器官基因的組蛋白h3k9三甲基化表達差異的分析方法與基因模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法與基因模型，分析方法包括以下步驟：提取冷凍保存的標本的組織樣本，研磨勻漿并用質(zhì)量百分數(shù)為1%的甲醛處理，裂解細胞得到全細胞裂解液；在全細胞裂解液加入三甲基化組蛋白H3K9的抗體和磁珠，在4℃進行孵育，提取DNA；構(gòu)建DNA文庫，進行染色質(zhì)免疫沉淀測序分析，對有效數(shù)據(jù)進行產(chǎn)量統(tǒng)計，并與目的物種基因組序列進行比對，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾富集區(qū)域，獲取峰值相關(guān)基因；對所述峰值相關(guān)基因按照基因功能進行聚類分析，并選取組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的至少一基因。
【專利說明】器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法與
基因模型
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001]本發(fā)明涉及組蛋白甲基化，尤其涉及一種器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法與基因模型。
【【背景技術(shù)】】
[0002]在哺乳動物基因組中，組蛋白可以有很多修飾形式，包括組蛋白末端的乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化、ADP (二磷酸腺苷)核糖基化等等，這些修飾都會影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白修飾最重要的表觀遺傳機制是控制基因表達，因此其與細胞的增殖、發(fā)育和生存息息相關(guān)。對于組蛋白H3 (組蛋白H3的第9位賴氨酸殘基)在不同的組織和生物中已廣泛研究并證實組蛋白H3K9三甲基化(H3K9me3)與異染色質(zhì)形成，基因的表達和轉(zhuǎn)錄伸長率具有關(guān)聯(lián)性。
[0003]表觀遺傳學(xué)是研究基因的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達和調(diào)控的可遺傳變化的過程和機制。與遺傳多態(tài)性不同，會發(fā)生非遺傳部分和可逆的DNA修飾。
[0004]甲基化發(fā)生在位于氨基末端的組蛋白尾部的五個主要的賴氨酸殘基(H3K4, H3K9, H3K27, H3K36, H4K20),以及一個球狀蛋白結(jié)構(gòu)域(H3K79)內(nèi)的賴氨酸殘基，這些賴氨酸可發(fā)生單甲基化、二甲基化和三甲基化。在各種不同的組蛋白賴氨酸甲基化模式中，由于H3K9的甲基化和抑制的染色質(zhì)相關(guān)而備受關(guān)注。H3K9三甲基化(H3K9me3)是翻譯后修飾，并且與異染色質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)聯(lián)，也是基因轉(zhuǎn)錄沉默的標志，具有重要的研究價值。
[0005]高通量技術(shù)具有高效的特點，其可用來分析基因組中大量的基因表達情況同時研究病理過程中復(fù)雜的分子機理。ChlP-seq (Chromatin Immunoprecipitation -sequencing,染色質(zhì)免疫沉淀_測序)是染色質(zhì)免疫共沉淀后并結(jié)合高通量測序的方法，它能夠在全基因組中識別轉(zhuǎn)錄因子(TFs)和DNA結(jié)合蛋白的結(jié)合位點。隨著高通量測序平臺如Illumina公司的基因組分析以及SOLiD (使用連接法測序的一種高通量測序儀，Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection)和芯片級別的抗體出現(xiàn)，ChlP-seq已成為用于確定基因組中的功能元件的最廣泛使用的方法。與常用的ChIP_chip(Chromatin Immunoprecipitation-chip,染色質(zhì)免疫共沉淀-芯片)相比，ChlP-seq 具有更高的信噪比，更便宜以及更少量的樣本的優(yōu)勢。
[0006]目前，只有極少數(shù)研究比較分析哺乳動物或人體組織的H3K9me3。
【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0007]有鑒于此，有必要提出一種新的器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法與基因模型。
