一種低溫纖維素酶及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種纖維素酶突變體，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3。本發(fā)明的纖維素酶突變體最適作用溫度為50℃，且在40℃條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活，而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55℃，在40℃條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力；本發(fā)明的纖維素酶突變體的最適作用pH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內(nèi)均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內(nèi)維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的pH適應(yīng)范圍更加寬泛，具有更大的應(yīng)用空間。
【專利說(shuō)明】一種低溫纖維素酶及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種低溫纖維素酶及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]纖維素酶，是一種復(fù)合酶，是由多種水解酶組成的一個(gè)復(fù)雜酶系，習(xí)慣上將纖維素酶分成三類(lèi):內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β_葡萄糖苷酶。纖維素酶是在工業(yè)中應(yīng)用最廣泛的酶之一，一般應(yīng)用于紡織工業(yè)、去污劑工業(yè)、紙漿和造紙工業(yè)、飼料和食品工業(yè)(包括烘焙)，以及用于木質(zhì)纖維素材料水解，用于例如生物乙醇生產(chǎn)等。
[0003]纖維素酶可以按照其一級(jí)序列分類(lèi)成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成員的三維結(jié)構(gòu)分析的支持(Henrissat 1991,Henrissat和Bairochl993,1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有內(nèi)切葡聚糖酶。大多數(shù)紡織用酸性纖維素酶屬于家族5，而大多數(shù)紡織用中性纖維素酶為家族12或45。
[0004]大部分工業(yè)用酶通常在高于50°C的條件下才具有較高的催化效率，但是在紡織領(lǐng)域，為了節(jié)省能源，更為了提高織物色彩的牢固性以及減輕衣物的收縮，急需在低溫度水平(低于50°C)下仍具有良 好性能的酶制劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，提供了一種纖維素酶突變體及其重組表達(dá)菌株。本發(fā)明的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活力，可廣泛應(yīng)用于紡織工業(yè)領(lǐng)域，效果顯著。
[0006]本發(fā)明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO:1的纖維素酶第48位氨基酸由Leu變?yōu)镻he，第49位氨基酸由Thr變?yōu)長(zhǎng)ys，第55位氨基酸由Ala變?yōu)镾er，第66位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro，第83位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn，第130位氨基酸由Ile變?yōu)閂al，第144位氨基酸由Gln變?yōu)镠is，第147位氨基酸由Leu變?yōu)镠e，第156位氨基酸由Leu變?yōu)镠e。
[0007]上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID NO:4o
[0008]本發(fā)明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:4的纖維素酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0009]將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入里氏木霉中進(jìn)行重組表達(dá)，獲得的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活。
[0010]本發(fā)明還提供了上述纖維素酶突變體在紡織領(lǐng)域中的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的纖維素酶突變體最適作用溫度為50°C，且在40°C條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活，而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55°C，在40°C條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力；本發(fā)明的纖維素酶突變體的最適作用PH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內(nèi)均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內(nèi)維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的pH適應(yīng)范圍更加寬泛，具有更大的應(yīng)用空間。本發(fā)明的纖維素酶突變體可廣泛應(yīng)用于紡織加工領(lǐng)域，在PH4.0-8.5范圍內(nèi)應(yīng)用，無(wú)需調(diào)酸可直接使用，且效果良好；除毛干凈，對(duì)織物強(qiáng)力損失??；牛仔水洗，起花小，花點(diǎn)較小的批差穩(wěn)定；耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，能大大節(jié)省工時(shí)，減少生產(chǎn)成本。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1:里氏木霉發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指38kD處為重組表達(dá)的纖維素酶；
