假諾卡氏菌及其發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明為假諾卡氏菌及其發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法，解決巳有菌株發(fā)酵獲得骨化二醇過(guò)程中底物投料量低，不適于工業(yè)化生產(chǎn)的問(wèn)題。本發(fā)明的假諾卡氏菌，自編號(hào)為SIIA2243，其拉丁文名Pseudonocardia?autotrophica，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期：2013年07月17日，保藏編號(hào)CGMCC?No.7935。
【專(zhuān)利說(shuō)明】假諾卡氏菌及其發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法
[0001]【技術(shù)領(lǐng)域】:
本發(fā)明涉及一種用于發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的假諾卡氏菌，以及利用該假諾卡氏菌發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法。
[0002]【背景技術(shù)】:
骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis, 0P)日益成為嚴(yán)重威脅老年人的健康的一種慢性疾??；維生素D類(lèi)藥物中的骨化二醇(25—羥基維生素D3)是自然存在人體內(nèi)的維生素D3的活性代謝產(chǎn)物；多年來(lái)，骨化二醇主要用于治療老年人骨質(zhì)疏松癥等各種慢性骨紊亂，以及與慢性腎衰竭有關(guān)的代謝性骨疾病，低鈣血病。另外，骨化二醇近年也作為飼料添加劑用于飼料行業(yè)。
[0003]骨化二醇的制備有化學(xué)合成和生物發(fā)酵兩種方法；化學(xué)合成反應(yīng)步驟繁多、需要昂貴試劑、反應(yīng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生外消旋體，需要進(jìn)行復(fù)雜的拆分過(guò)程，不僅大大影響收率，而且難以拆分完全，而且化學(xué)合成生產(chǎn)骨化二醇會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生較大的污染。而微生物發(fā)酵的方式能夠利用微生物細(xì)胞內(nèi)的酶特異性的解決骨化二醇的手性結(jié)構(gòu)問(wèn)題，其生產(chǎn)條件溫和，收率高，成本低廉，環(huán)境友好，成為一種有效替代化學(xué)合成的方法。但是現(xiàn)有方法中添加的維生素D3的濃度低，專(zhuān)利USP5474923添加維生素D3的最大濃度僅為1000ug/ml，這不利于通過(guò)增加維生素D3的投料量來(lái)提高骨化二醇的產(chǎn)量；而且目前用微生物發(fā)酵方式制備骨化二醇的相關(guān)研究?jī)H限于實(shí)驗(yàn)室水平，沒(méi)有工業(yè)規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的技術(shù)方案。
[0004]
【發(fā)明內(nèi)容】
:
本發(fā)明的目的是提供一種維生素D3的投料量高，產(chǎn)品收率高，質(zhì)量好，可工業(yè)規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的假諾卡氏菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法。
[0005]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:
假諾卡氏菌，其特征在于其自編號(hào)為SIIA2243，其拉丁文名Pseudonocardiaautotrophica,保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期:2013年07月17日，保藏編號(hào)CGMCCN0.7935。
[0006]假諾卡氏菌發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法，生產(chǎn)過(guò)程包括:
(1)菌株SIIA2243依次經(jīng)過(guò)三角燒瓶，種子罐，發(fā)酵罐進(jìn)行深層培養(yǎng)發(fā)酵，
(2)向菌株SIIA2243的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3，繼續(xù)發(fā)酵得發(fā)酵液，
(3)將步驟(2)的發(fā)酵液，用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，濃縮，柱層析及結(jié)晶后得到骨化二醇成品。
[0007]步驟(1)中菌株SIIA2243的種子及發(fā)酵罐培養(yǎng)基含有蛋白胨、玉米漿、葡萄糖、黃豆粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀。
[0008]步驟(2)中菌株SIIA2243的發(fā)酵液在補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3后，繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間為I~4天。
[0009] 步驟(2)中菌株SIIA2243的發(fā)酵液在補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3后的24hr內(nèi)，通過(guò)增加攪拌軸轉(zhuǎn)速或者增加空氣流量來(lái)提高發(fā)酵液的溶氧水平。[0010]步驟(3)中的柱層析是指制備型高效液相層析系統(tǒng)。
[0011]假諾卡氏菌發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法，步驟如下:
(I)菌株SIIA2243依次經(jīng)過(guò)三角燒瓶，種子罐，發(fā)酵罐進(jìn)行深層培養(yǎng)發(fā)酵，以下各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml。