[0008]本發(fā)明的一個技術(shù)方案是，器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法，其包括以下步 驟:提取冷凍保存的標本的組織樣本，研磨勻漿并用質(zhì)量百分數(shù)為1%的甲醛處理，裂解細胞得到全細胞裂解液；在全細胞裂解液加入三甲基化組蛋白H3K9的抗體和磁珠，在4°C進行孵育，提取DNA ;構(gòu)建DNA文庫，進行染色質(zhì)免疫沉淀測序分析，對有效數(shù)據(jù)進行產(chǎn)量統(tǒng)計，并與目的物種基因組序列進行比對，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾富集區(qū)域，獲取峰值相關(guān)基因；對所述峰值相關(guān)基因按照基因功能進行聚類分析，并選取組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的至少一基因。
[0009]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述標本為心臟和/或脾臟。
[0010]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述提取DNA后還進行純化，然后再構(gòu)建DNA文庫。
[0011 ] 優(yōu)選的，所述分析方法中，所述純化采用快速PCR純化試劑盒進行，純化之后還采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)進行驗證。
[0012]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述比對中，允許不超過2個堿基的錯配。 [0013]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述構(gòu)建DNA文庫中，對DNA片段末端修復(fù)，3'端加A堿基，連接測序接頭，PCR擴增及選擇DNA產(chǎn)物的片段大小，用于上機測序。
[0014]優(yōu)選的，所述分析方法中，選擇DNA產(chǎn)物的片段大小中，包括接頭序列在內(nèi)的片段大小為 100-300bp。
[0015]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述有效數(shù)據(jù)為去除接頭和低質(zhì)量讀取后的下機數(shù)據(jù)，其中低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值S 20個數(shù)大于等于50%，或者N堿基個數(shù)大于等于 10% O
[0016]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值S 18個數(shù)大于等于60%，或者N堿基個數(shù)大于等于15%。
[0017]本發(fā)明的又一技術(shù)方案是，一種基因模型，其包括采用上述任一分析方法所獲得的組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的若干基因。
[0018]上述方案，通過分析器官H3K9三甲基化表達差異，從而確定出候選基因，這些基因與免疫，細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄和合成渠道和運輸和細胞外基質(zhì)等相關(guān)，能夠作為中間結(jié)果的有效信息，為下一步的分析工作提供良好的信息支持和輔助數(shù)據(jù)；并且，H3K9me3具有作為一個潛在的生物標志物或表觀遺傳疾病治療靶點的意義。
【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0019]圖1是一個實施例心臟的峰值在若干基因功能元件上的分布特征圖；
[0020]圖2是一個實施例脾臟的峰值在若干基因功能元件上的分布特征圖；
[0021]圖3是一個實施例的各樣本間所共同包含的基因和各自具有的特有的基因示意圖；
[0022]圖4是心臟的基因相關(guān)各位點所占的比例示意圖；
[0023]圖5是脾臟的基因相關(guān)各位點所占的比例示意圖；
[0024]圖6是兩個樣本中所共同包含的峰值區(qū)域富集度示意圖；
[0025]圖7是一個實施例的流程示意圖。
【【具體實施方式】】
[0026]下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細描述。
[0027]本發(fā)明通過采用ChlP-seq的技術(shù)，比較分析人體器官心臟和脾臟之間在全基因組中H3K9me3的變化及差異情況，以便更好地認識組織間的表觀遺傳差異，建立基因模型，作為下一步分析的基礎(chǔ)，并通過數(shù)據(jù)分析，全面的描述了組織特異性表達，功能及發(fā)展情況。
[0028]如圖7所示，本發(fā)明的一個實施例是，器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法，其包括以下步驟:提取冷凍保存的標本的組織樣本，研磨勻漿并用質(zhì)量百分數(shù)為1%的甲醛處理，裂解細胞得到全細胞裂解液；在全細胞裂解液加入三甲基化組蛋白H3K9的抗體和磁珠(Beads)，在4°C進行孵育，提取DNA ;孵育時間不作限制，只需能夠完成孵育，最后實現(xiàn)DNA提取機殼。然后構(gòu)建DNA文庫，進行染色質(zhì)免疫沉淀測序分析，對有效數(shù)據(jù)進行產(chǎn)量統(tǒng)計，并與目的物種基因組序列進行比對，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾富集區(qū)域，獲取峰值相關(guān)基因；對所述峰值相關(guān)基因按照基因功能進行聚類分析，并選取組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的至少一基因。優(yōu)選的，所述提取DNA后還進行純化，然后再構(gòu)建所述DNA文庫。優(yōu)選的，所述純化采用快速PCR純化試劑盒進行，純化之后還采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)進行驗證。
