一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法。將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒，借助病毒質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)的復制過程實現(xiàn)核衣殼的生物素化，繼而采用偶聯(lián)有鏈霉親和素的量子點實現(xiàn)對包膜病毒核衣殼的標記。本發(fā)明無需通過劇烈的化學反應改造和標記病毒，有利于保持病毒本身的侵染活性，且包膜病毒內(nèi)部核衣殼的標記不影響包膜病毒表面及其對細胞的識別。本發(fā)明可應用于病毒侵染機理研究及與病毒相關(guān)的疾病治療研究。
【專利說明】一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于化學和生物醫(yī)學領(lǐng)域，涉及一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0003]病毒侵染細胞機制研究對預防和治療病毒引起的疾病至關(guān)重要，對活病毒的熒光標記可以為研究病毒侵染機制提供重要基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的熒光標記物往往存在易光漂等缺點，而半導體熒光量子點具有獨特的光學性能，如熒光量子產(chǎn)率高、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄等，因此近年來出現(xiàn)了許多采用量子點標記病毒的方法。包膜病毒廣泛存在于自然界并且與人類健康密切相關(guān)，因此在相關(guān)研究中受到極大關(guān)注。然而，目前還只能實現(xiàn)量子點對包膜病毒表面包膜的標記，可能干擾病毒對細胞受體的識別及影響病毒的侵染活性，因此采用量子點標記包膜病毒內(nèi)部的核衣殼是一種更優(yōu)選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法。
[0005]本發(fā)明利用包膜病毒基因組允許外源基因插入和在宿主細胞內(nèi)自我復制的特點，構(gòu)建了重組病毒基因組質(zhì)粒。將這種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染其宿主細胞，核衣殼能夠在病毒組裝過程中被生物素化并出芽帶上包膜，從而獲得帶有生物素化核衣殼的重組包膜病毒。利用生物素和鏈霉親和素的相互作用，用偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點標記重組病毒，實現(xiàn)量子點對活包膜病毒核衣殼的標記(如圖1所示)。
[0006]本發(fā)明方法具體包括如下步驟:
1.將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒；
2.用重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞，細胞全部出現(xiàn)病變時收集細胞上清液并純化和濃縮得到重組病毒；
3.將重組病毒與細胞裂解液孵育至病毒液開始由渾濁變澄清，得到脫去部分包膜的病
毒；
4.將偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點與部分脫膜的重組病毒孵育以標記病毒，純化得到核衣殼標記了量子點的包膜病毒。
[0007]對標記了量子點的病毒的純化通過蔗糖密度梯度離心實現(xiàn)。
[0008]所述的酶序列為BirA酶序列。
[0009]本發(fā)明的實施例中，使用的包膜病毒為桿狀病毒，宿主細胞為Sf9細胞。
[0010]將濃縮的重組桿狀病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液中孵育15min,得到脫去部分包膜的桿狀病毒。[0011]將2 nM偶聯(lián)有鏈霉未和素的量子點(SA-QDs)與脫去部分包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘，即可實現(xiàn)量子點對重組桿狀病毒核衣殼的標記。
[0012]本發(fā)明借助病毒在宿主細胞內(nèi)的自我復制過程實現(xiàn)病包膜毒核衣殼的生物素化，繼而用偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點進行反應，從而實現(xiàn)了量子點對包膜病毒核衣殼的標記。所構(gòu)建的重組病毒可以作為毒種長期保存，通過簡單擴增就可以得到子代病毒并直接用于標記。與其它的包膜病毒標記方法相比，本發(fā)明方法更加溫和，無需通過劇烈的化學反應改造和標記病毒，保持了包膜病毒本身的侵染活性，且病毒內(nèi)部核衣殼的標記不干擾包膜病毒表面對細胞受體的識別，有利于病毒對細胞的侵染過程的研究。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為量子點標記病毒核衣殼的流程不意圖。
[0014]圖2為證明病毒核衣殼被生物素化的western blot圖。
[0015]圖3為重組桿狀病毒被標記上量子點(A)及野生型病毒未被標記上量子點(B)的透射電子顯微鏡圖，標尺為100 nm。
[0016]圖4為標記了量子點的重組桿狀病毒QDs-RBV和野生型桿狀病毒W(wǎng)BV的一步生長曲線比較圖。
[0017]圖5為吸附在細胞表面的病毒與量子點的免疫熒光共定位圖,標尺為10 μ mo【具體實施方式】
[0018]以下實施例僅用于進一步說明本發(fā)明，但不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0019]實施例1量子點標記重組桿狀病毒核衣殼
下面以桿狀病毒核衣殼的量子點標記為例，對本發(fā)明方法進行詳細的說明。
[0020]一、方法
1.重組桿狀病毒質(zhì)粒的構(gòu)建:利用桿狀病毒表達系統(tǒng)，在桿狀病毒全基因組里同時插入VP39AP序列(融合了生物素受體肽AP序列的桿狀病毒衣殼蛋白VP39序列)和能夠催化AP生物素化的BirA酶序列，從而得到具有重組桿狀病毒全基因組的質(zhì)粒。
