature474:521, 2011.ffarne, A.et.al.Structureof a betal-adrenergic G-prote in-coup led receptor Nature454:486, 2008.]。④.利用抗體穩(wěn)定G蛋白偶 聯(lián)受體構(gòu)象，利用這個(gè)技術(shù)斯坦福大學(xué)的Brain實(shí)驗(yàn)室成功得到了 b2腎上腺素能受體的高分辨晶體結(jié)構(gòu)[Bokoch, Μ.P.Ligand-specific regulation of theextracellular surface of a G-protein-coupled receptor Nature463:108-112，2010]。
[0007]由上可知，采用插入其它蛋白的方法來增加G蛋白偶聯(lián)受體的穩(wěn)定性的研究目前都集中在應(yīng)用原核蛋白和受體進(jìn)行融合表達(dá)，而沒有人研究來源于真核細(xì)胞蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)。實(shí)際上，G蛋白偶聯(lián)受體基本都存在于真核生物中，因此，如果能夠找到一些來源于真核生物的蛋白來穩(wěn)定G蛋白偶聯(lián)受體或許對于G蛋白偶聯(lián)受體的某些功能研究具有一些額外的幫助。
[0008]另外，目前所廣泛應(yīng)用的融合表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的思路是嘗試使用不同的融合蛋白和G蛋白偶聯(lián)受體融合，最后篩選得到一個(gè)能夠較好表達(dá)G蛋白偶聯(lián)受體的蛋白，目前常用的幾種融合蛋白如BriI和T4L蛋白等能較好的解決一些G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)，但對有些G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)則幫助不大，需要探索新的融合蛋白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了幾種新型的融合蛋白，可以被應(yīng)用于G蛋白偶聯(lián)受體的表達(dá)，從而，為G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)提供了更多的選擇和嘗試的方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種來源于真核細(xì)胞的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，即:APC、RGS16和DNJ蛋白片段及其成功的應(yīng)用于和G蛋白偶聯(lián)受體的融合表達(dá)。
[0011]本發(fā)明提供的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:來源于真核生物，具體為APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白、RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白、DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白中的一種。
[0012]其中，APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQID N0.1所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.4所示。
[0013]RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.2所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所示。
[0014]DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDN0.3所示，蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0015]在本發(fā)明中，為了提高G蛋白偶聯(lián)受體穩(wěn)定性，通過對G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行改造，在其N-末端，C-末端或膜內(nèi)環(huán)區(qū)3插入APC，RGS16和DNJ等蛋白片段片段構(gòu)建融合蛋白，從而解決了 G蛋白偶聯(lián)受體穩(wěn)定性的問題。
[0016]針對本發(fā)明主要涉及的三種蛋白片段，在本發(fā)明中，采用腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所不。
[0017]采用腺苷A2a蛋白與RGS16蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
[0018]還采用腺苷A2a蛋白與DNJ蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
[0019]其中，上述如SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被應(yīng)用于A2a腺苷蛋白的表達(dá)。
[0020]上述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12所示的基因序列可被構(gòu)建到表達(dá)載體pFastBacl、PcDNA3.l、PET21b中進(jìn)行A2a腺苷蛋白的表達(dá)。
[0021]值得指出的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含APC, RGS16和DNJ等蛋白片段的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)質(zhì)粒，這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等，所構(gòu)建的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)基因序列可以有效地連接到不同表達(dá)載體的適當(dāng)啟動(dòng)子上，以指導(dǎo)mRNA合成。
[0022]另外，上述構(gòu)建好的質(zhì)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化到細(xì)胞，如可以用Bac-to-Bac技術(shù)把含融合表達(dá)基因的PFastBac載體轉(zhuǎn)化到SF9細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的培養(yǎng)和病毒的收集和傳代等方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)。