[0013]圖2:纖維素酶突變體與野生型相對(duì)酶活-溫度曲線圖；
[0014]圖3:纖維素酶突變體與野生型相對(duì)酶活-pH曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]本發(fā)明用到了遺傳工程和分子生物學(xué)領(lǐng)域使用的常規(guī)技術(shù)和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和 CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(AusubeI, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻(xiàn)提供了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發(fā)明限定于所述的任何具體方法、實(shí)驗(yàn)方案和試劑，因?yàn)樗鼈兛梢愿淖儭?br> [0016]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0017]實(shí)施例1:纖維素酶基因的 克隆
[0018]1.1纖維素酶突變體的合成
[0019]為了提高纖維素酶(野生型氨基酸序列為SEQ ID NO:1)在低溫條件下的酶活力，對(duì)該酶的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行了大量的點(diǎn)突變篩選，最終得到了能在低溫條件下仍然保有較高酶活力的低溫纖維素酶(氨基酸序列為SEQ ID N0:3)。這些氨基酸突變點(diǎn)分別是L48F，T49K，A55S，A66P，D83N，I130V，Q144H，L147I，L156I。突變后的序列依照里氏木霉的密碼偏愛(ài)性而優(yōu)化合成，并且在合成序列5’和3’兩端分別加上KpnI和XbaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成，合成后的基因序列為SEQ ID N0:4。
[0020]同時(shí)通過(guò)基因合成的方法得到野生型纖維素酶的基因片段SEQ ID N0:2。
[0021]1.2基因克隆
[0022]合成后的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI (Fermentas)進(jìn)行酶切；同時(shí)，用限制性內(nèi)切酶XbaI和KpnI對(duì)質(zhì)粒pTG進(jìn)行酶切；使用凝膠純化試劑盒將酶切產(chǎn)物純化，并用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個(gè)酶切產(chǎn)物連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節(jié)青霉素進(jìn)行選擇。為確保準(zhǔn)確,對(duì)若干克隆進(jìn)行測(cè)序(Invitrogen)。測(cè)序結(jié)果顯示，突變體纖維素酶的基因序列為SEQ ID NO: 4，其編碼的氨基酸序列為SEQ IDNO: 3，多個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果都一致。
[0023]使用質(zhì)粒中量制備試劑盒(Axygen)從測(cè)序結(jié)果正確的大腸桿菌克隆中純化質(zhì)粒。
[0024]實(shí)施例2 =PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合轉(zhuǎn)化木霉及驗(yàn)證[0025]分別吸取里氏木霉(Trichoderma reesei )菌株孢子懸浮液于PDA平板中心(9cm培養(yǎng)皿)，待菌落長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿，各切IcmX Icm大小的培養(yǎng)基于120mLYEG+U液體培養(yǎng)基中，在30°C、200rpm的條件培養(yǎng)14~16h。
[0026]用無(wú)菌Miracloth濾布收集菌絲體,并用溶液A清洗一次,在無(wú)菌條件下將清洗過(guò)的菌絲體轉(zhuǎn)移到40mL原生質(zhì)體化溶液，在30°C、90rpm的條件下培養(yǎng)I~2h，用顯微鏡觀察檢測(cè)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進(jìn)展。
[0027]用無(wú)菌Miracloth濾布過(guò)濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質(zhì)體溶液。將原生質(zhì)體溶液分裝于兩個(gè)50mL無(wú)菌的一次性離心管中，并將每管的體積用溶液B定容至45mL,在3000rpm條件下離心IOmin以獲得沉淀并棄去上清液。用5mL溶液B再清洗沉淀兩次。將沉淀重懸浮于IOmL溶液B中，并用血球計(jì)數(shù)板對(duì)原生質(zhì)體計(jì)數(shù)。將原生質(zhì)體再次離心并棄去上清液，根據(jù)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)結(jié)果，加入適量溶液B重懸沉淀，使得原生質(zhì)體數(shù)目在I X IO8個(gè)/mL左右。
[0028]在冰上，將200 μ L上述原生質(zhì)體溶液加入預(yù)冷的無(wú)菌7mL離心管中，每個(gè)轉(zhuǎn)化反應(yīng)用I管，加入10 μ g重組質(zhì)粒,加入50 μ L溶液C,溫和混勻后再冰上放置20min。
[0029]將轉(zhuǎn)化上層培養(yǎng)基熔化并保持在55°C ;從冰中移出上述7mL離心管，并向管中加入2mL溶液C和4mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質(zhì)體混合物；向3個(gè)頂層瓊脂試管中的每一個(gè)中加入ImL上述原生質(zhì)體混合物，并立即傾倒與轉(zhuǎn)化下層平板上，并將平板在30°C下培養(yǎng)5~7d至有轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