[0029]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述標本為心臟或脾臟。關(guān)于下面相關(guān)實施例涉及樣本的合法性說明如下:實驗采用兩組標本，包括兩個心臟和兩個脾臟，均來自中國廣西桂林第一八一醫(yī)院腦死亡患者自愿捐贈的器官。標本放置于_80°C保存。標本收集的方案與執(zhí)行均獲得廣西代謝性疾病重點實驗室和第一八一醫(yī)院倫理委員會的批準。器官捐贈者均簽署了知情同意書。 [0030]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述比對中，允許不超過2個堿基的錯配。優(yōu)選的，所述分析方法中，所述構(gòu)建DNA文庫中，對DNA片段末端修復(fù)，3 ^端加A堿基，連接測序接頭，PCR擴增及選擇DNA產(chǎn)物的片段大小，用于上機測序。優(yōu)選的，所述分析方法中，選擇DNA產(chǎn)物的片段大小中，包括接頭序列在內(nèi)的片段大小為100-300bp。
[0031]優(yōu)選的，所述分析方法中，所述有效數(shù)據(jù)為去除接頭和低質(zhì)量讀取后的下機數(shù)據(jù)，其中低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值20的個數(shù)大于等于50%，或者N堿基個數(shù)大于等于10%。優(yōu)選的，所述分析方法中，所述低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值18的個數(shù)大于等于60%，或者N堿基個數(shù)大于等于15%。
[0032]例如,采用染色質(zhì)免疫共沉淀方式,準備ChIP Sequencing建庫。
[0033]首先，提取標本的組織樣本，例如，從冰凍狀態(tài)拿到O至4°C，注意不要拿到常溫，待組織解凍后，參照BGI公布的程序進行ChlP-seq實驗方案。簡單的說，將組織樣本先研磨勻衆(zhòng)并用質(zhì)量百分數(shù)為1%的甲醒處理細胞，使DNA-protein的相互結(jié)合作用被交聯(lián)固定，然后裂解細胞，得到全細胞裂解液，通過超聲處理，將基因組DNA打斷至100-500bp碎片，在細胞裂解液中加入特定的實驗所需的三甲基化賴氨酸9的抗體和beads，并進行4°C孵育。采用合適的實驗條件進行洗脫，并解交聯(lián)，經(jīng)過交聯(lián)反轉(zhuǎn)和蛋白酶K處理后，DNA被沉淀提取出，在構(gòu)建DNA文庫前，先用QIA快速PCR純化試劑盒將DNA進一步純化。通過qPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System,實時定量基因擴增突光檢測系統(tǒng))對ChIP結(jié)果進行驗證,準備好的ChIP后的DNA樣品可以用于ChIP Sequencing建庫。
[0034]ChIP Sequencing文庫構(gòu)建流程說明如下:先對DNA片段末端進行修復(fù),3'端加A喊基,連接測序接頭,詳細步驟可參考Illumina公司Paired-End DNA Sample Prep kit。然后進行PCR擴增及DNA產(chǎn)物的片段大小選擇，優(yōu)選為100-300bp，包括接頭序列在內(nèi)，合格的文庫用于上機測序。優(yōu)選的，DNA產(chǎn)物的片段大小為120至270bp。
[0035]然后進行ChlP-seq分析。
[0036]ChIP DNA末端修復(fù)，接頭連接以及擴增等均按之前的進行。從瓊脂糖凝膠中分離出大小約為49bp的片段,用Solexa/Illumina2G基因分析儀分析測序。與目的物種基因組序列進行比對，其中參考基因組版本為Hgl9，比對軟件為S0AP2.21。比對過程中，允許不超過2個堿基的錯配，優(yōu)選的，僅允許I個堿基的錯配；其中比對到基因組上唯一位置的reads (唯一比對reads)將用于后續(xù)的信息分析。ChIP Sequencing reads在全基因組的分布包括唯一比對Reads在Repeats區(qū)域的分布；唯一比對Reads在各基因功能元件上的分布；唯一比對Reads的全基因組覆蓋深度。而全基因組Peak掃描，采用軟件MACS1.4.0，將基因組上的候選peak區(qū)延伸，得到一定長度的建模區(qū)域，根據(jù)此區(qū)域中所有唯一比對reads的情況,使用Poisson分布模型進行檢驗,計算候選peak區(qū)域的p-value,若p_value〈l.00e-05,則認為該區(qū)域是一個peak。MACS的目的是從ChlP-seq的數(shù)據(jù)集中找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾富集區(qū)域，而且不需要正常對照。