[0023]此外，本發(fā)明構(gòu)建的融合蛋白既可以在昆蟲細(xì)胞如SF9、SF21、HiFive中表達(dá)，還可以在酵母中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞如:293，CHO等細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，具有廣泛的應(yīng)用范圍。
[0024]發(fā)明的作用與效果
[0025]本發(fā)明提供了三種來源于真核生物的G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白(SP、APC, RGS16和DNJ蛋白片段)，并進(jìn)一步的提供這些真核生物蛋白的氨基酸序列和基因編碼序列等信息。
[0026]另外，本發(fā)明提供上述新型G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白在A2a腺苷受體的應(yīng)用，即、把上述APC，RGS16和DNJ等蛋白片段插入到G蛋白偶聯(lián)受體的不同區(qū)域(N-末端，C-末端或者膜內(nèi)環(huán) 3)構(gòu)建融合蛋白，并提供這些融合白的氨基酸序列和基因編碼序列等信肩、O
[0027]本發(fā)明通過把這些新型融合表達(dá)蛋白與G蛋白偶聯(lián)受體進(jìn)行融合表達(dá)，從而達(dá)到增加G蛋白偶聯(lián)受體表達(dá)產(chǎn)率及G蛋白偶聯(lián)受體的體外穩(wěn)定性。[0028]此外，本發(fā)明所涉及的新型G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白可廣泛應(yīng)用于G蛋白偶聯(lián)受體的研究。在本發(fā)明中，構(gòu)建了一個(gè)A2a腺苷受體融合表達(dá)質(zhì)粒并提供了該融合表達(dá)質(zhì)粒在昆蟲SF9細(xì)胞中表達(dá)的方法。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]附圖1a為A2a_APC融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0030]附圖1b為A2a_RGS16融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0031 ]附圖1c為A2a_DNJ融合蛋白純化后的電泳檢測圖；
[0032]附圖2a為A2a_APC融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果；
[0033]附圖2b為A2a_RGS16融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果；
[0034]附圖2c為融合蛋白在底物Adenosine存在時(shí)的熱穩(wěn)定性檢測結(jié)果；
[0035]附圖3a為A2a_APC融合蛋白的UPLC檢測圖譜；
[0036]附圖3b為A2a_RGS16融合蛋白的UPLC檢測圖譜；
[0037]附圖3c為A2a_DNJ融合蛋白的UPLC檢測圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0038]實(shí)施例1:融合蛋白的基因合成
[0039]化學(xué)合成
[0040] (I)、APC蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.4所示。
[0041 ] (5 ’ TCCACCGGCTACCTGGAGGAGCTGGAGAAGGAGCGCTCCCTGCTGCTGGCCGACCTGGACAAGGAGGAGAAGGAGAAGGACTGGTACTACGCCCAGCTGCAGAACCTGACCAAGCGCATCGACTCCCTGCCCCTGACCGAGAACTTCTCCCTGCAGACCGACATGACCCGCCGCCAGCTGGAGTACGAGGCCCGCCAGATCCGCGTGGCCATGGAGGAGCAGCTGGGCACCTGCCAGGACATGGAGAAGCGCGCCCAGCGCCGCATCGCCCGCATCCAGCAGATCGAGAAGGACATCCTGCGCATCCGCCAG3’)，
[0042]正向引物為:(5’ TTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGTCCACCGGCTACCTGGAGG3，)，
[0043]反向引物為:(5’ CAGTGTGGACCGTGCCCGCTCCTGGCGGATGCGCAGGATGT3，)，
[0044]用PCR反應(yīng)獲得APC蛋白片段基因。
[0045]參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0046]正向引物(5，TATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGCGCCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0047]反向引物(5’ CCTCCAGGTAGCCGGTGGACAGCTGTCGTCGCGCCG3，)，
[0048]用PCR反應(yīng)獲得基因A2a (2-208)。
[0049]正向引物(5，GAGCGGGCACGGTCCACACT3’ )， [0050]反向引物(5’ TTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3 ’ )，
[0051]用PCR 反應(yīng)獲得基因 A2a (219-316)。
[0052]A2a (2-208) _APC_A2a (219-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。
[0053](2)、RGS16蛋白片段，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.5所示。
[0054](5，AACTTCTCCGAGGACGTGCTGGGCTGGCGCGAGTCCTTCGACCTGCTGCTGTCCTCCAAGAACGGCGTGGCCGCCTTCCACGCCTTCCTGAAGACCGAGTTCTCCGAGGAGAACCTGGAGTTCTGGCTGGCCTGCGAGGAGTTCAAGAAGATCCGCTCCGCCACCAAGCTGGCCTCCCGCGCCCACCAGATCTTCGAGGAGTTCATCTGCTCCGAGGCCCCCAAGGAGGTGAACATCGACCACGAGACCCACGAGCTGACCCGCATGAACCTGCAGACCGCCACCGCCACCTGCTTCGACGCCGCCCAGGGCAAGACCCGCACCCTGATGGAGAAGGACTCCTACCCCCGCTTCCTGAAGTCCCCCGCCTACCGCGACCTGGCCGCCCAGGCCTCCGCCGCCTCC3，),