[0012]斜面培養(yǎng):
配制含葡萄糖I~10%，蛋白胨I~10%，玉米漿0.1~2%，氯化鈉0.1~1%，瓊脂I~
2.5%，其余為水，pH6.5~7.5的培養(yǎng)基，121°C，30分鐘滅菌，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20~35°C培養(yǎng)5~10天。
[0013]種子培養(yǎng)及發(fā)酵:
配制含蛋白胨0.2~2%，玉米漿0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黃豆粉0.1~1.5%，氯化鈉0.1~1.5%，磷酸二氫鉀0.1~1.5%，其余為水，pH7.0~8.0的種子培養(yǎng)基裝入500ml搖瓶中，冷卻后將培養(yǎng)好的斜面菌株挖塊接入到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速100~300r/min，溫度20~35°C，培養(yǎng)2~5天，得搖瓶種子液。
[0014]按照搖瓶種子培養(yǎng)基的配比配置種子培養(yǎng)基30升，移入到50升一級(jí)種子罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入一級(jí)種子罐內(nèi)，20~35°C攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min，空氣流量1: 0.5~
I: 2 v/v/m，罐壓0.0 2~0.1MPa培養(yǎng)I~4天，按照搖瓶種子培養(yǎng)基的配比配置種子培養(yǎng)基300升，移入到500升二級(jí)種子罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子罐內(nèi)的種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入二級(jí)種子罐內(nèi)，20~350C，攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min,空氣流量1: 0.5~1: 2v/v/m,罐壓0.02~0.1MPa培養(yǎng)I~4天。
[0015]配制含蛋白胨0.2~2%，玉米漿0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黃豆粉0.1~1.5%，氯化鈉0.1~1.5%，磷酸二氫鉀0.1~1.5%，其余為水，pH7.0~8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基3000升，移入到5000升發(fā)酵罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的二級(jí)種子罐內(nèi)的種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入發(fā)酵罐內(nèi)，20~35°C，攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min，空氣流量1: 0.5~1: 2 v/v/m，罐壓0.02~0.1MPa培養(yǎng)I~4天。
[0016](2)向SIIA2243的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3,繼續(xù)發(fā)酵，向5000升發(fā)酵罐中已經(jīng)培養(yǎng)了 I~4天的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3，環(huán)糊精化合物在發(fā)酵液中的終重量百分濃度達(dá)到0.1~5%，維生素D3在發(fā)酵液中的終濃度達(dá)到500ug/ml~5000ug/ml，補(bǔ)料后24hr內(nèi)提高攪拌軸轉(zhuǎn)速為200~500r/min，或者增加空氣流量到1: 0.8~1: 2.5 v/v/m，繼續(xù)發(fā)酵I~10天。
[0017](3)將步驟(2)的發(fā)酵液，用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，濃縮，柱層析及結(jié)晶后得到骨化二醇成品。
[0018]骨化二醇的提取:
終止發(fā)酵后，將發(fā)酵液通過(guò)壓差法移入到10000升的儲(chǔ)罐中，往儲(chǔ)罐中加入等體積的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢韬螅尤肫迫閯?，靜置分層后移去下層的發(fā)酵液；將乙酸乙酯萃取液移入濃縮裝置中進(jìn)行減壓濃縮，所回收的有機(jī)溶劑乙酸乙酯又進(jìn)行二次萃取，而減壓濃縮后獲得的濃縮液利用高壓制備液相層析系統(tǒng)進(jìn)行分離，獲得骨化二醇組分，結(jié)晶后即得骨化二醇成品。[0019]骨化二醇的HPLC測(cè)定:
色譜柱為Kromasil正相硅膠柱(250X4.6mm 1.d，5um)，流動(dòng)相為異丙醇一正己烷(I: 9)，流速1.5ml/min，柱溫為40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm。
[0020]假諾卡氏菌SIIA2243的獲得途徑:
菌株分離、誘變與鑒定。
[0021]從廣州白云山的土壤樣品中分離篩選得到的能夠?qū)⒕S生素D3轉(zhuǎn)化為骨化二醇的原始菌株SIIA243。往菌株SIIA243的斜面培養(yǎng)物中加入IOml無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行洗滌，獲得孢子懸液，梯度稀釋至菌體濃度在107CFU/ml左右，取5ml菌懸液放置在直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，在30W紫外燈下距離30cm照射30秒，梯度稀釋并取0.1ml涂布于平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)10天，挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7天，獲得紫外誘變菌株備用。
