昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，將家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）的多角體基因（polyhedrin）以及目的蛋白基因分別構(gòu)建至pFastBac?Dual載體上的PH和P10啟動(dòng)子下面，通過(guò)重組獲得同時(shí)表達(dá)多角體和目的蛋白的桿狀病毒。本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)將質(zhì)型多角體蛋白基因和目的蛋白基因分別構(gòu)建到pFastBacTMDual載體的PH與p10啟動(dòng)子下，并在目的蛋白與信號(hào)肽之間引入柔性鏈接肽，通過(guò)與病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒。通過(guò)該單一病毒感染Sf9或Sf21昆蟲細(xì)胞，直接可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所需要的包裹型蛋白，并且這種重組型的病毒也同樣可以獲得擴(kuò)增。
【專利說(shuō)明】昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行包裹的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]昆蟲病毒多角體(polyhedra)是指昆蟲病毒在感染宿主細(xì)胞后產(chǎn)生的多面體粒子，其主要用來(lái)包裹病毒粒子。它的功能是保護(hù)包裹的病毒顆粒免受不良環(huán)境的破壞，比如:高溫、干燥、輻射等，以及它對(duì)各種蛋白分解酶也有抗性，并且在酸性條件下極其穩(wěn)定，而在堿性環(huán)境下易溶解并釋放出病毒粒子[I]。依據(jù)多角體在細(xì)胞內(nèi)形成的部位可以分為核型多角體或質(zhì)型多角體。近來(lái)國(guó)內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)質(zhì)型多角體可以包裹異源蛋白，比如:Ijiri等人將蛋白激酶C (protein kinase C)包裹進(jìn)入了質(zhì)型多角體中，并發(fā)現(xiàn)包裹型的蛋白激酶C相對(duì)于沒(méi)有經(jīng)過(guò)包裹的蛋白有更強(qiáng)生物學(xué)活性和持續(xù)的藥物緩釋效果[2];被多角體包裹的表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor)不僅藥效延長(zhǎng)了，而且其能抵抗高強(qiáng)度的射線破壞[3];曹翠平等人利用多角體包埋外源蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)包埋的EGFP蛋白(綠色熒光蛋白)放置2個(gè)月后仍能檢測(cè)到綠色熒光，而干燥處理30min后同樣能檢測(cè)到蛋白活性[4]。這些研究表明多角體是耐酸、抗輻射、抗干燥并具有包裹異源活性蛋白特性的優(yōu)良載體。
[0003]目前國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道 中關(guān)于多角體包裹目的蛋白的技術(shù)手段多是通過(guò)構(gòu)建兩個(gè)重組桿狀病毒，即一個(gè)專一表達(dá)質(zhì)型多角體病毒多角體蛋白(包裹蛋白)的桿狀病毒，另一個(gè)專一表達(dá)目的蛋白的桿狀病毒，通過(guò)調(diào)節(jié)兩種病毒的比例混合感染Sf9昆蟲細(xì)胞，再?gòu)募?xì)胞中分離出多角體。該種方法不適合從昆蟲細(xì)胞中收集大量的多角體，由于很多細(xì)胞在混合感染的時(shí)候只感染了一種 病毒，所以會(huì)形成較多空多角體，以至于包裹效率低。國(guó)內(nèi)學(xué)者主要通過(guò)家蠶Bacmid表達(dá)系統(tǒng)， 采用家蠶本身的多角體蛋白包裹目的蛋白，這種方案產(chǎn)生的多角體量大，并且可以通過(guò)家蠶本身生產(chǎn)，但采用家蠶本身多角體包裹的目的蛋白并不專一，其中包裹了大量家蠶病毒粒子，不適合現(xiàn)在國(guó)際上通過(guò)多角體專一包裹目的蛋白的發(fā)展趨勢(shì)，也不能應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)藥蛋白或疫苗抗原的包裹需求。
[0004]在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)多角體對(duì)目的蛋白的包裹過(guò)程需要一個(gè)信號(hào)肽蛋白的輔助，目前的技術(shù)手段基本上采用在目的蛋白的N端加上一段VP3蛋白N末端42-93個(gè)氨基酸或者Hl螺旋作為信號(hào)肽，由于這些蛋白結(jié)構(gòu)比較大，可能會(huì)影響很多目的蛋白的正確折疊過(guò)程，造成目的蛋白失去生物學(xué)活性。
[0005]大多數(shù)的生物活性蛋白，如:GM_CSF、干擾素、白介素、亞單位疫苗等，目前主要以注射給藥，治療不方便，也難以長(zhǎng)期給藥，由其是養(yǎng)殖場(chǎng)。我們尚未見(jiàn)到利用昆蟲生產(chǎn)多角體包裹藥物方面的研究報(bào)道。