[0030]挑取轉(zhuǎn)化子過(guò)夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000rpm離心5min,棄上清；加Λ 400 μ I 抽提緩沖液(IOOmM Tris-HCl, IOOmM EDTA, 250mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ IlOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm離心IOmin,取上清；加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置30min ；13000rpm離心lOmin，棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。
[0031]以上述提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因進(jìn)行驗(yàn)證。
[0032]上游引物序列為:GGGGTACCATGGCTCTCT CCAAGCT ；
[0033]下游引物序列為:GCTCTAGATTACAAGCAC TGCGAATAC ；
[0034]PCR 擴(kuò)增條件為 950C 4min ；94°C 40S ；58°C 40S，72°C lmin30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序分析，驗(yàn)證結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為SEQ ID N0:4。說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建得到了含纖維素酶突變體基因的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉 FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)。
[0035]采用上述同樣的方法將野生型纖維素酶基因片段SEQ ID N0:2轉(zhuǎn)化到里氏木霉中，構(gòu)建得到重組表達(dá)野生型纖維素酶的里氏木霉工程菌，將其命名為里氏木霉Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)。
[0036]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLIM KH2PO4,48.156g MgSO4，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0037]溶液B:5mLlM Tris (ρΗ7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0038]溶液C:250g PEG4000,2.77g CaCl2, 5mLlM Tris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0039]原生質(zhì)體化溶液:將0.4mg 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichodermaharzianum, Sigma)溶解于40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0040]轉(zhuǎn)化下層平板:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6%(NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，0.35% 瓊脂粉。[0041 ]轉(zhuǎn)化上層培養(yǎng)基:0.l%MgS04, 1%KH2P04, 0.6% (NH4) 2S04, 1% 葡萄糖，18.3% 山梨
醇，0.35%瓊脂糖。
[0042]微量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解后用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過(guò)濾除菌。
[0043]PDA平板:20g葡萄糖,200g 土豆蒸煮液，15g瓊脂,加入dlH20至終體積1000mL,高
壓蒸氣滅菌。
[0044]YEG+U液體培養(yǎng)基:20g葡萄糖，5g酵母提取物，Ig尿苷，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0045]實(shí)施例3發(fā)酵驗(yàn)證
[0046]將上述構(gòu)建得到的里氏木霉工程菌FN3-2 (Trichoderma reesei FN3-2)與里氏木霉工程菌Ul-23 (Trichoderma reesei U1-23)分別接種于MM發(fā)酵培養(yǎng)基(1.5%葡萄糖，1.7% 乳糖，2.5% 玉米漿，0.44%(NH4) 2S04,0.09%MgS04, 2%KH2P04,0.04%CaCl2，0.018% 吐溫-80，0.018%微量元素·)培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)48小時(shí)，然后25°C培養(yǎng)48小時(shí)，分別取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，其中箭頭所指處即為重組表達(dá)的纖維素酶，說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建的里氏木霉工程菌FN3-2能重組表達(dá)纖維素酶突變體，里氏木霉工程菌U1-23能重組表達(dá)野生型纖維素酶。
[0047]實(shí)施例4:酶活測(cè)定
[0048]4.1酶活測(cè)定方法
[0049]在50°C、pH值為4.8 (中性為pH6.0)的條件下,每分鐘從濃度為5mg/ml的輕甲基纖維素鈉溶液中降解釋放Iymol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位U，還原糖以葡萄
糖等量。
[0050]取三支試管各加入0.5mL CMC底物，與待測(cè)酶液一起50°C水浴預(yù)熱5min。在第一、二試管中各加入0.5mL待測(cè)液，并計(jì)時(shí)，50°C水浴中反應(yīng)15min。反應(yīng)完后在三支試管中各加入1.5mLDNS試劑，并在第三支試管總補(bǔ)加0.5mL的待測(cè)酶液。取出并搖勻三支試管后，在沸水浴中反應(yīng)5min。迅速冷卻至室溫,用水定到5.0mL。以第三支試管試液為對(duì)照在540nm波長(zhǎng)條件下測(cè)第一、二試管試液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之間為宜。待測(cè)酶液反應(yīng)液的吸光度與水平控制酶液反應(yīng)液吸光度之差的絕對(duì)值不超過(guò)0.015。
[0051 ] 酶活X =(葡萄糖等量值/180/15/0.5) Xn