[0055]正向引物為:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCAACTTCTCCGAGGACGTGCT3’)，
[0056]反向引物為:(5’ ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGGAGGCGGCGGAGGCCTG3，)，
[0057]用PCR反應(yīng)獲得RGS16蛋白片段基因。
[0058]參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0059]正向引物(5’ CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0060]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0061]用PCR反應(yīng)獲得基因A2a (2-316)。
[0062]RGS16 (54-188) _A2a (2-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。
[0063](3)、DNJ蛋白片段其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示，其核苷酸模板如SEQ IDN0.6所示。
[0064](5，GGCTACTACGACGTGCTGGGCGTGAAGCCCGACGCCTCCGACAACGAGCTGAAGAAGGCCTACCGCAAGATGGCCCTGAAGTTCCACCCCGACAAGAACCCCGACGGCGCCGAGCAGTTCAAGCAGATCTCCCAGGCCTACGAGGTGCTGTCCGACGAGAAGAAGCGCCAGATCTACGACCAGGGCGGC3，)，
[0065]正向引物為:(5，GAGAACCTGTACTTCCAATCCGGCTACTACGACGTGCTGG3’)，
[0066]反向引物為:(5，ACACCGAGGAGCCCATGATGGGGCCGCCCTGGTCGTAGATC3，)，
[0067]用PCR反應(yīng)獲得DNJ蛋白基因。
[0068]參考人類基因密碼子，化學(xué)合成A2a核苷酸模板(5’ATGAAAACCATTATTGCGCTGAGCTATATTTTTTGCCTGGTGTTTGCGGATTATAAAGATGATGATGATGGCGCGCCGCCCATCATGGGCTCCTCGGTGTACATCACGGTGGAGCTGGCCATTGCTGTGCTGGCCATCCTGGGCAATGTGCTGGTGTGCTGGGCCGTGTGGCTCAACAGCAACCTGCAGAACGTCACCAACTACTTTGTGGTGTCACTGGCGGCGGCCGACATCGCAGTGGGTGTGCTCGCCATCCCCTTTGCCATCACCATCAGCACCGGGTTCTGCGCTGCCTGCCACGGCTGCCTCTTCATTGCCTGCTTCGTCCTGGTCCTCACGCAGAGCTCCATCTTCAGTCTCCTGGCCATCGCCATTGACCGCTACATTGCCATCCGCATCCCGCTCCGGTACAATGGCTTGGTGACCGGCACGAGGGCTAAGGGCATCATTGCCATCTGCTGGGTGCTGTCGTTTGCCATCGGCCTGACTCCCATGCTAGGTTGGAACAACTGCGGTCAGCCAAAGGAGGGCAAGAACCACTCCCAGGGCTGCGGGGAGGGCCAAGTGGCCTGTCTCTTTGAGGATGTGGTCCCCATGAACTACATGGTGTACTTCAACTTCTTTGCCTGTGTGCTGGTGCCCCTGCTGCTCATGCTGGGTGTCTATTTGCGGATCTTCCTGGCGGCGCGACGACAGCTGGCTGATCTGGAAGACAATTGGGAAACTCTGAACGACAATCTCAAGGTGATCGAGAAGGCTGACAATGCTGCACAAGTCAAAGACGCTCTGACCAAGATGAGGGCAGCAGCCCTGGACGCTCAGAAGGCCACTCCACCTAAGCTCGAGGACAAGAGCCCAGATAGCCCTGAAATGAAAGACTTTCGGCATGGATTCGACATTCTGGTGGGACAGATTGATGATGCACTCAAGCTGGCCAATGAAGGGAAAGTCAAGGAAGCACAAGCAGCCGCTGAGCAGCTGAAGACCACCCGGAATGCATACATTCAGAAGTACCTGGAACGTGCACGGTCCACACTGCAGAAGGAGGTCCATGCTGCCAAGTCACTGGCCATCATTGTGGGGCTCTTTGCCCTCTGCTGGCTGCCCCTACACATCATCAACTGCTTCACTTTCTTCTGCCCCGACTGCAGCCACGCCCCTCTCTGGCTCATGTACCTGGCCATCGTCCTCTCCCACACCAATTCGGTTGTGAATCCCTTCATCTACGCCTACCGTATCCGCGAGTTCCGCCAGACCTTCCGCAAGATCATTCGCAGCCACGTCCTGAGGCAGCAAGAACCTTTCAAGGCACATCATCATCACCATCACCACCATCACCATTAA3，)，
[0069]正向引物(5，CCCATCATGGGCTCCTCGGT3，)，
[0070]反向引物(5，TTGGTACCGCATGCCTCGAGTTAATGGTGATGGTGGTGATGGTGATGATGATGTGCCTT3，)，
[0071]用PCR反應(yīng)獲得基因A2a (2-316)。
[0072]DNJ (6-68) _A2a (2-316)參照以上原理進(jìn)行基因合成，其中，正向引物引入限制性酶切位點(diǎn)EcoRI，反向引物引入限制性酶切位點(diǎn)XhoI和終止密碼子。
[0073]其中，PCR反應(yīng)條件為:在 50 μ L 反應(yīng)體系中(PCR Buffer, 1.5mM MgS04, 200 μ MdNTPs)加入擴(kuò)增引物各0.2 μ Μ。充分混勻后開始PCR循環(huán):94°C變性5分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，68 °C延伸2分鐘，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后在68°C保溫10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收后用于克隆。
