一種骨髓染色體g帶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制作骨髓染色體G帶的方法，包括在骨髓培養(yǎng)基中加入了人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，終止細(xì)胞培養(yǎng)時加入一定量的溴化乙錠。本發(fā)明的效果是：（1）分裂相更多，省時省力；（2）分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰；（3）分散度更加良好，便于分析；（4）異常染色體檢出率更高，診斷結(jié)果更加可靠。此種方法制作出的G帶用于骨髓染色體核型分析時，具有省時、省力的優(yōu)勢，且準(zhǔn)確性更高，具有更廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】一種骨髓染色體G帶的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種G帶的制作方法，用于進行骨髓染色體核型分析。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]G顯帶因為染色體主要是被Giemsa染料染色后而顯帶，故稱之為G顯帶技術(shù)，其所顯示的帶紋分布在整個染色體上。人們將用各種不同的方法，以及用不同的染料處理染色體標(biāo)本后，使每條染色體上出現(xiàn)明暗相間，或深淺不同帶紋的技術(shù)稱為顯帶技術(shù)(bandingtechnique)。本世紀(jì)70年代以來，顯帶技術(shù)得到了很大發(fā)展，且在眾多的顯帶技術(shù)中(Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶)，G帶是目前被廣泛應(yīng)用的一種帶型。
[0004]研究發(fā)現(xiàn)，人染色體標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶、NaOH、檸檬酸鹽或尿素等試劑處理后，再用Giemsa染色,可使每條染色體上顯示出深淺交替的橫紋,這就是染色體的G帶。每條染色體都有其較為恒定的帶紋特征，所以G顯帶后，可以較為準(zhǔn)確的識別每條染色體，并可發(fā)現(xiàn)染色體上較細(xì)微的結(jié)構(gòu)畸變。
[0005]近年來，隨著分子生物學(xué)與細(xì)胞遺傳學(xué)的發(fā)展，骨髓染色體核型分析在血液系統(tǒng)疾病的診斷、治療和預(yù)后中發(fā)揮了越來越重要的作用。骨髓染色體的制備因骨髓中有大量脂肪顆粒的干擾，骨髓中各種細(xì)胞系的細(xì)胞周期不固定，不統(tǒng)一，難以區(qū)別對待而使得骨髓染色體分裂指數(shù)低，染色體短粗，分散度差，且成本較高。
[0006]因此，建立一種具有分裂相多、分散度好、帶紋清晰、長度適中等特征的骨髓G帶制作方法尤為重要。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種骨髓染色體G帶的制作方法，包括步驟:
(1)配置骨髓培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括:其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了青霉素/鏈霉素、胎牛血清和人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物；其中:
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，各添加成分的用量為:
青霉素/鏈霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物60-140 ul/ml
(2)接種:將骨髓細(xì)胞接種到步驟I所述的培養(yǎng)基中；
(3)終止培養(yǎng):將溴化乙錠和秋水仙胺加入到步驟2所述的培養(yǎng)基中；
(4)收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物；
(5)染色體標(biāo)本制片:利用染料染色后獲得具有G顯帶的骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本。[0009]進一步地，青霉素選自10000U/ml，鏈霉素選自10000 μ g/ml。
[0010]進一步地，所述各添加成分用量為:
青霉素/鏈霉素8ul/ml
胎牛血清96 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物96 ul/ml
進一步地，將骨髓細(xì)胞以I~3X106個/ml的密度接種到所述的骨髓培養(yǎng)基中，放入370C，5.0%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。
[0011]進一步地，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
[0012]進一步地，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺。
[0013]進一步地，培養(yǎng)基中加入溴化乙錠和秋水仙胺，搖晃均勻后37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱孵育I小時。
[0014]進一步地，收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物的方法包括:
(O離心獲得骨髓細(xì)胞；
(2)將步驟(1)中的骨髓細(xì)胞進行低滲處理；
(3)將步驟(2)中的骨髓細(xì)胞用固定液進行預(yù)固定；` (4)將步驟(3)中的骨髓細(xì)胞用固定液固定；
(5 )將固定后的骨髓細(xì)胞制成濃度適中的懸液用于G帶制片。
[0015]進一步地，染色體制片的方法包括:
a.玻片的準(zhǔn)備；
b.滴片；
c.烤片老化；
d.配制消化液
e.配制染色液； f.制片。
