骨髓細胞培養(yǎng)終止液及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種醫(yī)學檢驗領(lǐng)域中用于染色體核型分析的骨髓細胞培養(yǎng)終止液及應(yīng)用。其中培養(yǎng)終止液包括溴化乙錠和秋水仙胺。在終止細胞培養(yǎng)時加入一定量的溴化乙錠可以使分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，具有省時、省力的優(yōu)勢，且準確性更高，在醫(yī)學檢驗領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】骨髓細胞培養(yǎng)終止液及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種醫(yī)學檢驗領(lǐng)域中用于染色體核型分析的骨髓細胞培養(yǎng)終止液及應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]G顯帶因為染色體主要是被Giemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)(bandingtechnique)。本世紀70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，且在眾多的顯帶技術(shù)中(Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶)，G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標本經(jīng)胰蛋白酶、NaOH、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色,可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋,這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細微的結(jié)構(gòu)畸變。
[0005]近年來，隨著分子生物學與細胞遺傳學的發(fā)展，骨髓染色體核型分析在血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療和預后中發(fā)揮了越來越重要的作用。骨髓染色體的制備因骨髓中有大量脂肪顆粒的干擾，骨髓中各種細胞系的細胞周期不固定，不統(tǒng)一，難以區(qū)別對待而使得骨髓染色體分裂指數(shù)低，染色體短粗，分散度差，且成本較高。
[0006]因此，建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓G帶制作方法尤為重要。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的存在的問題，本發(fā)明提供了一種骨髓細胞培養(yǎng)終止液，包括溴化乙錠和秋水仙胺，其中，溴化乙錠濃度為1.5~5.5mg/ml，秋水仙胺濃度為8~15 μ g/mlο
[0009]進一步地，溴化乙錠濃度為3mg/ml，秋水仙胺濃度為12 μ g/ml。
[0010]進一步地，溴化乙錠的配制方法如下:
a.配制儲藏液(9mg/ml)
在100ml蒸餾水中加入0.9g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫；
b.配制工作液(3mg/ml)
儲藏液以1:2 (EB:ddH20)的比例稀釋成濃度為3mg/ml的工作液。
[0011]進一步地，秋水仙胺的配制方法如下:
a.配制儲藏液(120 μ g/ml)稱取12 mg秋水仙胺，加入8.5g/L NaCl溶液lOOmL，待完全溶解后，經(jīng)5.516 X 104Pa(81bf/in2) 15min高壓蒸汽滅菌后避光保存于4°C冰箱中；
b.配制工作液(12 μ g/ml)
取120 μ g/ml秋水仙胺溶液lmL加入8.5g/L NaCl溶液9mL即為12 μ g/ml的工作液。
[0012]本發(fā)明還提供了所述的骨髓細胞培養(yǎng)終止液在骨髓染色體標本制作中的應(yīng)用，以培養(yǎng)基用量為5ml計，向培養(yǎng)基中加入50 μ 1的溴化乙錠和25 μ 1的秋水仙胺。
[0013]進一步地，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養(yǎng)基，搖晃均勻后37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱孵育1小時。
[0014]本發(fā)明的有益效果是:在終止細胞培養(yǎng)時加入一定量的溴化乙錠(EB)可以使染色體長度增加，使分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，具有省時、省力的優(yōu)勢，且準確性更高，在醫(yī)學檢驗領(lǐng)域具有更廣泛的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1是利用實驗組1所得染色體標本鏡檢結(jié)果。
