一種同時提取血清、雙拭子中動物dna病毒和rna病毒核酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步驟：對待提取物使用異硫氰酸胍裂解液裂解；硅膠膜吸附RNA；洗液Ⅰ除去雜蛋白；洗液Ⅱ洗去雜質(zhì)；DEPC水洗脫核酸；上述異硫氰酸胍裂解液包括3-7M異硫氰酸胍、0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM?Tris-Cl、5-15mM?DTT、60-90μg/mL蛋白酶K、10-30mM?EDTA，PH在4.3-4.6；上述洗液Ⅰ包括5-6M鹽酸胍，53-59%無水乙醇，K70-90μg/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6；上述洗液Ⅱ包括70-80%乙醇。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提取過程簡單、周期短、成本低、能同時提取動物血清樣本、雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
【專利說明】—種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，適用于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，基因診斷成為檢測動物疫病最準(zhǔn)確而有效地手段，進(jìn)行基因診斷的過程中，病毒核酸的提取是進(jìn)行檢測的前提條件，核酸提取的質(zhì)量也影響檢測的準(zhǔn)確性。當(dāng)前，動物病毒核酸提取方法主要有經(jīng)典Trizol提取法和以Trizol作為裂解液的硅膠模柱式提取法兩種方法。經(jīng)典Trizol提取法過程繁瑣、周期長、提取效率低、技術(shù)要求高，以Trizol作為裂解液的硅膠模柱式提取法成本較高、提取RNA的質(zhì)量不高、且只能提取RNA病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，提取過程簡單、周期短、成本低、能同時提取動物血清樣本、雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸。
[0004]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。
[0005]一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步驟:對待提取物使用異硫氰酸胍裂解液裂解；硅膠膜吸附RNA;洗液I除去雜蛋白；洗液II洗去雜質(zhì)；DEPC水洗脫核酸；上述異硫氰酸胍裂解液包括3-7M異硫氰酸胍、
0.6%-l.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5_15mM DTT、60_90μ g/mL 蛋白酶 K、10_30mMEDTA, PH在4.3-4.6 ;上述洗液I包括5-6M鹽酸胍，53-59%無水乙醇，K70-90 u g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;上述洗液II包括70-80%乙醇。
[0006]進(jìn)一步地，上述異硫氰酸胍裂解液包括5M異硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mMTris-ClUOmM DIT、80 μ g/mL 蛋白酶 K、20mM edta,ph在4.5。
[0007]進(jìn)一步地，上述洗液I包括5.5M鹽酸胍，56%無水乙醇，80 U g/mL蛋白酶K，PH在
6.50
[0008]進(jìn)一步地，上述洗液II包括75%乙醇。
[0009]進(jìn)一步地，上述操作步驟包括:
[0010](I)取一干凈離心管，1OOμ L樣品加入200 μL的異硫氰酸胍裂解液中，振蕩混勻，放置5分鐘；
[0011](2)加入與異硫氰酸胍裂解液等體積的無水乙醇，即200 u L，顛倒反復(fù)混勻15秒；
[0012](3)將過濾柱套在2mL收集管上，全部混合液移到過濾柱上，12,OOOrpm離心1分鐘；
[0013](4)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600 u L的洗液1，12000rpm離心1分鐘；[0014](5)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600 u L的洗液2，12000rpm離心I分鐘；
[0015](6)重復(fù)步驟(5)—次；
[0016](7)棄收集管內(nèi)的液體，過濾柱套在收集管上，12000rpm離心I分鐘；
[0017](8)換新的1.5mL離心管套上過濾柱，加20 y LDEPC到過濾柱膜上，室溫放置I分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，收集濾液，保存。
[0018]本發(fā)明的有益效果:
[0019]同時提取動物血清樣本、雙拭子樣本中的RNA病毒和DNA病毒核酸，具有方法簡便、快速、成本低的特點(diǎn)。該方法為建立動物RNA病毒和DNA病毒多重PCR方法奠定核酸提取基礎(chǔ)。