[0037]Peak相關(guān)基因的GO分析，GO是一種整合性、統(tǒng)一化、動態(tài)開放實時更新的分類系統(tǒng)。其包括三大獨立的本體(Ontology):基因參與的生命過程(biological process),所處的細胞組份和元件(cellular component)及發(fā)揮的分子生物學(xué)功能(molecularfunction)。這三個ontology下面又可以獨立出不同的亞層次，層層向下構(gòu)成一個ontologies的樹型分支結(jié)構(gòu)。通過GO功能富集分析,可以知道peak相關(guān)基因涉及到哪些生物學(xué)功能的改變。通過GO功能分析可以將Peak相關(guān)基因按照基因功能進行聚類分析。
[0038]數(shù)據(jù)處理與產(chǎn)出情況統(tǒng)計情況如下:測序完成后，對原始數(shù)據(jù)進行去污染，去接頭及去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計clean data (有效數(shù)據(jù))產(chǎn)量，具體如下表1所示。
[0039]
【權(quán)利要求】
1.器官基因的組蛋白H3K9三甲基化表達差異的分析方法，其特征在于，包括以下步驟: 提取冷凍保存的標本的組織樣本，研磨勻漿并用質(zhì)量百分數(shù)為1%的甲醛處理，裂解細胞得到全細胞裂解液； 在全細胞裂解液加入三甲基化組蛋白H3K9的抗體和磁珠，在4°C進行孵育，提取DNA ；構(gòu)建DNA文庫，進行染色質(zhì)免疫沉淀測序分析，對有效數(shù)據(jù)進行產(chǎn)量統(tǒng)計，并與目的物種基因組序列進行比對，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點和組蛋白修飾富集區(qū)域，獲取峰值相關(guān)基因； 對所述峰值相關(guān)基因按照基因功能進行聚類分析，并選取組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的至少一基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述分析方法，其特征在于，所述標本為心臟和/或脾臟。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述分析方法，其特征在于，所述提取DNA后還進行純化，然后再構(gòu)建DNA文庫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述分析方法，其特征在于，所述純化采用快速PCR純化試劑盒進行，純化之后還采用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)進行驗證。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述分析方法，其特征在于，所述比對中，允許不超過2個堿基的錯配。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述分析方法，其特征在于，所述構(gòu)建DNA文庫中，對DNA片段末端修復(fù)，3'端加A堿基，連接測`序接頭，PCR擴增及選擇DNA產(chǎn)物的片段大小，用于上機測序。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述分析方法，其特征在于，選擇DNA產(chǎn)物的片段大小中，包括接頭序列在內(nèi)的片段大小為100-300bp。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述分析方法，其特征在于，所述有效數(shù)據(jù)為去除接頭和低質(zhì)量讀取后的下機數(shù)據(jù)，其中低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值S 20個數(shù)大于等于50%，或者N堿基個數(shù)大于等于10%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述分析方法，其特征在于，所述低質(zhì)量讀取為每條讀取中堿基質(zhì)量值=18個數(shù)大于等于60%,或者N堿基個數(shù)大于等于15%。
10.一種基因模型，其特征在于，包括采用如權(quán)利要求1至9任一所述分析方法所獲得的組蛋白H3K9三甲基化表達差異顯著的若干基因。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667455SQ201310585954
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】眭維國, 戴勇, 曹翠輝, 薛雯, 陳潔晶 申請人:眭維國, 戴勇