[0016]圖2是利用實驗組2所得染色體標本鏡檢結(jié)果。
[0017]圖3是利用實驗組3所得染色體標本鏡檢結(jié)果。
[0018]圖4是利用對照組所得染色體標本鏡檢結(jié)果。
【具體實施方式】
[0019]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0020]實施例1配制骨髓細胞培養(yǎng)終止液
骨髓細胞培養(yǎng)終止液包括1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
[0021]其中所述溴化乙錠和秋水仙胺的配制方法可以采用本實施例所述的方法，也可以采用本領(lǐng)域其它的方法配制。
[0022]A配制溴化乙錠
a.配制儲藏液(濃度為9mg/ml)
在100ml蒸餾水中加入0.9g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。
[0023]b.配制工作液(濃度為3mg/ml)
儲藏液以1:2 (EB:ddH20)的比例稀釋成濃度為3mg/ml的工作液。
[0024] B配制秋水仙胺
a.配制儲藏液(濃度為120 μ g/ml)
稱取12 mg秋水仙胺，加入8.5g/L NaCl溶液100mL，待完全溶解后，經(jīng)5.516 X 104Pa(81bf/in2) 15min高壓蒸汽滅菌后避光保存于4°C冰箱中。
[0025]b.配制工作液(濃度為12 μ g /ml)
取120μ g/ml秋水仙胺溶液lmL加入8.5g/L NaCl溶液9mL即為12Pg/mL的秋水仙胺。
[0026]實施例2制備骨髓染色體標本
本實施例按如下方法制備骨髓細胞染色體標本。包括以下步驟:
(A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養(yǎng)基中；(B)終止培養(yǎng):將實施例1中所述的終止液加入到步驟(A)培養(yǎng)基中；
(C)收取骨髓細胞培養(yǎng)物，用于染色體制片；
(D)染色體標本制片:利用染料染色后獲得具有G顯帶的染色體標本。
[0027]在本實施例中以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ 1濃度為1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ 1濃度為8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
[0028]在本實施例中終止培養(yǎng)時，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養(yǎng)基，搖晃均勻后37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱孵育1小時。
[0029]其中將骨髓細胞以1~3X106個/ml的密度接種到骨髓培養(yǎng)基中，放入37°C，
5.0%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。所得骨髓培養(yǎng)物可用于骨髓染色體制片。
[0030]其中，收取骨髓細胞 培養(yǎng)物可按如下方法收集，也可按本領(lǐng)域常用的其它方法收集。
[0031](1)溫和的搖晃培養(yǎng)瓶，并將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入相應(yīng)的15ml離心管中。抒緊培養(yǎng)瓶蓋，并確保樣品沒有相混。1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml渦旋混勻。
[0032](2)低滲:加入10ml 37°C溫箱預熱的0.075M KC1溶液。渦旋或反復顛倒幾次使其與樣品混勻，37°C水浴孵育20~30min，期間將離心管左右搖晃三次以使細胞低滲均勻。
[0033](3)預固定:低滲結(jié)束后加入1ml的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，擰緊蓋子并反復顛倒三次。1,000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0034](4)將沉淀物渦旋混勻后，逐滴加入8ml新鮮固定液。
[0035](5)潤旋混勻后1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0036](6)混勻細胞沉淀后加入8ml新鮮固定液。
[0037](7)同 5 和 6。
[0038](8)潤旋混勻后1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留適量固定液，并加入數(shù)滴冰醋酸以制成濃度合適的細胞懸液，靜置15min后制片。
[0039]其中本實施例中的染色體標本制片方法如下:
a.玻片的準備:提前將玻片用1% HC1浸泡過夜，用大量的清水進行沖洗后浸于95%乙醇中備用。使用前將浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8°C冰箱中待用。