[0006]上文中涉及的參考文獻(xiàn)如下:
[0007][l]Belloncik, S.and H.Mori, Cypoviruses.The insectviruses, 1998:p.337-369.(Belloncik, S.and H.Mori,質(zhì)型多角體病毒。昆蟲病毒雜志，1998:p.337-369)。[0008][2]Ijiri, H., et al., Immobilization of protein kinase C into cypoviruspolyhedra.Journal of insect biotechnology and sericology.79(1):p.1-1.(H.;Hamada, N.;Kotani,E.;Mori,H.固定蛋白激酶C到質(zhì)型多角體上。昆蟲生物技術(shù)與蠶學(xué)雜志。2010.79(1):p.1-1.)。
[0009][3]Ijiri, H., et al., Structure-based targeting of bioactive proteinsinto cypovirus polyhedra and application to immobilized cytokines for mammaliancell culture.Biomaterials, 2009.30(26):p.4297-4308.(Coulibalyb, Gento Nishimura等?；诮Y(jié)構(gòu)的定點(diǎn)固定生物活性蛋白至質(zhì)型多角體上并應(yīng)用固定的化的細(xì)胞因子培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。生物材料雜志，2009，30 (26):p.4297-4308.)。
[0010][4]曹翠平，郭愛(ài)芹等.利用BmNPV多角體包埋外源蛋白的觀察.蠶業(yè)科學(xué)，2009.35(004):p.790—795。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種多角體高效專一包裹目的蛋白的方法。
[0012]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法:將家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)的多角體基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分別構(gòu)建至pFastBac Dual載體上的PH和PlO啟動(dòng)子下面，通過(guò)重組獲得同時(shí)表達(dá)多角體和目的蛋白的桿狀病毒。
[0013]作為本發(fā)明的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法的改進(jìn):在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信號(hào)序列以及6-12個(gè)GGS (甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)柔性連接肽。
[0014]作為本發(fā)明的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法的進(jìn)一步改進(jìn):該方法通過(guò)構(gòu)建的重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞sf9或甜菜夜蛾上實(shí)現(xiàn)目的蛋白的包裝過(guò)程。
[0015]作為本發(fā)明的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法的進(jìn)一步改進(jìn):由Hl信號(hào)肽與柔性連接肽構(gòu)成的引導(dǎo)基因的序列為SEQ ID N02所述。
[0016]作為本發(fā)明的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法的進(jìn)一步改進(jìn):Hl (信號(hào)肽)+Flexible peptide (柔性鏈接肽)+eGFP的序列為SEQ ID N04所述。
[0017]本發(fā)明還同時(shí)提供了利用上述方法制備而得的病毒，所述病毒直接感染sf9或sf21細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)直接產(chǎn)生多角體包裹型的目的蛋白，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含10-50個(gè)多角體，直徑在1-2 u m，并且病毒液能繼續(xù)用于感染細(xì)胞或注射甜菜夜蛾。
[0018]作為本發(fā)明的病毒的改進(jìn):該病毒直接可以注射4-5齡甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾發(fā)生液化，每頭幼蟲可以產(chǎn)生1-2億個(gè)多角體包裹的目的蛋白，直徑在1-2 Pm。
[0019]作為本發(fā)明的病毒的進(jìn)一步改進(jìn):所述的目的蛋白為多角體包裹型，具有生物學(xué)功能，并且為單基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0020]本發(fā)明的目的之一是提供該重組病毒的制備方法。