【具體實(shí)施方式】
[0020]下面根據(jù)實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0021]實(shí)施案例1:
[0022]制備使用液劑:
[0023]異硫氰酸胍裂解液:成分為5M異硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mM Tris-ClUOmMDTT,80 u g/mL 蛋白酶 K、20mM EDTA, pH 在 4.5。
[0024]洗液1:成分為5.5M鹽酸胍，56%無水乙醇，80 ii g/mL蛋白酶K，PH在6.5。
[0025]洗液I1:成分為75%乙醇。
[0026]實(shí)施案例2:
[0027]同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，包括步驟:
[0028](I)取一干凈離心管，IOOii L樣品加入200 L的異硫氰酸胍裂解液中，振蕩混勻，放置5分鐘；
[0029](2)加入與異硫氰酸胍裂解液等體積的無水乙醇，即200 u L，顛倒反復(fù)混勻15秒；
[0030](3)將過濾柱套在2mL收集管上，全部混合液移到過濾柱上，12,OOOrpm離心I分鐘；
[0031](4)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600 u L的洗液1，12000rpm離心I分鐘；
[0032](5)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600 u L的洗液2，12000rpm離心I分鐘；
[0033](6 )重復(fù)步驟(5 ) 一次；
[0034](7)棄收集管內(nèi)的液體，過濾柱套在收集管上，12000rpm離心I分鐘；
[0035](8)換新的1.5mL離心管套上過濾柱，加20 U LDEPC到過濾柱膜上，室溫放置I分鐘，12，OOOrpm離心I分鐘，收集濾液，保存。
[0036]上述實(shí)施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思及特點(diǎn)，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本
【發(fā)明內(nèi)容】
并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，包括步驟:對待提取物使用異硫氰酸胍裂解液裂解；硅膠膜吸附RNA ;洗液I除去雜蛋白；洗液II洗去雜質(zhì)；DEPC水洗脫核酸；所述異硫氰酸胍裂解液包括3-7M異硫氰酸胍、.0.6%-1.0%TriTon-100、30-50mM Tris-Cl、5_15mM DTT、60_90μ g/mL 蛋白酶 K、10_30mMEDTA, PH在4.3-4.6 ;所述洗液I包括5-6M鹽酸胍，53-59%無水乙醇，K70-90 μ g/mL蛋白酶，PH在6.4-6.6 ;所述洗液II包括70-80%乙醇。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述異硫氰酸胍裂解液包括5M異硫氰酸胍、0.8%TriTon-100、40mMTris-ClUOmM DTT、80 μ g/mL 蛋白酶 K、20mM EDTA，pH 在 4.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液I包括5.5M鹽酸胍，56%無水乙醇，80 μ g/mL蛋白酶K，PH在6.5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述洗液II包括75%乙醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4所述的同時提取血清、雙拭子中動物DNA病毒和RNA病毒核酸的方法，其特征在于，所述操作步驟包括: (1)取一干凈離心管，100μ L樣品加入200 μ L的異硫氰酸胍裂解液中，振蕩混勻，放置.5分鐘； (2)加入與異硫氰酸胍裂解液等體積的無水乙醇，即200yL，顛倒反復(fù)混勻15秒； (3)將過濾柱套在2mL收集管上，全部混合液移到過濾柱上，12,OOOrpm離心I分鐘； (4)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600μ L的洗液1，12000rpm離心I分鐘； (5)棄收集管內(nèi)的液體，往過濾柱加入600μ L的洗液2，12000rpm離心I分鐘； (6)重復(fù)步驟(5)—次; (7)棄收集管內(nèi)的液體，過濾柱套在收集管上，12000rpm離心I分鐘； (8)換新的1.5mL離心管套上過濾柱，加20 μ LDEPC到過濾柱膜上，室溫放置I分鐘，.12，OOOrpm離心I分鐘，收集濾液，保存。
【文檔編號】C12N15/10GK103614371SQ201310594174
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月21日
【發(fā)明者】趙宏波, 陳幫照 申請人:安徽華衛(wèi)集團(tuán)禽業(yè)有限公司