[0074]實(shí)施例2:本發(fā)明融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建
[0075]將實(shí)施例1中獲得的PCR片段與經(jīng)過限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI雙酶切的載體pFastBacl (購自Invitrogen)進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌DH5 α中，體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞的10%，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物，冰浴30分鐘，將管放入42°C水浴，定時(shí)60秒熱休克，快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴120秒，使細(xì)胞冷卻，每管加入400 μ I LB培養(yǎng)基，37°C緩搖60分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因，低速離心2分鐘，去上清，留約100 μ I培養(yǎng)基在離心管內(nèi)，重懸菌體，用玻璃鋪菌器將菌液在瓊脂板上鋪勻。將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱，12-16小時(shí)后可出現(xiàn)菌落。涂板后挑取陽性克隆進(jìn)行鑒定。
[0076] 實(shí)施例3:本發(fā)明融合蛋白的表達(dá)
[0077]將實(shí)施例2中獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DHlOBac E.coli感受態(tài)細(xì)胞中，體積不應(yīng)該超過感受態(tài)細(xì)胞的5%，輕輕旋轉(zhuǎn)幾次混勻內(nèi)容物。冰浴30分鐘；將管放入42°C水浴，定時(shí)90秒熱休克；快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴120秒，使細(xì)胞冷卻；每管加入800ulLB培養(yǎng)基，37°C，緩搖4小時(shí)，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素標(biāo)記基因；用玻璃鋪菌器將30ul菌液在抗性瓊脂板上鋪勻；將平板倒置于37°C恒溫培養(yǎng)箱中，30-48小時(shí)后可出現(xiàn)藍(lán)白斑菌落；挑取陽性白斑單菌落接入5ml抗性LB，緩搖12-16h，取菌液進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示桿粒重組正確。將重組桿粒經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到昆蟲細(xì)胞中，4-5天后收取細(xì)胞上清液作為第一代桿狀病毒。用第一代桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞72小時(shí)后，獲得第二代病毒，用于組合多肽的表達(dá)；使用第二代病毒1:100體積比感染密度為2xl0~6/ml的昆蟲細(xì)胞sf9，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后，離心收細(xì)胞，PBS洗一遍細(xì)胞。
[0078]實(shí)施例4:融合蛋白純化
[0079]用200ml 預(yù)冷的裂解液(IOmM HEPES ρΗ7.5，IOmM MgC12, 20mMKCl)重懸 IL 細(xì)胞到200ml中，用勻漿器在冰上進(jìn)行勻漿，勻漿后用超速離心機(jī)離心45分鐘，去掉上清，重復(fù)洗滌步驟3次，再用高鹽溶液重復(fù)洗滌步驟三次，提取好的細(xì)胞膜用加甘油的裂解液溶解并用液氮進(jìn)行速凍，儲(chǔ)存在-80C冰箱。在冰上融化解凍細(xì)胞膜，并入茶堿和碘乙酰胺分別至終濃度為4mM，2mg/ml，在冰上放置30分鐘后按照每升細(xì)胞膜加入100mL溶膜緩沖液比例加入溶膜緩沖液，并繼續(xù)在冰上放置3小時(shí)溶膜，用超速離心機(jī)在160，OOOg離心力下離心40分鐘，棄掉沉淀，上清與Iml用平衡緩沖液平衡好的Talon IMAC resin 一起孵育過夜，次日，棄上清，加入適量平衡緩沖液重懸填料，將填料轉(zhuǎn)移到自流柱里。依次用沖洗緩沖液I (25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;0.05%DDM;0.001%CHS;4mM theophylline)洗 10 個(gè)柱體積，沖洗緩沖液 2 (25mMHepes pH7.5; 800mMNaCl; 10%glycerol; 4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;25mM Imid; IOmM MgCl2;8mM ATP)洗 10 個(gè)柱體積，沖洗緩沖液3(25mMHepes pH7.5;800mMNaCl;10%glycerol;4mM theophylline;0.05%DDM;0.001%CHS;IOmM MgC12;10mM ATP)洗5個(gè)柱體積，然后用5個(gè)柱體積的洗脫緩(緩沖液I加入300mM咪唑)沖液洗脫目的蛋白，純化后得到的目的蛋白保存在-80°C，圖1為三種融合蛋白的電泳檢測結(jié)果。
[0080]從得率來看，經(jīng)純化后3種膜蛋白的得率都超過lmg/L細(xì)胞，具有較高的產(chǎn)率。 [0081]實(shí)施例5:融合蛋白熱穩(wěn)定性測試
[0082]打開Cary Eclipse熒光分光光度計(jì)，預(yù)熱30分鐘，吸取130ul蛋白溶液，加入
0.13ul的CPM熒光染料，充分混勻，將混勻好的樣品，加入到石英比色皿，放入樣品架。啟動(dòng)Cary Eclipse軟件組中的Thermal程序,設(shè)置激發(fā)波長(387nm),光柵縫隙為2.5nm;吸收波長(463nm)，光柵縫隙為5nm，從20°C至90°C每分鐘上升1°C，運(yùn)行程序，導(dǎo)出測量數(shù)據(jù)，用軟件進(jìn)行Sigmanoid擬合,計(jì)算樣品的Tm值。
[0083]按照上述步驟方法，分別檢測了三種融合蛋白在和A2a腺苷受體相結(jié)合之后的熱穩(wěn)定性值，其結(jié)果如圖2所示。