[0021]本發(fā)明是按下述方案實(shí)現(xiàn)的:以綠色熒光蛋白eGFP作為包裝的模式目的蛋白，通過(guò)全基因合成技術(shù)分別合成質(zhì)型多角體蛋白polyhedrin基因、引導(dǎo)肽基因(含Hl信號(hào)肽+柔性連接肽)、eGFP基因(序列分別為序列表中的SEQ ID NOUSEQ ID N02、SEQ ID N03)。
[0022]本發(fā)明具體為通過(guò)甜菜夜蛾昆蟲或者細(xì)胞實(shí)現(xiàn)昆蟲病毒多角體對(duì)其他目的蛋白進(jìn)行高效包裹，采用該方法可以大幅度提高多角體對(duì)目的蛋白的包裹效率，不僅可以在體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞sf9和sf21內(nèi)包裹，也可以在甜菜夜蛾體內(nèi)大量包裹。該技術(shù)可以應(yīng)用于蛋白類藥物或疫苗抗原的包裹【技術(shù)領(lǐng)域】。
[0023]由于多角體這種蛋白包裝材料具有很好的抗酸、耐高溫等特點(diǎn)，所以將其用于那些具有用量小、活性高、易失活的蛋白進(jìn)行包裝可能對(duì)提高其穩(wěn)定性以及口服給藥方面會(huì)是一個(gè)突破；亞單位疫苗，一般是某種病原的一段肽或蛋白成分，直接通過(guò)口服很引起動(dòng)物粘膜免疫反應(yīng)，因?yàn)榭诜蠛苋菀妆幌到y(tǒng)的酶降解，所以包裹技術(shù)為亞單位疫苗直接通過(guò)口服引起動(dòng)物粘膜和全身性免疫反應(yīng)提供了新的途徑。因此，本研究?jī)?nèi)容對(duì)于拓展蛋白類藥物或亞單位疫苗在臨床上的應(yīng)用范圍以及為今后開(kāi)發(fā)更多的口服蛋白藥物提供技術(shù)支持，具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
[0024]本發(fā)明的發(fā)明點(diǎn)具體為:
[0025]1、構(gòu)建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有在昆蟲細(xì)胞Sf9內(nèi)同時(shí)表達(dá)多角體蛋白與目的蛋白，并且目的蛋白是被多角體完全包裹，該多角體在細(xì)胞內(nèi)大小為1-2 U m,每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以產(chǎn)生50-200個(gè)該顆粒.(國(guó)內(nèi)外包裝主要采用分別表達(dá)多角體蛋白與目的蛋白的兩種桿狀病毒混合感染制備包裹目的蛋白的多角體。我們的發(fā)明改進(jìn)后，將多角體蛋白與目的蛋白同時(shí)放在一種桿狀病毒中，簡(jiǎn)化了其方法，提高了包裝效率)。
[0026]2、構(gòu)建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有感染甜菜夜蛾昆蟲的能力，能在其體內(nèi)產(chǎn)生大量的多角體顆粒，并且目的蛋白被多角體包裹。其在細(xì)胞內(nèi)的大小與分布同感染Sf9細(xì)胞結(jié)果類似。(目前國(guó)內(nèi)外在昆蟲上實(shí)現(xiàn)多角體包裹目的蛋白上沒(méi)有報(bào)道。我們的發(fā)明提供的該新型桿狀病毒實(shí)現(xiàn)了在甜菜夜蛾昆蟲上多角體對(duì)目的蛋白的包裹過(guò)程。)
[0027]3、構(gòu)建了一種新型桿狀病毒，該病毒具有同時(shí)表達(dá)多角體蛋白與目的蛋白的能力，特點(diǎn):(1)多角體蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質(zhì)粒，由載體上Polyhedrinpromoter啟動(dòng)；(2)目的蛋白基因插入到載體pFastBac Dual質(zhì)粒，由載體上PlO啟動(dòng)子啟動(dòng)，并且在包裹目的蛋白的N端加上一段引導(dǎo)肽序列，引導(dǎo)肽由信號(hào)肽與柔性鏈接肽組成。
[0028]綜上所述，本發(fā)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，同時(shí)將質(zhì)型多角體蛋白基因和目的蛋白基因分別構(gòu)建到pFastBacTMDual載體的PH與plO啟動(dòng)子下，并在目的蛋白與信號(hào)肽之間引入柔性鏈接肽，通過(guò)與病毒骨架重組，獲得重組桿狀病毒。通過(guò)該單一病毒感染Sf9或Sf21昆蟲細(xì)胞，直接可以在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生所需要的包裹型蛋白，并且這種重組型的病毒也同樣可以獲得擴(kuò)增。相對(duì)于國(guó)外通過(guò)兩種病毒按照比例進(jìn)行混合感染相比，具有工藝簡(jiǎn)單，產(chǎn)生的包裹型蛋白效率更高，另外在產(chǎn)生包裹型蛋白的同時(shí)重組病毒粒子也同樣獲得了擴(kuò)增，更適合通過(guò)昆蟲細(xì)胞發(fā)酵大規(guī)模制備多角體包裹型蛋白；其次通過(guò)上述方法制備的重組桿狀病毒可以直接皮下注射四齡甜菜夜蛾，通過(guò)昆蟲體細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)更多的多角體包裹型蛋白，其效率高、同時(shí)成本要大大低于通過(guò)昆蟲細(xì)胞發(fā)酵過(guò)程?！緦＠綀D】