[0016]進一步地，所述的染色液的染料為Giemsa。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
一、本發(fā)明在傳統(tǒng)的骨髓培養(yǎng)基中加入了人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物可以為骨髓細(xì)胞提供更多的營養(yǎng)物，包括生長因子等，因而培養(yǎng)出的細(xì)胞制取出的G帶背景更加清晰、骨髓染色體分裂相多、形態(tài)及分散度更加良好。
[0018]二、終止細(xì)胞培養(yǎng)時加入一定量的溴化乙錠可以使染色體長度增加，帶紋更加清晰。
[0019]
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1是實驗組I骨髓染色體G帶顯色的鏡下G帶圖譜。
[0021]圖2是實驗組2骨髓染色體G帶顯色的鏡下G帶圖譜。
[0022]圖3是實驗組3骨髓染色體G帶顯色的鏡下G帶圖譜。[0023]圖4是對照組I骨髓染色體G帶顯色的鏡下G帶圖譜。
[0024]圖5是2000例骨髓樣品各種病例所占比率。
[0025]圖6是分別利用本發(fā)明方法(實驗組4)和現(xiàn)有技術(shù)(對照組2)方法，對2000例骨髓樣品進行G帶顯色，鏡下觀察能達到20個良好分裂相的檢測結(jié)果。
[0026]圖7是分別利用本發(fā)明方法(實驗組4)和現(xiàn)有技術(shù)(對照組2)方法，對2000例骨髓樣品進行G帶顯色，異常染色體檢測結(jié)果。
[0027]圖8是分別利用本發(fā)明方法(實驗組4)和現(xiàn)有技術(shù)(對照組2)方法，對其中一例病例(隨機抽取)進行G帶顯色的鏡下G帶圖譜對照。其中A系列是本發(fā)明方法，B系列是對照組方法。
[0028]
【具體實施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0030]實施例1配制骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了青霉素/鏈霉素，胎牛血清和人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物。其中基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基。
[0031]所述各添加成分的用量如下:
青霉素/鏈霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物60-140 ul/ml
其中，青霉素可選自10000U/ml，鏈霉素可選自10000yg/ml。在其它實施方式中，可選自其它濃度青霉素和鏈霉素用于配制培養(yǎng)基。
[0032]其中，人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物可以按現(xiàn)有的各種方法獲得或制備，在本實施例中，按以下方法制取:細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇和傳代，當(dāng)傳代細(xì)胞培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時，收集細(xì)胞并離心,離心后,收集上清并過濾得細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0033]更具體的制取人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物的方法包括以下步驟: a.將超凈臺用新潔爾滅擦拭干凈，紫外線照射30分鐘。
[0034]b.從液氮罐中取出凍存管，立即放入37°C水浴搖動促其內(nèi)容物2分鐘內(nèi)迅速融化。
[0035]c.將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入IOml含9.6%胎牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基中，37°C，5%C02培養(yǎng)。
[0036]d.當(dāng)細(xì)胞達到約50%的融合率時，加入4ml的胰蛋白酶(含EDTA)，確保細(xì)胞培養(yǎng)
瓶底部覆蓋一薄層胰蛋白酶。
[0037]e.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱孵育5min，鏡檢，如果所有細(xì)胞都已脫落，加入IOml的培養(yǎng)基，并用移液管將細(xì)胞沖散。
[0038]f.然后再加入30ml新鮮培養(yǎng)基，將細(xì)胞懸液一傳四，轉(zhuǎn)入含有IOml培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和地混勻細(xì)胞。
[0039]g.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱中(擰松瓶蓋)，當(dāng)細(xì)胞密度達到大約50%融合率時，更換培養(yǎng)基，至終濃度40ml左右。
[0040]h.當(dāng)培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時準(zhǔn)備收集。用血清移液管將培養(yǎng)好的細(xì)胞轉(zhuǎn)入50ml圓底聚丙乙烯離心管中(貼上相應(yīng)標(biāo)簽)，2000 rpm離心lOmin。
[0041]1.收集上清液，并經(jīng)0.22 μ m無菌濾器過濾(收集時切勿碰到細(xì)胞沉淀)，即為人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物。如果不使用可將過濾后的培養(yǎng)物儲存于_20°C。
[0042]實施例2骨髓染色體提取試劑盒
骨髓染色體提取試劑盒包括試劑1、試劑2、試劑3和試劑4組成的液體型試劑。
