一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。以該無(wú)血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成：α-MEM10.2g/L、碳酸氫鈉2.4g/L、L-谷氨酰胺1-5mM、泊洛沙姆18850-300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-10mg/L、Hepes1-5mM、β-巰基乙醇50nM、脂質(zhì)0.1-1mg/L、微量元素1-5mg/L、谷胱甘肽0.1-5mg/L、對(duì)氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松1-50ng/mL、維生素PP20-50mg/L、維生素C5-50mg/L、式I的化合物2-10μM、式II的化合物5-20μM、黃體酮10-20ng/mL、腐胺1-10mg/L、肝素1-10IU/mL、EGF1-10ng/mL、b-FGF1-10ng/mL、HGF1-10ng/mL、VEGF1-10ng/mL。該MSCs無(wú)血清培養(yǎng)基BPS-SFM是一種化學(xué)成分確定、無(wú)動(dòng)物源性物質(zhì)、無(wú)血清的培養(yǎng)基；
【專(zhuān)利說(shuō)明】—種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，屬于細(xì)胞工程與生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是廣泛存在于人體組織器官中的成體干細(xì)胞，因其具有高度自我更新能力和多向分化潛能，在臨床造血支持、促進(jìn)干細(xì)胞植入和免疫調(diào)控等方面具有潛在的應(yīng)用前景。目前，通過(guò)將MSCs作為細(xì)胞治療產(chǎn)品進(jìn)行直接輸注，或與支架材料相結(jié)合構(gòu)建組織工程化的組織、器官(皮膚、骨或軟骨等)進(jìn)行移植開(kāi)展的大規(guī)模臨床前及臨床研究證實(shí)，MSCs在燒傷、骨缺損、軟組織填充、終末期肝病、心肌梗死、糖尿病等創(chuàng)傷或疾病的治療中具有良好的安全性和有效性。例如，2012年，美國(guó)Osiris公司的干細(xì)胞產(chǎn)品Prochymal在加拿大獲批上市,成為全球首個(gè)獲批的干細(xì)胞藥物。Prochymal是間充質(zhì)干細(xì)胞靜脈注射劑，用于激素治療失敗的acute GvHD(急性移植物抗宿主病，一種骨髓移植并發(fā)癥)的兒童患者，這是間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的歷史性進(jìn)步。
[0003]目前，已經(jīng)可從臍帶、胎盤(pán)、成人骨髓、外周血、脂肪等組織中分離獲得MSCs，雖然不同來(lái)源MSCs在特性上略有差別，但都具有如下共同性質(zhì):例如，體外成纖維生長(zhǎng)、擴(kuò)增，特異性表達(dá)⑶29、⑶44、⑶90、⑶105、⑶166，但不表達(dá)內(nèi)皮和造血的標(biāo)志⑶34和⑶45等，且在體外具有成脂、成骨和成軟骨分化的潛能。因此，都可以作為終末期疾病、難治性疾病治療的種子細(xì)胞來(lái)源。
[0004]隨著MSCs在臨床應(yīng)用中的迫切需求以及潛在的巨大衍生市場(chǎng)，關(guān)于符合臨床應(yīng)用要求的、規(guī)?；腗SCs的分離、純化、擴(kuò)增技術(shù)和標(biāo)準(zhǔn)的建立亟待解決。由于組織中MSCs數(shù)量極其有限，為獲得足夠用于臨床治療的細(xì)胞量，需要在回輸前對(duì)其進(jìn)行體外擴(kuò)增。雖然研究表明，常規(guī)用于普通細(xì)`胞培養(yǎng)的含有胎牛/新生牛血清的培養(yǎng)體系同樣適合MSCs的體外擴(kuò)增和維持，然而細(xì)胞內(nèi)殘存的動(dòng)物血清會(huì)引發(fā)回輸后受體產(chǎn)生嚴(yán)重的免疫反應(yīng)，并且?guī)?lái)不可預(yù)知的動(dòng)物源性污染，為臨床應(yīng)用帶來(lái)諸多問(wèn)題。例如Sunghoon Jung等人對(duì)這類(lèi)含有血清或動(dòng)物源成分的培養(yǎng)體系的臨床應(yīng)用問(wèn)題進(jìn)行了系統(tǒng)性總結(jié)(Sunghoon Junget al.,Ex vivo Expansion of Human Mesenchymal Stem Cell in Defined Serum-FreeMedia, Stem Cells International，2012)，其至少包括如下潛在問(wèn)題:
[0005](I)有害病原體的污染，例如病毒、支原體、朊病毒等；
[0006](2)異種蛋白所引發(fā)的免疫反應(yīng)；
[0007](3)高度的批間差異性導(dǎo)致細(xì)胞的生產(chǎn)過(guò)程很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化；
[0008](4)血清中還可能含有生長(zhǎng)抑制因子、細(xì)胞毒性物質(zhì)；
[0009](5)為降低各類(lèi)污染風(fēng)險(xiǎn)而開(kāi)展的質(zhì)量控制難度十分高；
[0010](6)其它成分不明的因子、激素等物質(zhì)的作用尚待研究。