【附圖說(shuō)明】
[0029]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0030]圖1為方案流程圖。
[0031]圖2為細(xì)胞內(nèi)多角體的產(chǎn)生對(duì)比圖(200倍數(shù)下顯微鏡拍照)；
[0032]左圖為Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，右圖為對(duì)照細(xì)胞。[0033] 圖3為熒光下觀察多角體內(nèi)的eGFP的包裹情況圖(200倍數(shù)下顯微鏡拍照)；
[0034]Al與A2為細(xì)胞內(nèi)多角體分別在可見(jiàn)光與熒光下拍照的圖片，圖BI與B2為從細(xì)胞中分離獲得的多角體分別在可見(jiàn)光與熒光下拍照的圖片。
[0035]圖4為甜菜夜蛾昆蟲感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒后在其體內(nèi)產(chǎn)生包含eGFP蛋白的多角體顆粒結(jié)果。
[0036]Cl為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體發(fā)生液化結(jié)果。
[0037]C2為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體組織涂片后可見(jiàn)光下對(duì)多角體顆粒鏡檢結(jié)果。(100倍數(shù)下顯微鏡拍照)；
[0038]C3為四齡甜菜夜蛾感染Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒4天后蟲體組織涂片后突光下對(duì)多角體顆粒鏡檢結(jié)果。(100倍數(shù)下顯微鏡拍照)；
【具體實(shí)施方式】
[0039]實(shí)施例方法、
[0040]1、材料:
[0041]草地貪夜蛾細(xì)胞(sf9)、pFastBac Dual質(zhì)粒、DHlOBac均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；
[0042]DH5 a菌株購(gòu)自TaKaRa公司；
[0043]家香質(zhì)型多角體病毒(Bombyxmori cypovirus,BmCPV)的多角體(polyhedrin)基因(gb IM19112.11、如序列表中的NOl所述)、由Hl信號(hào)肽與柔性連接肽構(gòu)成的引導(dǎo)基因(如序列表中的N02所述，本發(fā)明所特設(shè))、eGFP基因(gb | KC710230.11、如序列表中的N03所述)均由上海生物工程公司人工合成；
[0044]備注說(shuō)明:在序列表的N02中，l_90bp為Hl定位信號(hào)肽，91_126bp為柔性連接肽(帶下劃線)。
[0045]高保真Tag酶、各種限制性內(nèi)切酶、dNTP、酶連試劑盒、DNA膠回收試劑盒等均購(gòu)自TaKaRa 公司；
[0046]Sf-900II SFM無(wú)血清培養(yǎng)基、Cellfectin II Reagent轉(zhuǎn)染試劑均購(gòu)自Invitrogen 公司；
[0047]2、引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增:
[0048]根據(jù)人工合成的polyhedrin基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，
[0049]上游引物P1:5，一CGCGGATCCATGGCAGACGTAGCAGGAAC—3’，帶有 BamH I 酶切位點(diǎn)；
[0050]下游引物P2:5’ 一CCCAAGCTTTCACTGACGGTTACTCAGAG— 3’，帶有 Hind III 酶切位點(diǎn)。
[0051]依據(jù)人工合成的帶有Hl+柔性連接肽+eGFP的序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物:
[0052]上游引物P3:5 ’ — TCCCCCGGGATGGCAGACGTAGCAGGAAC— 3 ’，帶有 Smal I 酶切位占.[0053]下游引物P4:5 ’ 一 CGGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA— 3 ’，帶有 Kpn I 酶切位點(diǎn)。
[0054]上述引物均由上海生物工程公司合成。
[0055]PCR 反應(yīng)體系為:dNTPs (2mM) 2.0 U L,弓丨物(IOuM)各 0.5 ii L，IOXrTaqbuffer2.5 ii L，模板 DNA (20ng/ul) 1.0u L, Taq DNA 聚合酶(5U/ul) 0.2 y L，雙蒸水補(bǔ)至25 u Lo
[0056]PCR 反應(yīng)條件為:94°C 5min，(預(yù)變性);94°C 30s’，55°C 30s’，72°C lmin’，共 35個(gè)循環(huán)；72°C IOmin。
[0057]PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0058]3、重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建與鑒定:
[0059]將凝膠回收的polyhedrin基因和pFastBac Dual質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Bam HI和Hind III雙酶切后分別回收，polyhedrin基因定向克隆于FastBac Dual的PH啟動(dòng)子下游，構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)移載體pFastBacDual/polyhedrin,轉(zhuǎn)化至DH5 a , PCR和酶切鑒定。[0060]將上述pFastBac Dual/polyhedrin質(zhì)粒和帶定位信號(hào)肽的eGFP基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)Smal I和Kpn I雙酶切后分別回收，并將引導(dǎo)基因與eGFP基因定向克隆至pFastBac Dual/polyhedrin的PlO啟動(dòng)子下游，構(gòu)建獲得重組轉(zhuǎn)移載體pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP,最后轉(zhuǎn)化DH5 a，送上海生物工程公司測(cè)序鑒定。
[0061]4、重組Bacmid質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定:
[0062]將pFastBac Dual/polyhedrin-eGFP 和對(duì)照質(zhì)粒 pFastBac dual 分別轉(zhuǎn)化
E.coli DHlOBac 感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂于含有 X-Gal (40 iig/ml)、IPTG (24 y g/ml)、卡那霉素(50118/1111)、慶大霉素(100118/1111)和四環(huán)素(30iig/ml)的培養(yǎng)基平板上，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，分別挑取白色菌落、提取質(zhì)粒，送上海生工測(cè)序鑒定，鑒證正確后命名為重組質(zhì)粒Bacmid-polyhedrin—eGFPo
[0063]5重組Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞及其表達(dá)分析:
[0064]根據(jù)Cellfectin轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書，將重組質(zhì)粒Bacmid-polyhedrin-eGFP(21^)、0611€6(^111轉(zhuǎn)染試劑(21^)與100 ill不含抗生素?zé)o血清昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(Gibcosf-900II SFM)混勻，室溫下孵育45min，轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9細(xì)胞，置28°C培養(yǎng)5h后吸去轉(zhuǎn)染混合物，加入含抗性(青霉素0.008g/100ml，鏈霉素終濃度0.01g/100ml)和血清的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)72h以上，出現(xiàn)病變(即細(xì)胞內(nèi)充滿顆粒，細(xì)胞附著力減弱，開(kāi)始脫壁上浮并個(gè)別細(xì)胞解體成顆粒狀物散落細(xì)胞培養(yǎng)液中)后，并觀察細(xì)胞內(nèi)多角體的產(chǎn)生以及熒光下觀察多角體內(nèi)的eGFP的包裹情況并計(jì)數(shù)，并收集細(xì)胞上清為Pl代病毒液。以此為毒種，再去感染sf9細(xì)胞以擴(kuò)增病毒,收獲病毒液為P2代病毒。
[0065]結(jié)果如下:
[0066]I)、細(xì)胞內(nèi)多角體的產(chǎn)生如圖2所示；該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的多角體顆粒，圖2中，左圖為Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒感染，通過(guò)計(jì)數(shù)，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以產(chǎn)生10-50個(gè)多角體，右圖為對(duì)照細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多角體顆粒。(20倍數(shù)下顯微鏡拍照)?！緦?duì)照細(xì)胞為正常細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)不產(chǎn)生多角體顆粒?！?br> [0067]2)、熒光下觀察多角體內(nèi)的eGFP的包裹情況如圖3所示；該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量的多角體顆粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白，圖Al與A2為細(xì)胞內(nèi)多角體分別在可見(jiàn)光與熒光下拍照?qǐng)D片，圖BI與B2為從細(xì)胞中分離獲得的多角體分別在可見(jiàn)光與熒光下拍照的圖片。圖片證明了該方法可以在細(xì)胞產(chǎn)生大量的多角體并且可以高效率的包裹目的蛋白eGFP (20倍數(shù)下顯微鏡拍照)。