[0084]由圖可知，A2a-APC融合蛋白，其Tm值為50.8 °C ;A2a_RGS16融合蛋白，其Tm值為55.60C ;A2a-DNJ 融合蛋白，其 Tm 值為 52。。。
[0085]3個(gè)融合蛋白和A2a腺苷受體相結(jié)合以后的熱穩(wěn)定性值都超過了 50°C，說明三種蛋白都具有較好的熱穩(wěn)定性。
[0086]實(shí)施例6:融合蛋白均一性檢測
[0087]采用Waters公司的Acquity H-Class Bio UPLC系統(tǒng)進(jìn)行檢測,檢測所用柱子為Sepax SEC250 分子篩柱，上樣前先用平衡緩沖液(25mM HEPES, 500mM NaCl, 2%glycerol, 0.05DDM, 0.0P/oCHS, pH7.5)洗柱子至基線沒有太大變化止，然后將待檢測的樣品加入專用的96孔板中上樣，積分處理采用儀器自帶的軟件。
[0088]按照上述方法對三種融合蛋白分別進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3所示，三種融合蛋白均一性都很好，能夠檢測到融合蛋白單體峰，且單體占蛋白樣品的大部分。
【權(quán)利要求】
1.一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:來源于真核生物， 其中，所述G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白選自APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白； 或RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白； 或DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述APC蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利要求2所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.4所示。
4.如權(quán)利要求2所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。
5.如權(quán)利要求2所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述APC蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.10所示。
6.如權(quán)利要求1所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述RGS16蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
7.如權(quán)利要求6所述 的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.5所不。
8.如權(quán)利要求6所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述RGS16蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.8所示。
9.如權(quán)利要求6所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述RGS16蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.11所示。
10.如權(quán)利要求1所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述DNJ蛋白片段或與該片段序列同源性大于90%的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
11.如權(quán)利要求10所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述蛋白片段的編碼基因序列如SEQ ID N0.6所示。
12.如權(quán)利要求10所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述DNJ蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.9所示。
13.如權(quán)利要求10所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:腺苷A2a蛋白與所述DNJ蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，所得到的融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0.12所示。
14.如權(quán)利要求1-13任一所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:在G蛋白偶聯(lián)受體的N-末端、C-末端或膜內(nèi)環(huán)區(qū)3插入所述APC、RGS16或DNJ蛋白片段構(gòu)建融合蛋白。
15.如權(quán)利要求14所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述融合蛋白可以在昆蟲細(xì)胞中、酵母細(xì)胞中和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。
16.如權(quán)利要求4或8或12任一所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.7,SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9所示的氨基酸序列可被應(yīng)用于A2a腺苷蛋白的表達(dá)。
17.如權(quán)利要求5或9或13任一所述的一種G蛋白偶聯(lián)受體融合表達(dá)蛋白，其特征在于:所述如SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11、SEQ ID N0.12所示的基因序列可被構(gòu)建到表達(dá)載體pFastBacl、 PcDNA3.l、PET21b中進(jìn)行A2a腺苷蛋白的表達(dá)。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK104017082SQ201310577289
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】蔡建華, 沈堅(jiān), 姜帆, 李娜, 魏文韜, 曾秀紅, 蘇曉燕, 韓敏, 任德林, 毛晨 申請人:維亞生物科技(上海)有限公司