[0022]往菌株SIIA243的斜面培養(yǎng)物中加入10mlpH5.0的無(wú)菌磷酸緩沖液進(jìn)行洗滌，獲得孢子懸液，菌懸液中亞硝基胍的濃度為50ug/ml，往誘變處理后的菌懸液加入無(wú)菌硫代硫酸鈉，使亞硝基胍分解以終止其作用，之后梯度稀釋并取0.1ml涂布于平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)10天，挑取單菌落于斜面培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)7天，獲得亞硝基胍誘變菌株備用。
[0023]將紫外誘變和亞硝基胍誘變獲得的菌株移種到含維生素D3的基本培養(yǎng)基及完全培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5~10天，檢出在含維生素D3的基本培養(yǎng)基不長(zhǎng)、在完全培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌株；然后將篩選到的菌株移種到含骨化二醇的基本培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5~10天，檢出不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)勢(shì)較弱的菌落(含維生素03或骨化二醇的基本培養(yǎng)基包含Na2HP04、KH2PO4,MgSO4, CaCl2、微 量元素溶液和瓊脂粉。)。將這些不消耗底物維生素D3和產(chǎn)物骨化二醇的菌落挑選出來(lái)，在搖瓶中發(fā)酵72hr后補(bǔ)入維生素D3，使其在發(fā)酵液中的終濃度達(dá)到500ug/ml~5000ug/ml，然后再發(fā)酵I~10天，經(jīng)過(guò)HPLC檢測(cè)，挑選出能夠耐受高濃度底物維生素D3且具有底物維生素D3殘留低，產(chǎn)物骨化二醇產(chǎn)量高這種轉(zhuǎn)化特性的菌株；
通過(guò)大量的誘變、篩選工作，最終獲得了本發(fā)明所指的菌株SIIA2243。菌株SIIA2243具有特定的工業(yè)用途，發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇。
[0024]通過(guò)通用引物27F與1492R擴(kuò)增菌株SIIA 2243的16S rDNA，獲得的16s rRNA基因序列，在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)，序列號(hào)為KF796659，將其與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)調(diào)集的其它放線(xiàn)菌菌株的16S rDNA相應(yīng)序列進(jìn)行比較，并用Mega 5.0軟件包進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，親緣關(guān)系最相近的是自養(yǎng)假諾卡氏菌模式菌Pseuckmoceirdia autotrophicaATCC IMSNU 20050T,相似度99%，說(shuō)明菌株SIIA2243為自養(yǎng)假諾卡氏菌Aewi/oflocari/iaautotrophica0
[0025]菌株SIIA2243的形態(tài)學(xué)特性:
基內(nèi)菌絲(營(yíng)養(yǎng)菌絲)在微黃，明顯分枝，有橫隔，氣生菌絲白色，分枝，產(chǎn)生卷曲的孢子鏈，孢子類(lèi)橢圓狀；菌絲成節(jié)段，在節(jié)段間的凹陷處或者節(jié)段中間長(zhǎng)出芽的方式進(jìn)行出芽生長(zhǎng)。菌落白色，皺褶，致密，圓形，菌落色素淺黃色。
[0026]菌株SIIA2243的培養(yǎng)特性:
將菌株SIIA2243接種在各種合成培養(yǎng)基和有機(jī)培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)14天，記錄相應(yīng)生長(zhǎng)特征。
【權(quán)利要求】
1.假諾卡氏菌，其特征在于其自編號(hào)為SIIA2243，其拉丁文名PseudonocardiaawioiroMica,保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,保藏日期:2013 年 07 月 17 日，保藏編號(hào) CGMCCN0.7935。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的假諾卡氏菌發(fā)酵生產(chǎn)骨化二醇的方法，其特征在于生產(chǎn)過(guò)程包括: (1)菌株SIIA2243依次經(jīng)過(guò)三角燒瓶，種子罐，發(fā)酵罐進(jìn)行深層培養(yǎng)發(fā)酵， (2)向菌株SIIA2243的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3,繼續(xù)發(fā)酵得發(fā)酵液， (3)將步驟(2)的發(fā)酵液，用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，濃縮，柱層析及結(jié)晶后得到骨化二醇成品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(1)中菌株SIIA2243的種子罐及發(fā)酵罐培養(yǎng)基含有蛋白胨、玉米漿、葡萄糖、黃豆粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中菌株SIIA2243的發(fā)酵液在補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3后，繼續(xù)發(fā)酵的時(shí)間為I~10天。