[0068]6、重組桿狀病毒在甜菜夜蛾幼蟲中的表達(dá)分析
[0069]將甜菜夜蛾幼蟲蟲卵在27°C孵化成幼蟲，分裝于24孔板內(nèi)，以人工飼料喂養(yǎng)至四齡時(shí)，每頭幼蟲注射P2病毒1-3 ii 1,3-4天后收集死亡和液化的幼蟲，經(jīng)過(guò)研磨和過(guò)濾，直接涂片進(jìn)行顯微鏡拍照觀察并對(duì)多角體進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0070] 備注說(shuō)明:
[0071 ] 1、人工飼料是指從武漢病毒研究所購(gòu)買，用于喂養(yǎng)昆蟲的飼料。
[0072]2、液化是指昆蟲發(fā)生病變的一種現(xiàn)象，整個(gè)蟲體水腫并且柔軟，用針刺表皮后會(huì)流出大量液體。
[0073]結(jié)果如下:
[0074]該方法獲得的Bacmid-polyhedrin-eGFP病毒可以在昆蟲甜菜夜蛾上產(chǎn)生大量的多角體顆粒，并且包裹了 eGFP目的蛋白。圖Cl為注射病毒后蟲體液化結(jié)果:蟲體帶綠色；圖C2與C3為液化蟲體經(jīng)過(guò)直接涂片后在可見(jiàn)光與熒光下觀察結(jié)果；結(jié)果說(shuō)明通過(guò)該方法獲得病毒可以直接注射甜菜夜蛾來(lái)獲得包裹型多角體，并且可以在幼蟲上產(chǎn)生大量的包裹了 eGFP目的蛋白的多角體，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)每頭幼蟲可以產(chǎn)生約1-2億個(gè)多角體顆粒。(40倍數(shù)下顯微鏡拍照)。
[0075]最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:將家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)的多角體基因(polyhedrin)以及目的蛋白基因分別構(gòu)建至pFastBac Dual載體上的PH和PlO啟動(dòng)子下面，通過(guò)重組獲得同時(shí)表達(dá)多角體和目的蛋白的桿狀病毒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:在目的蛋白基因前面加入81-90bp Hl定位信號(hào)序列以及6-12個(gè)GGS(甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸)柔性連接肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:所述方法通過(guò)構(gòu)建的重組桿狀病毒在昆蟲細(xì)胞sf9或甜菜夜蛾上實(shí)現(xiàn)目的蛋白的包裝過(guò)程。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: 由Hl信號(hào)肽與柔性連接肽構(gòu)成的引導(dǎo)基因的序列為SEQ ID N02所述。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是: Hl (信號(hào)肽)+Flexible peptide (柔性鏈接肽)+eGFP的序列為SEQ ID N04所述。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的昆蟲病毒多角體實(shí)現(xiàn)外源蛋白高效包裹的方法，其特征是:重組質(zhì)粒為 Bacmid-polyhedrin-eGFP。
7.利用如權(quán)利要求1~6任一所述方法制備而得的病毒，其特征是:所述病毒直接感染sf9或sf21細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)直接產(chǎn)生多角體包裹型的目的蛋白，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)含10-50個(gè)多角體，直徑在1-2 U m，并且病毒液能繼續(xù)用于感染細(xì)胞或注射甜菜夜蛾。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的病毒，其特征是:該病毒直接可以注射4-5齡甜菜夜蛾，3-5天后甜菜夜蛾發(fā)生液化，每頭幼蟲可以產(chǎn)生1-2億個(gè)多角體包裹的目的蛋白，直徑在1-2 u m0
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的病毒，其特征是:所述的目的蛋白為多角體包裹型，具有生物學(xué)功能，并且為單基因編碼的蛋白質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK103614417SQ201310595964
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月22日
【發(fā)明者】袁林, 郭建軍, 楊一兵, 魏國(guó)汶 申請(qǐng)人:江西省科學(xué)院微生物研究所