[0052]其中:X——酶活力單位，IU/g(mL);
[0053]180—葡萄糖從微克換算成微摩爾；
[0054]15——待測(cè)液與底物的反應(yīng)時(shí)間；
[0055]0.5-加入反應(yīng)的待測(cè)酶液量；
[0056]η——稀釋倍數(shù)；
[0057]4.2、酶活測(cè)定[0058]按照上述方法測(cè)定里氏木霉FN3-2發(fā)酵上清液的酶活為130U/mL，而里氏木霉U1-23發(fā)酵上清液的酶活僅為80U/mL，說(shuō)明纖維素酶突變體在里氏木霉中的表達(dá)效率比野生型聞。
[0059]實(shí)施例5纖維素酶酶學(xué)性質(zhì)分析
[0060]5.1最適作用溫度
[0061]分別在20。。、30。。、35。。、40。。、45。。、50。。、55。。、60。。、65。。、70。。、80。。，pH6.0 條件下測(cè)定上述發(fā)酵上清液的酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖2所示，纖維素酶突變體的最適作用溫度為50°C;且在40°C條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活；而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55°C，在40°C條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發(fā)揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力。
[0062]5.2最適作用pH值
[0063]分別用pH 值為 3.0,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5,8.0 的緩沖液稀釋上述發(fā)酵上清液,在50°C條件下測(cè)定其酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，纖維素酶突變體的最適作用pH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內(nèi)均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內(nèi)維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的PH適應(yīng)范圍更加寬泛，具有更大的應(yīng)用空間。
[0064]實(shí)施例6低溫纖維素酶在 紡織中的應(yīng)用
[0065]1、針織面料、梭織面料的除毛染色一浴工藝
[0066]應(yīng)用溫度為35_55°C ；
[0067]處理時(shí)間為30-150分鐘；
[0068]pH 范圍為 4.0-8.5 ;
[0069]上述工藝條件特別適用于染色同浴的情況；適用的浴比范圍為1:5-1:30，使用的設(shè)備類(lèi)型為溢流染色機(jī)，卷染機(jī)，水洗機(jī)等，本發(fā)明纖維素酶突變體的用量為400-1000U/L，且纖維素酶突變體的耐鹽范圍為硫酸鈉40-100g/L.[0070]該酶除毛干凈，對(duì)織物強(qiáng)力損失小，其滅活條件為添加純堿至pH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。
[0071]2、牛仔面料的起花及除毛應(yīng)用
[0072]應(yīng)用溫度為35_55°C ；
[0073]處理時(shí)間為10-60分鐘；
[0074]pH 范圍為 4.0-8.5 ;
[0075]上述工藝條件可應(yīng)用于退漿及單獨(dú)石磨洗條件下的除毛、起花工藝；適用的浴比范圍為1:5-1:30，使用的設(shè)備類(lèi)型為工業(yè)水洗機(jī)等，纖維素酶突變體的用量為400-1000U/L0
[0076]該酶除毛干凈，起花均勻，花點(diǎn)較小，對(duì)織物強(qiáng)力損失小，其滅活條件為添加純堿至pH值到10，或升溫到70°C以上并保持10分鐘。
[0077]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的低溫纖維素酶突變體可廣泛應(yīng)用于紡織加工領(lǐng)域，在pH4.0-8.5范圍內(nèi)應(yīng)用，無(wú)需調(diào)酸可直接使用，且效果良好；除毛干凈，對(duì)織物強(qiáng)力損失小；牛仔水洗，起花小，花點(diǎn)較小，批差穩(wěn)定；耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，能大·大節(jié)省工時(shí)，減少生產(chǎn)成本。
【權(quán)利要求】
1.一種纖維素酶，其特征在于，所述的纖維素酶是氨基酸序列為SEQ ID N0:1的纖維素酶第48位氨基酸由Leu變?yōu)镻he，第49位氨基酸由Thr變?yōu)長(zhǎng)ys，第55位氨基酸由Ala變?yōu)镾er，第66位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro，第83位氨基酸由Asp變?yōu)锳sn，第130位氨基酸由Ile變?yōu)閂al，第144位氨基酸由Gln變?yōu)镠is，第147位氨基酸由Leu變?yōu)镠e，第156位氨基酸由Leu變?yōu)镠e。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維素酶，其氨基酸序列為SEQ ID N0:3。
3.一種基因，所述的基因用于編碼權(quán)利要求1所述的纖維素酶。
4.如權(quán)利要求3所述的基因，其核酸序列為SEQID N0:4。
5.一種重組質(zhì)粒，所述的重組質(zhì)粒攜帶有權(quán)利要求3所述的基因。
6.一種重組里氏木霉，所述的重組里氏木霉攜帶有權(quán)利要求5所述的重組質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求1所述的纖維素酶在紡織加工領(lǐng)域中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/885GK103589701SQ201310578003
【公開(kāi)日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2013年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月18日
【發(fā)明者】黃亦鈞, 許麗紅, 張青, 劉艷萍, 許韡, 王華明 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司, 上海康地恩生物科技有限公司