一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，其特征在于：包括以下步驟：一、DNA提取，設(shè)計識別植物源性成分的特異性的引物和熒光探針，提取樣品基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，所述特異性的引物的序列為：上游引物5｀-GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3｀；下游引物5｀-TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3｀；所述探針序列為：熒光探針5｀-CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3｀；二、熒光定量PCR檢測。本發(fā)明的有益效果是：以植物葉綠體基因保守區(qū)域片段為檢測目標(biāo)，設(shè)計出特異的引物和熒光探針，建立起來的熒光定量PCR鑒別方法，該種鑒別方法靈敏度強、特異性高、快速簡單。
【專利說明】一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白成分鑒別方法，尤其涉及一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法。
【背景技術(shù)】
[0002]乳制品是人民大眾日常飲食中必不可少的組成部分。在利益的驅(qū)使下，原料乳、牛奶等乳制品摻假行為屢禁不止。隨著行業(yè)潛規(guī)則的不斷曝光以及檢測水平的逐漸提高，乳制品摻假的手段也不斷提高，從最初的摻水、尿素、淀粉、碳酸銨、三聚氰胺行為，到目前在產(chǎn)品中添加一些低廉的大豆蛋白、小麥蛋白等植物蛋白或蛋白水解物相對“高明”的方法，可以說，采用傳統(tǒng)蛋白質(zhì)檢測方法越來越難以有效判別出原料乳及牛奶產(chǎn)品的質(zhì)量。 [0003]因此，為解決上述問題，特提供一種新的技術(shù)方案來滿足需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供一種快速、準(zhǔn)確的鑒別原料乳及牛奶中摻入植物源蛋白的熒光定量PCR鑒別方法。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，包括以下步驟:
一、DNA提取
設(shè)計識別植物源性成分的特異性的引物和熒光探針，提取樣品基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，
所述特異性的引物的序列為:
上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ；
下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ；
所述探針序列為:
熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ；
二、熒光定量PCR檢測:
采用熒光定量PCR反應(yīng)體系總量為19.3-29.8 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液12-13yL，濃度為IOymol的上游引物0.5_1.5yL，濃度為IOymol的下游引物
0.5-1.5 μ L，濃度為 10 μ mo I 的探針 0.3-0.8 μ L,模板 DNA1-3 μ L, ddH205_10 μ L,擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，同時設(shè)立陰性對照管和陽性對照，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在94-96°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理1-2 min，保持溫度在94-96°C變性處理5_10s，然后降低溫度至55_60°C進行退火處理25-35s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理25_50s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)35-45個循環(huán)，根據(jù)不同熒光探針標(biāo)記在55-60 °C結(jié)束開始收集熒光信號。
[0006]所述熒光探針5 '端為 FAM、HEX、ROX、JOE、FAM、SYBR Green 1、TET、Cy3、Cy5或VIC熒光物質(zhì)標(biāo)記，所述熒光探針3 ’端可以連接TAMRA或BHQ熒光淬滅劑。
[0007]所述植物源成分為大豆、小麥、水稻或玉米。
[0008]本發(fā)明的有益效果是:以植物葉綠體基因保守區(qū)域片段為檢測目標(biāo)，設(shè)計出特異的引物和熒光探針，建立起來的熒光定量PCR鑒別方法，該種鑒別方法比普通的PCR鑒別方法的準(zhǔn)確率高，區(qū)分方法快速簡單，因為多了探針，所以熒光定量PCR比普通的PCR靈敏度強、特異性高。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0009]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細(xì)描述。
[0010]圖1熒光定量PCR擴增結(jié)果示意圖。
[0011]圖2人工樣品I (含大豆蛋白樣品)結(jié)果示意圖，其中:人工樣品I為含有大豆分離蛋白的原料乳，陽性對照為大豆基因組DNA提取液，陰性對照為天然牛乳基因組DNA提取液。
[0012]圖3人工樣品2 (含小麥蛋白粗提液樣品)結(jié)果示意圖，其中:人工樣品II為含有小麥蛋白粗提液的原料乳，陽性對照為小麥DNA提取液，陰性對照為牛天然牛乳基因組DNA提取液。
【具體實施方式】
[0013]為了加深對本發(fā)明的理解，下面將結(jié)合實施例和附圖對本發(fā)明作進一步詳述，該實施例僅用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明保護范圍的限定。
[0014]實施例1` 一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，包括以下步驟:
一、DNA提取
設(shè)計識別大豆成分的特異性的引物和熒光探針，提取大豆基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，
所述特異性的引物的序列為:
上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ；
下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ；
所述探針序列為:
熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ；
二、熒光定量PCR檢測:
采用熒光定量PCR反應(yīng)體系總量為19.3 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液12 μ L,濃度為10 μ mo I的上游引物0.5 μ L,濃度為10 μ mo I的下游引物0.5 μ L,濃度為10 μ mo I的探針0.3 μ L，模板DNAl μ L，ddH205 μ L，擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，設(shè)立待測樣品組(模板為待測大豆提取的DNA溶液)，同時設(shè)立陰性對照管(模板替換為?；蚪MDNA)，陽性對照(模板替換為大豆基因組DNA)，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在96°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理lmin，保持溫度在96°C變性處理10s，然后降低溫度至55°C進行退火處理25s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理25s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)35個循環(huán)，根據(jù)熒光探針5 I示記的ROX的情況，3 '端連接BHQ，在55°C結(jié)束開始收集ROX熒光信號。
[0015]實施例2
一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，包括以下步驟:
一、DNA提取
設(shè)計識別小麥成分的特異性的引物和熒光探針，提取小麥基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，
所述特異性的引物的序列為:
上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ；
下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ；
所述探針序列為:
熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ；
二、熒光定量PCR檢測:
采用熒光定量PCR反應(yīng)體系總量為25 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液12.5 μ L,濃度為IOymol的上游引物IuL,濃度為IOymol的下游引物IyL,濃度為10 μ mo I的探針0.5 μ L，模板DNA2 μ L，ddH208 μ L，擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，設(shè)立待測樣品組(模板為待測小麥提取的DNA溶液)，同時設(shè)立陰性對照管(模板替換為?；蚪MDNA)，陽性對照(模板替換為小麥基因組DNA)，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在95°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理1.5min,保持溫度在95°C變性處理5s，然后降低溫度至58°C進行退火處理30s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理30s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)40個循環(huán)，根據(jù)熒光探針5 I示記的HEX的情況，3 '端連接TAMRA，在58°C結(jié)束開始收集HEX熒光信號。
[0016]實施例3
一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，包括以下步驟:
一、DNA提取
設(shè)計識別水稻成分的特異性的引物和熒光探針，提取水稻基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，
所述特異性的引物的序列為:
上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ；
下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ；
所述探針序列為:
熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ；
二、熒光定量PCR檢測:
采用熒光定量PCR反應(yīng)體系總量為29.8 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液13 μ L,濃度為IOymol的上游引物1.5 μ L,濃度為ΙΟμπ?οΙ的下游引物1.5 μ L,濃度為10 μ mo I的探針0.8 μ L，模板DNA3 μ L，ddH2010 μ L，擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，設(shè)立待測樣品組(模板為待測水稻提取的DNA溶液)，同時設(shè)立陰性對照管(模板替換為 ?；蚪MDNA)，陽性對照(模板替換為水稻基因組DNA)，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在94°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理2 min,保持溫度在94°C變性處理7s，然后降低溫度至60°C進行退火處理35s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理50s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)45個循環(huán)，根據(jù)熒光探針5 I示記的FAM的情況，3 '端連接TAMRA，在60°C結(jié)束開始收集FAM熒光信號。
[0017]實施例4
一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，包括以下步驟:
一、DNA提取
設(shè)計識別玉米成分的特異性的引物和熒光探針，提取玉米基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定，
所述特異性的引物的序列為:
上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ；
下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ；
所述探針序列為:
熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ；