[0043]其中試劑I為骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基，按實施例1所述方法配制，試劑I包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各添加成分，所述的各添加成分用量為:
青霉素/鏈霉素5-15ul/ml
胎牛血清60-140 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物60-140 ul/ml 優(yōu)選的，試劑I包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各添加成分，所述的各添加成分用量為:
青霉素/鏈霉素7-12ul/ml
胎牛血清80-120 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物80-120 ul/ml
更優(yōu)選的，試劑I包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和各添加成分，所述的各添加成分用量為:
青霉素/鏈霉素8ul/ml
胎牛血清96 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物96 ul/ml
其中，所述的基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以為RPMI1640培養(yǎng)基。
[0044]試劑2的成分及濃度范圍為:
溴化乙淀1.5~5.5mg/ml。
[0045]優(yōu)選的，溴化乙錠的濃度為2.5~4.5mg/ml。
[0046]更優(yōu)選的，溴化乙錠的濃度為3 mg/ml。
[0047]其中所述溴化乙錠的配制方法可以采用本實施例所述的方法，也可以采用本領(lǐng)域其他的方法配制。
[0048]A配制溴化乙錠(EB)
a.配制儲藏液(濃度為9mg/ml)
在100ml蒸餾水中加入0.9g溴化乙錠，磁力攪拌數(shù)小時以確保其完全溶解，然后用鋁箔包裹容器或轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，保存于室溫。
[0049]b.配制工作液(濃度為3mg/ml)
儲藏液以1:2 (EBiddH2O)的比例稀釋成濃度為3mg/ml的工作液。
[0050]
試劑3的成分及濃度范圍為:
秋水仙胺8~15yg/ml。
[0051]優(yōu)選的，秋水仙胺的濃度為10~13 μ g/ml。
[0052]更優(yōu)選的，秋水仙胺的濃度為12 μ g/ml。
[0053]其中所述秋水仙胺的配制方法可以采用本實施例所述的方法，也可以采用本領(lǐng)域其它的方法配制。
[0054]B配制秋水仙胺a.配制儲藏液(濃度為120 μ g/ml)
稱取12 mg秋水仙胺，加入8.5g/L NaCl溶液lOOmL，待完全溶解后，經(jīng)5.516 X IO4Pa(81bf/in2) 15min高壓蒸汽滅菌后避光保存于4°C冰箱中。
[0055]b.配制工作液(濃度為12 μ g /ml)
取120μ g/ml秋水仙胺溶液ImL加入8.5g/L NaCl溶液9mL即為12Pg/mL的秋水仙胺。
[0056]試劑4的成分及濃度范圍為:
氯化鉀0.050 ~0.090mol/Lo
[0057]優(yōu)選的，氯化鉀濃度為0.060~0.080mol/L。
[0058]更優(yōu)選的，氯化鉀濃度為0.075mol/L。
[0059]實施例3骨髓細(xì)胞培養(yǎng)及染色體標(biāo)本的制備
本實施例按如下方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞及染色體制片。在其它實施方式中，也可采用其它方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞和染色體制片。本實施例所述方法為:
(O配置骨髓培養(yǎng)基:按實施例1的方法配制；
(2)接種:將骨髓細(xì)胞接種到步驟I所述的培養(yǎng)基中；
(3)終止培養(yǎng)；
(4)收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物，用于染色體制片；` (5)染色體標(biāo)本制片:利用染料染色后獲得具有G顯帶的染色體標(biāo)本。
[0060]培養(yǎng)骨髓細(xì)胞和染色體提取所需的培養(yǎng)基和試劑可以選用本實施例2所述的骨髓染色體提取試劑盒，也可以按實施例1和實施例2中所述的方法自行配制。
[0061]其中步驟2接種可以采用將骨髓細(xì)胞以I~3X IO6個/ml的密度接種到骨髓培養(yǎng)基中，放入37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。還可以采用其它適合骨髓細(xì)胞生長的方式選擇接種的密度和培養(yǎng)條件。
[0062]其中步驟3終止培養(yǎng)中，每個培養(yǎng)瓶(含5ml骨髓培養(yǎng)基)中加入一定量的溴化乙錠(例如試劑盒中的試劑2)和秋水仙胺(例如試劑盒中的試劑3)，搖晃均勻后37°C，5.0%培養(yǎng)箱孵育I小時。
[0063]其中步驟4收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物可按如下方法收集，也可按本領(lǐng)域常用的其它方法收集。
[0064](I)溫和的搖晃培養(yǎng)瓶，并將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入相應(yīng)的15ml離心管中。抒緊培養(yǎng)瓶蓋，并確保樣品沒有相混。1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml渦旋混勻。
[0065](2)低滲:加入IOml 37°C溫箱預(yù)熱的0.075M KCl溶液(試劑4)。渦旋或反復(fù)顛倒幾次使其與樣品混勻，37°C水浴孵育20-30min，期間將離心管左右搖晃三次以使細(xì)胞低滲均勻。
