一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，屬于生物發(fā)酵和生物分離工程領(lǐng)域。本發(fā)明公開的一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，首先配置液體發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌、冷卻；往冷卻后的培養(yǎng)基內(nèi)接入無花果曲霉孢子懸液進(jìn)行液體發(fā)酵，制得無花果曲霉胞內(nèi)單寧酶；發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進(jìn)行無花果曲霉細(xì)胞破壁，離心收集粗酶液；對(duì)離心后的粗酶液進(jìn)行單寧酶純化。本發(fā)明采用液體發(fā)酵能制備胞內(nèi)單寧酶，發(fā)酵條件較好控制，不易污染雜菌，生產(chǎn)效率高，能隨時(shí)檢測酶活力，且檢測過程中雜質(zhì)干擾小。采用液體發(fā)酵方式研究了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的單寧酶的性質(zhì)，為單寧酶的綜合開發(fā)提供參考。
【專利說明】一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，屬于生物發(fā)酵和生物分離工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單寧酶是一種誘導(dǎo)酶，由某些微生物在單寧酸等誘導(dǎo)物存在時(shí)誘導(dǎo)合成。單寧酶用途較廣，可用于皮革業(yè)、飼料業(yè)、化妝品液等方面，在開發(fā)茶飲業(yè)新產(chǎn)品和改善天然食品風(fēng)味方面尤受重視。能水解沒食子單寧中的酯鍵和縮酚羧鍵，生成沒食子酸和葡萄糖，也可以把沒食子酸和丙醇合成沒食子丙酯，還能水解茶葉中的酯型兒茶素，制備兒茶素單體，還可以作為食品添加劑用于開發(fā)茶飲料。中國是個(gè)茶葉大國，而且可開發(fā)的資源豐富，單寧酶的應(yīng)用前景十分廣泛。
[0003]國內(nèi)單寧酶研究主要集中在固態(tài)發(fā)酵及固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)的胞外單寧酶。而對(duì)胞內(nèi)單寧酶的研究較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，利用液體發(fā)酵可制備得胞內(nèi)單寧酶，通過混合表面活性劑反膠團(tuán)體系萃取可以快速分離得到大量高活力的胞內(nèi)單寧酶，對(duì)研究不同來源的單寧酶的結(jié)構(gòu)性質(zhì)有重要意義，為單寧酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供
理論基礎(chǔ)。
[0005]為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案:`[0006]一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，包括以下步驟:
[0007](I)配置液體培養(yǎng)基，滅菌、冷卻；
[0008](2)液體發(fā)酵:往冷卻后的液體培養(yǎng)基內(nèi)接入無花果曲霉孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵，制得無花果曲霉胞內(nèi)單寧酶；
[0009](3)無花果曲霉細(xì)胞破壁:發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進(jìn)行無花果曲霉細(xì)胞破壁，離心收集粗酶液；
[0010](4)單寧酶純化:將粗酶液用硫酸銨沉淀、沉淀溶解后超濾，利用混合表面活性劑反膠束體系進(jìn)行萃取，收集到的酶液經(jīng)冷凍干燥制備成單寧酶粉末。
[0011]優(yōu)選的是:步驟(2)所述的無花果曲霉編號(hào)為Gim3.6(購于廣東省菌種保藏中心)，無花果曲霉孢子懸液接入量為1.5mL,懸液濃度為I X IO8個(gè)孢子/mL。
[0012]優(yōu)選的是:步驟(1)和步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基由麥芽汁、酵母膏、五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L ;適合此培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度30~35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)72~80h。
[0013]優(yōu)選的是:步驟(1)和步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基為:每升蒸餾水含25g單寧、15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，所述的單寧在培養(yǎng)基滅菌后加入；適合此培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度30~35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)80~90h。[0014]優(yōu)選的是:步驟(3)所述的超聲功率為300W。
[0015]優(yōu)選的是:步驟(4)所述的每毫升粗酶液加2.3g固體硫酸銨。
[0016]優(yōu)選的是:步驟(4)所述的混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質(zhì)量比2:1，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液,其中有機(jī)相體系和水相體積比為2 反萃取溫度為40~45°C，pH為5.0~5.5，震蕩時(shí)間為30~40min。
[0017]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其進(jìn)步之處在于:
[0018](I)本發(fā)明采用液體發(fā)酵能制備胞內(nèi)單寧酶，發(fā)酵條件較好控制，不易污染雜菌。
[0019](2)本發(fā)明采用液體發(fā)酵方式研究了細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的單寧酶的性質(zhì)，為單寧酶的綜合開發(fā)提供參考。
[0020](3)本發(fā)明采用混合表面活性劑反膠團(tuán)體系體系對(duì)單寧酶進(jìn)行萃取，提高了體系對(duì)單寧酶的萃取效率，前萃取率高達(dá)92%，反萃取率高達(dá)72%。
[0021](4)提取單寧酶過程中對(duì)細(xì)胞的破壁工藝進(jìn)行超聲和液氮研磨方法聯(lián)合使用，既最大限度的提高破壁的效果，又降低了破壁過程中對(duì)酶活的損失。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于實(shí)施例表示的范圍。 這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0023]以沒食子酸甲酯為底物，本發(fā)明制得的胞內(nèi)單寧酶最合適的反應(yīng)溫度為40°C，最適pH為6.8，在pH5.0到pH7.5之間保持較好的穩(wěn)定性，測得其米氏常數(shù)為1.028mmol/L,Vmax為96.25 μ mol/ (L.min),總酶活為5198U,總蛋白含量為216mg,比活力為24.06U/
mg ο
[0024]實(shí)施例1
[0025]液體發(fā)酵培養(yǎng)基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個(gè)孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180r/min,培養(yǎng)80h后將發(fā)酵液以5000r/min冷凍離心20min,得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號(hào)為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經(jīng)12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進(jìn)行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經(jīng)真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經(jīng)測定酶活為140U/g。
[0026]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質(zhì)量比2:1，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為40°C，pH為5.0，震蕩時(shí)間為30min。實(shí)施例2