[0040]b.滴片:吸取細胞懸液后，將滴管置于一定的高度，滴4-5滴細胞懸液于玻片上，使細胞向玻片標記端遠側(cè)流動。適當過火，幫助染色體分散。一般一個病人滴片1-2張。
[0041]c.烤片老化:置于60°C烤箱中烘烤過夜或80°C烘烤1小時。
[0042]d.配制胰酶:新鮮配制50ml 0.3%胰蛋白酶(用HANKS緩沖液稀釋)溶液置于染片缸中，37°C水浴箱中預熱半小時以上。胰蛋白酶和HANKS緩沖液均購自Invitrogen公司。
[0043]e.配制Giemsa染液:臨用時將Gimesa原液與pH6.8的磷酸緩沖液按照1:20混合使用。具體的配制方法可以按下列步驟的a和b，也可按本領(lǐng)域常用的其它方法配制。
[0044]a.制備貯備液
Giemsa 粉lg
純甘油66ml
甲醇66ml
先將Giemsa粉置于研缽中加少量甘油，充分研磨，呈無顆粒的糊狀，再將全部甘油加入，放入56°C溫箱中2小時，然后加入甲醇，保存于棕色瓶中；一般兩周后使用為好；
b.制備工作液
臨用時將a步驟中的貯備液與pH6.8的磷酸緩沖液按照1:20混合。
[0045]f.用胰酶消化染色后用于染色體核型分析。
[0046]實施例3對比實驗
取同一樣本經(jīng)培養(yǎng)后的骨髓細胞，進行對比實驗。采用實施例1和實施例2的方法設(shè)立實驗組1、實驗組2和實驗組3，三組實驗組分別采用不同濃度的細胞培養(yǎng)終止液，其中:實驗組1的終止液配方為: 溴化乙錠1.5mg/ml
秋水仙胺8 μ g/ml
實驗組2的終止液配方為:
溴化乙錠5.5mg/ml
秋水仙胺15 μ g/ml
實驗組3的終止液配方為:
溴化乙錠3mg/ml
秋水仙胺12 μ g/ml
設(shè)立對照組，其中:
對照組的終止液配方為:
秋水仙胺12 μ g/ml
對照組制備骨髓細胞染色體標本的步驟包括:(A)接種:將骨髓細胞接種到骨髓細胞培養(yǎng)基中；(B)終止培養(yǎng):將終止液加入到步驟(A)培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入25μ 1的秋水仙胺；(C)收取骨髓細胞培養(yǎng)物，用于染色體制片；(D)染色體標本制片:利用染料染色后獲得具有G顯帶的染色體標本。
[0047]在鏡下觀察制片結(jié)果。使用的顯微鏡型號為:Leica DM2500。圖1至圖4分別是實驗組1、實驗組2、實驗組3和對照組的鏡檢結(jié)果圖。從圖1至3的鏡檢照片中很清晰地看到，使用本發(fā)明方法進行G帶顯色，分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰，因而診斷時，更加省時省力，診斷結(jié)果更加準確。
【權(quán)利要求】
1.一種骨髓細胞培養(yǎng)終止液，包括溴化乙錠和秋水仙胺，其中，溴化乙錠濃度為1.5~5.5mg/ml,秋水仙胺濃度為8~15 μ g/ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)終止液，其特征在于，溴化乙錠濃度為3mg/ml，秋水仙胺濃度為12 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)終止液，其特征在于，溴化乙錠的配制方法如下:a.配制儲藏液在100ml蒸餾水中加入0.9g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫；b.配制工作液儲藏液以1:2 (EB:ddH20)的比例稀釋成濃度為3mg/ml的工作液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞培養(yǎng)終止液，其特征在于，秋水仙胺的配制方法如下:a.配制儲藏液稱取12 mg秋水仙胺，加入8.5g/L NaCl溶液100mL,待完全溶解后，經(jīng)5.516X 104Pa(81bf/in2) 15min高壓蒸汽滅菌后避光保存于4°C冰箱中；b.配制工作液取120 μ g/ml秋水仙胺溶液lmL加入8.5g/L NaCl溶液9mL即為12 μ g/ml的工作液。
5.權(quán)利要求1至4之一所述的骨髓細胞培養(yǎng)終止液在骨髓染色體標本制作中的應(yīng)用，其特征在于，以培養(yǎng)基用量為5ml計，向培養(yǎng)基中加入50 μ 1的溴化乙錠和25 μ 1的秋水仙胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，將溴化乙錠和秋水仙胺加入培養(yǎng)基，搖晃均勻后37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱孵育1小時。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667458SQ201310591779
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】程建兵, 夏成青, 陳紅梅, 郭福曉, 生帥 申請人:武漢艾迪康醫(yī)學檢驗所有限公司