[0066](3)預(yù)固定:低滲結(jié)束后加入Iml的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)，擰緊蓋子并反復(fù)顛倒三次。I, 000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0067](4)將沉淀物渦旋混勻后，逐滴加入8ml新鮮固定液。
[0068](5)潤旋混勻后I, 000 rpm離心IOmin0吸去上清液，留下約0.5到1.0 ml。
[0069](6)混勻細(xì)胞沉淀后加入8ml新鮮固定液。
[0070](7)同 5 和 6。[0071](8)潤旋混勻后1，000 rpm離心lOmin。吸去上清液，留適量固定液,并加入數(shù)滴(3~5滴)冰醋酸以制成濃度合適的細(xì)胞懸液，靜置15min后制片。
[0072]其中本實施例中的染色體標(biāo)本制片方法如下，在其它實施例中，而可采用其它的染色方法。本實施例所述的染色體制片的方法為:
a.玻片的準(zhǔn)備:提前將玻片用1% HCl浸泡過夜，用大量的清水進行沖洗后浸于95%乙醇中備用。使用前將浸泡的玻片取出，用大量清水清洗后放置于2-8°C冰箱中待用。
[0073]b.滴片:吸取細(xì)胞懸液后，將滴管置于一定的高度，滴4-5滴細(xì)胞懸液于玻片上，使細(xì)胞向玻片標(biāo)記端遠(yuǎn)側(cè)流動。適當(dāng)過火，幫助染色體分散。一般一個病人滴片1-2張。
[0074]c.烤片老化:置于60°C烤箱中烘烤過夜或80°C烘烤I小時。
[0075]d.配制胰酶:新鮮配制50ml 0.3%胰蛋白酶(用HANKS緩沖液稀釋)溶液置于染片缸中，37°C水浴箱中預(yù)熱半小時以上。胰蛋白酶和HANKS緩沖液均購自Invitrogen公司。
[0076]e.配制Giemsa染液:臨用時將Gimesa原液與pH6.8的磷酸緩沖液按照1:20混合使用。
[0077]f.用胰酶消化染色后用于染色體核型分析。
[0078]實施例4對 比實驗I
取同一樣本的骨髓細(xì)胞，進行對比實驗。按照實施例1和實施例2的方法配制三組培養(yǎng)基及染色體提取試劑，分別設(shè)置實驗組1、實驗組2、實驗組3。三組實驗組在細(xì)胞終止培養(yǎng)中均加入了溴化乙錠。設(shè)立對照組I進行骨髓培養(yǎng)，所述對照組I為常規(guī)培養(yǎng)基即不含人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物,并且細(xì)胞終止培養(yǎng)時沒有添加溴化乙錠。
[0079]其中:
實驗組I的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素5ul/ml
胎牛血清60ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物60 ul/ml
按實施例3所述方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞及制備染色體標(biāo)本。其中實驗組I在步驟(3)終止培養(yǎng)中，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為1.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為8 μ g/ml的秋水仙胺；
實驗組2的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素15ul/ml
胎牛血清140 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物140 ul/ml
按實施例3所述方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞及制備染色體標(biāo)本。其中實驗組2在步驟(3)終止培養(yǎng)中，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為5.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為15 μ g/ml的秋水仙胺；
實驗組3的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素lOul/ml胎牛血清100 ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物90 ul/ml
按實施例3所述方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞及制備染色體標(biāo)本。其中實驗組3在步驟(3)終止培養(yǎng)中，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺；
對照組I的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素lOul/ml
胎牛血清100 ul/ml
對照組培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的方法同實驗組，只是對照組所用的培養(yǎng)基中不含人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物。制備染色體標(biāo)本的方法同實驗組，只是對照組在細(xì)胞終止培養(yǎng)時沒有添加溴化乙錠。
[0080]在鏡下觀察制片結(jié)果。使用的顯微鏡型號為:Leica DM2500。圖1至圖4分別是實驗組1、實驗組2、實驗組3和對照組I的鏡檢結(jié)果圖。從圖1至3的鏡檢照片中很清晰地看到，使用本發(fā)明方法進行G帶顯色，分裂相中染色體的長度更長，帶紋更加清晰；分散度更加良好。而圖4對照組的鏡檢照片中，染色體長度較短，分散度較差，因而帶紋較模糊。
[0081]實施例5對比實驗2
在對2000例骨髓標(biāo)本進行檢測的`對比實驗中，利用本發(fā)明所述實施例1至實施例3設(shè)立實驗組4，同時設(shè)立對照組2，其中所述對照組的培養(yǎng)基中不含有人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物，并且終止培養(yǎng)時不添加溴化乙錠。