[0027]液體發(fā)酵培養(yǎng)基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。IOOmL液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個(gè)孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為32°C，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)75h后將發(fā)酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號(hào)為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經(jīng)12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進(jìn)行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經(jīng)真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經(jīng)測定酶活為130U/g。
[0028]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質(zhì)量比2:1，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為42°C，pH為5.2，震蕩時(shí)間為35min。實(shí)施例3 [0029]液體發(fā)酵培養(yǎng)基由麥芽汁，酵母膏，五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L。150mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，接入
1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個(gè)孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min，培養(yǎng)72h后將發(fā)酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號(hào)為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min,懸濁液經(jīng)12000r/min冷凍離心30min，所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入
2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進(jìn)行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經(jīng)真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經(jīng)測定酶活為106U/g。
[0030]混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質(zhì)量比2:1，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1,前萃取溫度為40°C,震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為45°C，pH為5.5，震蕩時(shí)間為40min。實(shí)施例4
[0031]配置150mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方為:每升蒸餾水含15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，液體發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)滅菌、冷卻后，按每升培養(yǎng)基加入25g單寧，所述的單寧用少量去離子水溶解后過濾除菌。接入1.5mL無花果曲霉孢子懸液(I X IO8個(gè)孢子/mL)，置于搖床中震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30~35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)80~90h。將發(fā)酵液以5000r/min冷凍離心20min，得到濕菌體。所述的無花果曲霉購于廣東省菌種保藏中心，菌種編號(hào)為Gim3.6。取5g濕菌體置于研缽中，迅速倒入適量液氮，用缽棒充分研磨，溶于200mL檸檬酸緩沖液中，在300W超聲功率下超聲15min，懸濁液經(jīng)12000r/min冷凍離心30min,所得上清液即為粗酶液。每毫升粗酶液加入2.3g固體硫酸銨，收集沉淀，每克沉淀用IOml緩沖液溶解，超濾(超濾管的膜直徑為30ku)后利用混合反膠束體系進(jìn)行萃取，即可得到純度較高的單寧酶酶液。酶液經(jīng)真空冷凍干燥制備成粉末即可保存。經(jīng)測定酶活為128U/g。
[0032] 混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為經(jīng)超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB:Tween-60=2:l，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2 反萃取溫度為45°C, pH為5.0,震蕩時(shí)間為30mino
【權(quán)利要求】
1.一種制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，包括以下步驟: (1)配置液體培養(yǎng)基，滅菌、冷卻； (2)液體發(fā)酵:往冷卻后的液體培養(yǎng)基內(nèi)接入無花果曲霉孢子懸液進(jìn)行發(fā)酵，制得無花果曲 霉胞內(nèi)單寧酶； (3)無花果曲霉細(xì)胞破壁:發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液冷凍離心，收集濕菌體，通過超聲和液氮研磨進(jìn)行無花果曲霉細(xì)胞破壁，離心收集粗酶液； (4)單寧酶純化:將粗酶液用硫酸銨沉淀、沉淀溶解后超濾，利用混合表面活性劑反膠束體系進(jìn)行萃取，收集到的酶液經(jīng)冷凍干燥制備成單寧酶粉末。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(2)所述的無花果曲霉為無花果曲霉Gim3.6，無花果曲霉孢子懸液接入量為1.5mL,懸液濃度為IXlO8個(gè)孢子/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(I)和步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基由麥芽汁、酵母膏、五倍子組成，所述的麥芽汁錘度為10° Bx，酵母膏質(zhì)量百分含量為2%，五倍子含量為20g/L ;適合此培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度30~35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)72~80h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(I)和步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基為:每升蒸餾水含25g單寧、15g蔗糖、3gNaN03、lgK2HP04、0.5gKCl、0.5gMgS04，所述的單寧在培養(yǎng)基滅菌后加入；適合此培養(yǎng)基的發(fā)酵條件為:培養(yǎng)溫度30~35°C，轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中震蕩培養(yǎng)80~90h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(3)所述的超聲功率為300W。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(4)所述的每毫升粗酶液加2.3g固體硫酸銨。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備及快速分離胞內(nèi)單寧酶的方法，其特征在于:步驟(4)所述的混合表面活性劑反膠束體系萃取，前萃取水相為超濾后的粗酶液，有機(jī)相體系為:助溶劑正丁醇和有機(jī)溶劑異辛烷體積比為1:3，以CTAB和Tween-60為混合表面活性劑，混合表面活性劑在有機(jī)相體系中含量為5g/L，CTAB和Tween-60質(zhì)量比2:1，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，前萃取溫度為40°C，震蕩時(shí)間15min ;反萃取水相為2mol/L的NaCl溶液，其中有機(jī)相體系和水相體積比為2:1，反萃取溫度為40~45°C，pH為5.0~5.5，震蕩時(shí)間為 30 ~40min。
【文檔編號(hào)】C12N9/18GK103614351SQ201310593724
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】楊洋, 嚴(yán)東, 趙芬芬, 葉琴, 馬萬良, 胡振興 申請人:廣西大學(xué)