二、熒光定量PCR檢測:
采用熒光定量PCR反 應(yīng)體系總量為28 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液12.5 μ L,濃度為IOymol的上游引物1.2 μ L,濃度為ΙΟμπιοΙ的下游引物1.3 μ L,濃度為10 μ mo I的探針0.7 μ L，模板DNA3 μ L，ddH209.3 μ L，擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，設(shè)立待測樣品組(模板為待測玉米提取的DNA溶液)，同時設(shè)立陰性對照管(模板替換為?；蚪MDNA)，陽性對照(模板替換為玉米基因組DNA)，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在94°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理2min，保持溫度在94°C變性處理6s，然后降低溫度至58°C進行退火處理33s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理32s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)42個循環(huán)，根據(jù)熒光探針5 I示記的JOE的情況，3 '端連接TAMRA，在59°C結(jié)束開始收集JOE熒光信號。
[0018]熒光探針5 '端還可以為FAM、SYBR Green 1、TET、Cy3、Cy5或VIC熒光物質(zhì)標(biāo)記。
[0019]本發(fā)明的有益效果是:以植物葉綠體基因保守區(qū)域片段為檢測目標(biāo)，設(shè)計出特異的引物和熒光探針，建立起來的熒光定量PCR鑒別方法，該種鑒別方法比普通的PCR鑒別方法的準(zhǔn)確率高，區(qū)分方法快速簡單，因為多了探針，所以熒光定量PCR比普通的PCR靈敏度強、特異性高。
[0020]本發(fā)明的測試結(jié)判別:熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束，根據(jù)擴增曲線進行結(jié)果分析，如圖1所示，結(jié)果有效性的前提條件應(yīng)滿足陰性對照應(yīng)無Ct值(無擴增曲線)且陽性對照Ct <35(典型擴增曲線)，否則視為無效，當(dāng)待測樣品無Ct值(無擴增曲線)，表明樣品不含植物源性成分；當(dāng)待測樣品呈典型擴增曲線，且Ct值Ct < 35時，表明樣品含有植物源性成分；當(dāng)待測樣品出現(xiàn)擴增曲線，且35 ^ Ct < 40時，為可疑樣品，應(yīng)重新測試，如結(jié)果仍在此范圍，表明樣品含有少量植物源性成分。
[0021]本發(fā)明的應(yīng)用舉例:以人工添加樣品(在原料乳中分別添加大豆分離蛋白、小麥蛋白粗提液)為例，介紹本專利鑒別方法。
[0022]1.試劑與儀器
動、植物基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司，實時熒光定量PCR反應(yīng)液購自Takara ；
引物和探針委托寶生物工程(大連)有限公司合成，熒光探針5 '端用FAM標(biāo)記，3 '端連接TAMRA標(biāo)記；
人工樣品1:人為向原料乳中隨機添加大?分尚蛋白，混勾；
人工樣品I1:人為向原料乳中隨機添加小麥蛋白粗提液，混勻；
采用的實時熒光定量PCR儀為Stratagene ΜΧ3000Ρ (美國Agilent公司)，CF15RX離心機(日本Hitachi公司)，微量移液器(Thermo)；
2.DNA提取
按照植物基因組試劑盒提供的方法提取大豆、小麥、人工樣品1、人工樣品II基因組DNA,按照動物基因組試劑盒提供的方法提取天然牛乳基因組DNA ；
3.反應(yīng)體系:按照下表配方將相關(guān)試劑加入到熒光定量反應(yīng)管，設(shè)立待測樣品組(模
板為人工樣品提取的DNA溶液)，以?；蚪MDNA作為模板設(shè)定成陰性對照管，分別以大豆、
小麥提取的基因組DNA作為陽性對照；
【權(quán)利要求】
1.一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，其特征在于:包括以下步驟: 一、DNA提取 設(shè)計識別植物源性成分的特異性的引物和熒光探針，提取樣品基因組DNA，利用實時熒光定量PCR的方法進行鑒別判定， 所述特異性的引物的序列為: 上游引物 5 ' -GGATTGAGCCTTGGTATGGA-3 ' ； 下游引物 5 ' -TTTCGGAAAACAGGATTTGG-3 ' ； 所述探針序列為: 熒光探針 5 ' -CAAATTCAGAGAAACCCTGGA-3 ' ； 二、熒光定量PCR檢測 采用熒光定量PCR反應(yīng)體系總量為19.3-29.8 μ L，體系組成包括為熒光定量PCR反應(yīng)液12-13yL，濃度為IOymol的上游引物0.5_1.5yL，濃度為IOymol的下游引物.0.5-1.5 μ L，濃度為 10 μ mo I 的探針 0.3-0.8 μ L,模板 DNA1-3 μ L, ddH205_10 μ L,擴增程序為:將熒光定量PCR反應(yīng)體系中的各試劑加入到熒光定量八聯(lián)管，同時設(shè)立陰性對照管和陽性對照，置于實時熒光定量PCR儀，將控制溫度在94-96°C對熒光定量PCR反應(yīng)體系進行變性處理1-2 min，保持溫度在94-96°C變性處理5_10s，然后降低溫度至55_60°C進行退火處理25-35s，退火完畢后，升高溫度至72°C進行延伸處理25_50s，將上述的變性處理-退火處理-延伸處理三個步驟按上述的順序和工藝要求重復(fù)35-45個循環(huán)，根據(jù)不同熒光探針標(biāo)記在55-60°C結(jié)束開始收集熒光信號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，其特征在于:所述熒光探針 5 '端為 FAM、HEX、ROX、JOE、FAM、SYBR Green 1、TET、Cy3、Cy5 或 VIC熒光物質(zhì)標(biāo)記，所述熒光探針3 ’端可以連接TAMRA或BHQ熒光淬滅劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種原料乳及牛奶中植物源性蛋白成分鑒別方法，其特征在于:所述植物源成分為大豆、小麥、水稻或玉米。
【文檔編號】C12Q1/68GK103614469SQ201310586454
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月20日
【發(fā)明者】邵彪, 黃偉東, 陳剛, 丁紅梅, 季葛振, 王振濤 申請人:南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所