[0082]實驗組4的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素8ul/ml
胎牛血清96ul/ml
人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物96 ul/ml
按實施例3所述方法培養(yǎng)骨髓細(xì)胞及制備染色體標(biāo)本。其中實驗組4在步驟(3)終止培養(yǎng)中，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50 μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺；
對照組2的骨髓細(xì)胞培養(yǎng)基配方為:
基礎(chǔ)培養(yǎng)基:RPMI1640培養(yǎng)基
青霉素/鏈霉素lOul/ml
胎牛血清100 ul/ml
對照組培養(yǎng)骨髓細(xì)胞的方法同實驗組，只是對照組所用的培養(yǎng)基中不含人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物。制備染色體標(biāo)本的方法同實驗組，只是對照組在細(xì)胞終止培養(yǎng)時沒有添加溴化乙錠。
[0083]經(jīng)醫(yī)學(xué)判斷，隨機選取的2000例骨髓標(biāo)本其疾病癥狀的分布情況(見表1 )，圖5是2000例不同疾病所占的比例。其中，CLL代表慢性淋巴細(xì)胞白血病，ALL代表急性淋巴細(xì)胞白血病，AA代表再生障礙性貧血，MDS代表骨髓增生異常綜合癥，AML代表急性髓系白血病，MPD代表骨髓增殖性疾病，MM代表多發(fā)性骨髓瘤，Others代表淋巴瘤等。[0084]表1:2000例骨髓標(biāo)本中各種疾病癥狀的病例數(shù)
【權(quán)利要求】
1.一種骨髓染色體G帶的制作方法，包括步驟: (1)配置骨髓培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括:其在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加了青霉素/鏈霉素、胎牛血清和人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物；其中: 所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，各添加成分的用量為: 青霉素/鏈霉素5-15ul/ml 胎牛血清60-140 ul/ml 人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物60-140 ul/ml (2)接種:將骨髓細(xì)胞接種到步驟I所述的培養(yǎng)基中； (3)終止培養(yǎng):將溴化乙錠和秋水仙胺加入到步驟2所述的培養(yǎng)基中； (4)收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物； (5)染色體標(biāo)本制片:利用染料染色后獲得具有G顯帶的骨髓細(xì)胞染色體標(biāo)本。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，青霉素選自10000U/ml，鏈霉素選自10000 μ g/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述 的制作方法，其特征在于，所述各添加成分用量為: 青霉素/鏈霉素8ul/ml 胎牛血清96 ul/ml 人類淋巴瘤細(xì)胞培養(yǎng)物96 ul/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，將骨髓細(xì)胞以I~3XIO6個/ml的密度接種到所述的骨髓培養(yǎng)基中，放入37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50μ I濃度為1.5~5.5mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為8~15 μ g/ml的秋水仙胺。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制作方法，其特征在于，以培養(yǎng)基用量為5ml計，加入50μ I濃度為3mg/ml的溴化乙錠和25 μ I濃度為12 μ g/ml的秋水仙胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，培養(yǎng)基中加入溴化乙錠和秋水仙胺，搖晃均勻后37°C，5.0%C02培養(yǎng)箱孵育I小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，收取骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物的方法包括: (O離心獲得骨髓細(xì)胞； (2)將步驟(1)中的骨髓細(xì)胞進行低滲處理； (3)將步驟(2)中的骨髓細(xì)胞用固定液進行預(yù)固定； (4)將步驟(3)中的骨髓細(xì)胞用固定液固定； (5 )將固定后的骨髓細(xì)胞制成濃度適中的懸液用于G帶制片。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，染色體制片的方法包括: a.玻片的準(zhǔn)備； b.滴片； c.烤片老化； d.配制消化液 e.配制染色液； f.制片。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制作方法，其特征在于，所述的染色液的染料為Giemsa。
【文檔編號】C12Q1/68GK103710434SQ201310592341
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】程建兵, 夏成青, 陳紅梅, 郭福曉, 生帥 申請人:長沙艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司