[0021]2.獲得純化的重組桿狀病毒RBV:用轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主Sf9細胞中，72小時后細胞全部出現(xiàn)病變時收集細胞上清液，4° C下通過15 min的5000 rpm離心獲得第一代重組桿狀病毒。用第一代重組桿狀病毒侵染Sf9細胞,72小時后將所得上清液重復上述離心獲得第二代病毒。用第二代病毒侵染Sf9細胞,72小時后將所得上清液重復上述離心、0.45 μ m濾膜過濾及2小時的100000 g超速離心，獲得純化后的濃縮病毒。
[0022]3.脫去病毒部分包膜:在濃縮的重組桿狀病毒溶液中加入含有0.8% (質(zhì)量比)NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液，孵育15min病毒液開始由渾濁變澄清時立即用150000 g超速離心I小時。用10 mM pH 7.0的PBS緩沖溶液重懸，得到脫去部分包膜的重組桿狀病毒。
[0023]4.量子點標記重組桿狀病毒核衣殼:將2 nM偶聯(lián)有鏈霉未和素的量子點(SA-QDs)與部分脫去包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘后，加入到w/v分別為65%、55%、45%、35%、25%、15%的蔗糖梯度中，進行3小時120000 g的超速離心。將收集的病毒條帶溶解在PBS緩沖溶液中，再在120000 g下超速離心45分鐘除去殘余的蔗糖，得到純化的核衣殼上標記了量子點的重組桿狀病毒QDs-RBV。
[0024]二、結(jié)果
1.RBV的western blot表征:在本發(fā)明中，重組桿狀病毒RBV通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒而獲得。采用桿狀病毒衣殼蛋白VP39的抗體進行western blot實驗，結(jié)果顯示重組桿狀病毒RBV樣品同時在41KDa (VP39AP的大小)和39KDa (VP39的大小)處出現(xiàn)條帶(圖2A)，但野生型桿狀病毒W(wǎng)BV樣品僅在41KDa (VP39AP的大小)處出現(xiàn)條帶(圖2A);采用鏈霉親和素標記的堿性磷酸酶進行western blot實驗,僅重組桿狀病毒RBV樣品在41KDa處出現(xiàn)條帶(圖2B)，表明重組桿狀病毒RBV的核衣殼被成功生物素化。 [0025]2.QDs-RBV的透射電子顯微鏡表征:為了更直觀地證明RBV被標記上量子點，采用透射電子顯微鏡對經(jīng)量子點標記的重組桿狀病毒RBV (QDs-RBV)和與量子點孵育的野生型桿狀病毒(WBV)進行了觀察。結(jié)果表明量子點被連接在重組桿狀病毒RBV上(圖3A)，而WBV不能被量子點標記(圖3B)，說明生物素化的重組桿狀病毒核衣殼能夠被量子點標記，且該標記是特異性的。
[0026]3.一步生長曲線表征:將QDs-RBV以感染復數(shù)M0I=5感染Sf9細胞，分別收集感染不同時間后的細胞上清液，采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50 )方法測定每個上清液的滴度。以每個時間點平行測定三次的平均值作為縱坐標，時間點為橫坐標繪制一步生長曲線，對野生型病毒W(wǎng)BV以相同操作繪制一步生長曲線作為對照(圖4)。結(jié)果顯示QDs-RBV與WBV的生長動力學行為一致,表明本發(fā)明方法能夠保持病毒本身的侵染特性。
[0027]4.標記可靠性及標記效率的表征:為了進一步證明本發(fā)明方法能夠?qū)崿F(xiàn)對病毒核衣殼的標記，將感染復數(shù)M0I=5的QDs-RBV與Sf9細胞孵育并采用免疫熒光共定位實驗進行觀察。圖5顯示，QDs-RBV樣品中量子點與病毒核衣殼蛋白VP39的共定位效率達到94%，而對照組WBV中沒有量子點與VP39共定位現(xiàn)象，表明量子點被標記到了生物素化的重組桿狀病毒核衣殼上，且該標記具有很強的特異性和很高的標記效率。
【權(quán)利要求】
1.一種量子點標記包膜病毒核衣殼的方法，其特征在于，包括如下步驟: 1)將融合了生物素受體肽序列的衣殼蛋白序列和催化受體肽生物素化的酶序列同時插入到病毒全基因組，得到重組病毒質(zhì)粒； 2)用重組病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞，細胞全部出現(xiàn)病變時收集細胞上清液并純化和濃縮得到重組病毒； 3)將重組病毒與細胞裂解液孵育至病毒液開始由渾濁變澄清，得到脫去部分包膜的病毒; 4)將偶聯(lián)有鏈酶親和素的量子點與部分脫膜的重組病毒孵育以標記病毒，純化得到核衣殼標記了量子點的包膜病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，對標記了量子點的病毒的純化通過蔗糖密度梯度離心實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的酶序列為BirA酶序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述包膜病毒為桿狀病毒，宿主細胞為Sf9細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，將濃縮的重組桿狀病毒在含有0.8% NP40的10 mM pH 8.5的Tris緩沖溶液中孵育15 min，得到脫去部分包膜的桿狀病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，將2nM偶聯(lián)有鏈霉親和素的量子點與脫去部分包膜的重組桿狀病毒在4° C下孵育30分鐘,實現(xiàn)量子點對重組桿狀病毒核衣殼的標記。
【文檔編號】C12N7/01GK103555681SQ201310592905
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】龐代文, 文莉, 林毅, 張志凌, 王漢中 申請人:武漢大學