[0011]近年來(lái)，對(duì)MSCs等成體干細(xì)胞的體外維持和擴(kuò)增機(jī)制的深入研究，極大推動(dòng)了MSCs的體外無(wú)血清培養(yǎng)體系的研發(fā)和建立。目前商品化以及在研的MSCs無(wú)血清培養(yǎng)基(表I)都是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基(a -MEM、IMDM、L-DMEM等)中添加生長(zhǎng)因子(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、上皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子EGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1IGF-1、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子SCF等)、蛋白(胰島素Insulin、轉(zhuǎn)鐵蛋白Transferrin、人/牛血清白蛋白H/BSA等)、激素(地塞米松/鈉)、微量元素(硒)、維生素等。無(wú)血清培養(yǎng)基具有成分明確的特點(diǎn)，并可良好維持MSCs的體外增殖和分化多能性，但存在價(jià)格高、保存時(shí)間短等問(wèn)題。同時(shí)，這些培養(yǎng)基大多需要輔助明膠等基質(zhì)膠對(duì)培養(yǎng)平皿進(jìn)行包被處理，不但可能因此引入動(dòng)物源成分，而且也增加了細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的工作量和傳代過(guò)程中的污染機(jī)會(huì)。因此，尋找成分明確、質(zhì)量穩(wěn)定、使用便捷、成本較低的無(wú)血清培養(yǎng)體系對(duì)于MSCs的臨床應(yīng)用具有重要的意義。
[0012]表1目前已有的商品化培養(yǎng)基情況統(tǒng)計(jì)表
[0013]
【權(quán)利要求】
1.一種用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基，以該無(wú)血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉 2.4g/L、L-谷氨酰胺 l_5mM、泊洛沙姆 18850_300mg/L、重組人白蛋白2-8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白10-20mg/L、重組人胰島素2-lOmg/L、H印esl_5mM、β-巰基乙醇50ηΜ、脂質(zhì)0.1-lmg/L、微量元素l_5mg/L、谷胱甘肽0.l_5mg/L、對(duì)氨基苯甲酸0.5-5mg/L、氫化可的松l-50ng/mL、維生素PP20_50mg/L、維生素C5_50mg/L、式I所示的化合物2-10 μ M、式II所示的化合物5-20 μ Μ、黃體酮10_20ng/mL、腐胺l-10mg/L、肝素1-lOIU/mL、EGFl-10ng/mL、b-FGFl-10ng/mL、HGFl-10ng/mL、VEGFl-10ng/mL ；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中，所述脂質(zhì)包括膽固醇、花生四烯酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸中的一種或幾種的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中，所述微量元素包括Cu、Zn、Se、Fe、Sn、N1、Ag、Al、Cr、Ge、Zr、Rb、Co、Cd、Ga、Mg、Mn 和 Ba 中的一種或幾種的組合。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中，以該無(wú)血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其包括以下成分組成: α -ΜΕΜ10.2g/L、碳酸氫鈉2.4g/L、L-谷氨酰胺5mM、泊洛沙姆188100mg/L、重組人白蛋白8g/L、重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白20mg/L、重組人胰島素10mg/L、Hepes5mM、β-巰基乙醇50ηΜ、膽固醇0.5mM、花生四烯酸50nM、棕櫚酸0.26mg/L、棕櫚油酸0.25mg/L、硬脂酸0.28mg/L、油酸 0.28mg/L、亞油酸 0.28mg/L、亞麻酸 0.28mg/L、Cu5nM、Se30nM、ZnlmM、Ga0.3mM、Cr5 μ M> Mg0.3mM、Mn5nM、谷胱甘肽lmg/L、對(duì)氨基苯甲酸lmg/L、氫化可的松50ng/mL、維生素PP50mg/L、維生素C20mg/L、式I所示的化合物10 μ M、式II所示的化合物20 μ Μ、黃體酮15ng/mL、腐胺 10mg/L、肝素 10IU/mL、EGF10ng/mL、b-FGF10ng/mL、HGF10ng/mL、VEGFIOng/mL0
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中，以該無(wú)血清培養(yǎng)基的體積計(jì)，其還包括:原兒茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFl-lOng/mL、TGF-β 1-lOng/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的無(wú)血清培養(yǎng)基，其中，以該無(wú)血清培養(yǎng)基的體積計(jì),其還包括:原兒茶酸 1.5mmol/L、PDGF-BBIOng/mL, IGF-110ng/mL、GM-CSFlOng/mL、TGF-β IOng/mL0
7.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基的制備方法，其包括將各種成分與水混合之后利用0.22 μ m濾器過(guò)濾除菌，密封，4°C避光保存的步驟。
8.權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的用于培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基在間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用。`
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK103555665SQ201310583547
【公開(kāi)日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月12日
【發(fā)明者】趙侃, 王春有, 趙宇, 劉湘連, 李莉莉 申請(qǐng)人:北京東方華輝生物醫(yī)藥科技有限公司