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(2)中菌株SIIA2243的發(fā)酵液在補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3后的24hr內(nèi)，通過(guò)增加攪拌軸轉(zhuǎn)速，或者增加空氣流量來(lái)提高發(fā)酵液的溶氧水平，攪拌軸轉(zhuǎn)速200~500r/min，空氣流量1: 0.8~ I； 2.5 v/v/m0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟(3)中的柱層析是指分離柱直徑為5cm~IOOcm制備型高效液相層析系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于步驟如下: (I)菌株SIIA2243依次經(jīng)過(guò)三角燒瓶，種子罐，發(fā)酵罐進(jìn)行深層培養(yǎng)發(fā)酵，以下各組分的含量均為重量體積百分比，即g/100ml， 斜面培養(yǎng):三角燒瓶?jī)?nèi)配制含葡萄糖I~10%，蛋白胨I~10%，玉米漿0.1~2%，氯化鈉0.1~1%，瓊脂I~2.5%，其余為水，pH6.5~7.5的培養(yǎng)基，121。。，30分鐘滅菌，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20~35°C培養(yǎng)5~10天， 種子培養(yǎng)及發(fā)酵:種子罐，發(fā)酵罐內(nèi)配制含蛋白胨0.2~2%，玉米漿0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黃豆粉0.1~1.5%，氯化鈉0.1~1.5%，磷酸二氫鉀0.1~1.5%，其余為水，PH7.0~8.0的種子培養(yǎng)基裝入500ml搖瓶中，冷卻后將培養(yǎng)好的斜面菌株挖塊接入到裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中，搖瓶轉(zhuǎn)速100~300r/min，溫度20~35°C，培養(yǎng)2~5天，得搖瓶種子液， 按照搖瓶種子培養(yǎng)基的配比配置種子培養(yǎng)基30升，移入到50升一級(jí)種子罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的搖瓶種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入一級(jí)種子罐內(nèi)，20~35°C攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min，空氣流量1: 0.5~1: 2v/v/m,罐壓0.02~0.1MPa培養(yǎng)I~4天，按照搖瓶種子培養(yǎng)基的配比配置種子培養(yǎng)基300升，移入到500升二級(jí)種子罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的一級(jí)種子罐內(nèi)的種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入二級(jí)種子罐內(nèi)，20~35°C，攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min，空氣流量1: 0.5~1: 2v/v/m，罐壓0.02~0.1MPa培養(yǎng)I~4天，配制含蛋白胨0.2~2%，玉米漿0.2~2%，葡萄糖0.5~5%，黃豆粉0.1~1.5%，氯化鈉0.1~1.5%，磷酸二氫鉀0.1~1.5%，其余為水，pH7.0~8.0的發(fā)酵培養(yǎng)基3000升，移入到5000升發(fā)酵罐內(nèi)，121°C，30分鐘滅菌，冷卻后，將培養(yǎng)好的二級(jí)種子罐內(nèi)的種子液按照重量體積百分比5~10%接種量在無(wú)菌條件下移入發(fā)酵罐內(nèi)，20~35°C，攪拌軸轉(zhuǎn)速100~400r/min，空氣流量1: 0.5~1: 2 v/v/m,罐壓0.02~0.1MPa培養(yǎng)I~4天， (2)向SIIA2243的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3，繼續(xù)發(fā)酵得發(fā)酵液， 繼續(xù)發(fā)酵，向5000升發(fā)酵罐中已經(jīng)培養(yǎng)了 I~4天的發(fā)酵液中補(bǔ)入一種或者多種環(huán)糊精化合物的溶液和維生素D3，環(huán)糊精化合物是指甲基環(huán)糊精、乙基環(huán)糊精、芐基環(huán)糊精，羥丙基環(huán)糊精、羥乙基環(huán)糊精、羥丁基環(huán)糊精，環(huán)糊精化合物在發(fā)酵液中的終重量百分濃度達(dá)到0.1~5%，維生素D3在發(fā)酵液中的終濃度達(dá)到500ug/ml~5000ug/ml，補(bǔ)料后24hr內(nèi)提高攪拌軸轉(zhuǎn)速為200~500r/min，或者增加空氣流量到1: 0.8~1: 2.5 v/v/m，繼續(xù)發(fā)酵I~10天， (3)將步驟(2)的發(fā)酵液，用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，濃縮，柱層析及結(jié)晶后得到骨化二醇成品， 骨化二醇的提取: 終止發(fā)酵后，將發(fā)酵液通過(guò)壓差法移入到10000升的儲(chǔ)罐中，往儲(chǔ)罐中加入與發(fā)酵液等體積的乙酸乙酯，充分?jǐn)嚢韬螅尤肫迫閯o置分層后移去下層的發(fā)酵液，得乙酸乙酯萃取液；將乙酸乙酯萃取液移入濃縮裝置中進(jìn)行減壓濃縮，所回收的有機(jī)溶劑乙酸乙酯又進(jìn)行二次萃取，而減壓濃縮后獲得的濃縮液利用分離柱直徑為5cm~IOOcm高壓制備液相層析系統(tǒng)進(jìn)行分離，獲得骨化二醇組分，結(jié)晶后即得骨化二醇成品， 骨化二醇的HPLC測(cè)定:色譜柱為Kromasil正相硅膠柱(250X4.6mm 1.d，5um)，流動(dòng)相為異丙醇-正己燒(1: 9),流速1.5ml/min,柱溫為40°C，檢測(cè)波長(zhǎng)265nm。
【文檔編號(hào)】C12P7/02GK103898004SQ201310586259
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】曾志剛, 梁彥明, 翟龍飛, 徐欣, 許之暉 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)總公司四川抗菌素工業(yè)研究所, 太原市威爾潞威動(dòng)物保健品有限公司