具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的因子viii，馮·維勒布蘭德因子或它們的復(fù)合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及：編碼凝血因子VIII（FVIII）及馮·維勒布蘭德因子（VWF）以及它們的復(fù)合物及它們的衍生物的修飾的核酸序列，含該核酸序列的重組表達(dá)載體，用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述核酸序列編碼的重組多肽及衍生物，所述重組多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修飾的野生型蛋白具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和/或提高的體內(nèi)恢復(fù)。本發(fā)明還涉及導(dǎo)致提高的表達(dá)產(chǎn)率的相應(yīng)FVIII序列。本發(fā)明還涉及制備該重組蛋白及它們的衍生物的方法。本發(fā)明還涉及用于人基因治療的轉(zhuǎn)移載體，其包括該修飾的核酸序列。
【專利說明】具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的因子Vl I 1、馮.維勒布蘭德因子或它們的復(fù)合物
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2009年6月24日、申請(qǐng)?zhí)枮?00980123818.X、發(fā)明名稱為“具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的因子VII1、馮.維勒布蘭德因子或它們的復(fù)合物”的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0002]本發(fā)明涉及編碼凝血因子VIII (FVIII)及馮?維勒布蘭德因子(VWF)以及它們的復(fù)合物及它們的衍生物的修飾的核酸序列，含該核酸序列的重組表達(dá)載體，用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，所述核酸序列編碼的重組多肽及衍生物，所述重組多肽及衍生物具有生物活性，及相比未修飾的野生型蛋白具有延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和/或提高的體內(nèi)恢復(fù)。本發(fā)明還涉及導(dǎo)致提高的表達(dá)產(chǎn)率的相應(yīng)FVIII序列。本發(fā)明還涉及制備該重組蛋白及它們的衍生物的方法。本發(fā)明還涉及用于人基因治療的轉(zhuǎn)移載體，其包括該修飾的核酸序列。
【【背景技術(shù)】】
[0003]有各種出血障礙凝血因子缺陷引發(fā)。最常見的障礙是血友病A及B，分別由凝血因子VIII及IX缺陷所致。另一已知的出血障礙是馮.維勒布蘭德病。
[0004]在血漿中，F(xiàn)VIII大多以與VWF的非共價(jià)復(fù)合物形式存在，及其促凝劑功能加速因子X到Xa的因子IXa依賴的轉(zhuǎn)變。由于FVIII與VWF的復(fù)合物形成，長(zhǎng)時(shí)間認(rèn)為，F(xiàn)VIII與VWF功能是同一分子的2個(gè)功能。到了七十年代才得知FVIII與VWF是在生理?xiàng)l件下形成復(fù)合物的獨(dú)立的分子。到了八十年代測(cè)定出約0.2nmol/L的解離常數(shù)(Leyte et al.，BiochemJ1989, 257:679-683)，及研究了 2種分子的DNA序列。
[0005]經(jīng)典的血友病或血友病A是遺傳的出血障礙。其由凝血因子FVIII的染色體X-聯(lián)鎖的缺陷所致，及以每10，000個(gè)人介于I個(gè)和2個(gè)個(gè)體之間的發(fā)病率幾乎僅影響男性。X-染色體缺陷可被本身不是血友病患者的女性攜帶者傳遞。血友病A的臨床表現(xiàn)是增加的出血趨勢(shì)。用FVIII濃縮物治療之前，患嚴(yán)重的血友病的人的平均壽命少于20年。自血漿的FVIII濃縮物的使用顯著改善了血友病A患者的狀況，大大增加了平均壽命，假設(shè)他們中的大部分活大致正常壽命的可能性。但是，已有某些有關(guān)源于血漿的濃縮物及它們的使用的問題，其中最嚴(yán)重的問題是病毒傳播。迄今，導(dǎo)致乙型肝炎，非甲非乙型肝炎及AIDS的病毒已經(jīng)嚴(yán)重危害人群。從此以后，已新開發(fā)了不同的病毒滅活方法及新的高度純化的FVIII濃縮物，它們也對(duì)于血漿來源的FVIII建立了非常高的安全標(biāo)準(zhǔn)。
[0006]FVIII 的cDNA的克隆(Wood et al.1984.Nature312:330-336; Vehar et al.1984.Nature312:337-342 )使重組表達(dá)FVIII成為可能，導(dǎo)致開發(fā)了幾種重組FVI11產(chǎn)物，它們已在1992和2003之間被有關(guān)機(jī)關(guān)批準(zhǔn)。位于氨基酸Arg-740和Glu_1649之間的FVIII多肽鏈的中央B結(jié)構(gòu)域?qū)τ谌锘钚运坪醪皇潜匦璧氖聦?shí)也導(dǎo)致開發(fā)了刪除了B結(jié)構(gòu)域的
FVII1
[0007]成熟的FVIII分子由2332個(gè)氨基酸構(gòu)成，其可分為3個(gè)同源A結(jié)構(gòu)域，2個(gè)同源C結(jié)構(gòu)域及I個(gè)B結(jié)構(gòu)域，它們以下列順序排列:A1-A2-B-A3-C1-C2。成熟的人FVIII的完整氨基酸序列示于SEQ ID N0:15。在其分泌到血漿的過程中，F(xiàn)VIII被細(xì)胞內(nèi)加工為一系列金屬-離子連接的異源二聚體作為單鏈FVIII，其在B-A3邊界及在B-結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同位點(diǎn)被切割。此加工產(chǎn)生由Al，A2及B-結(jié)構(gòu)域的不同部分構(gòu)成的異源重鏈分子，其具有90kD~200kDa的分子大小。此重鏈經(jīng)金屬離子結(jié)合到輕鏈，所述輕鏈由A3，Cl及C2結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(Saenko et al.2002.Vox Sang.83:89-96)。在血漿中，此異源二聚體FVIII以高親和性結(jié)合馮?維勒布蘭德因子(VWF)，其保護(hù)其免于成熟前分解代謝。在血漿中非活化的FVIII結(jié)合VWF的半衰期為約12小時(shí)。
[0008]通過由FXa及凝血酶在重鏈內(nèi)的氨基酸Arg372及Arg740，及在輕鏈中的Argl689蛋白水解切割活化凝血因子FVIII，導(dǎo)致馮.維勒布蘭德因子釋放及產(chǎn)生活化的FVIII異源二聚體，其會(huì)在磷脂表面上與FIXa及FX形成tenase復(fù)合物，前提是Ca2+存在。異源二聚體由Al結(jié)構(gòu)域(50kDa片段)，A2結(jié)構(gòu)域(43kDa片段)及輕鏈(A3-C1-C2) (73kDa片段)構(gòu)成。因此，活化形式的FVIII (FVIIIa)由通過二價(jià)金屬離子連接物與經(jīng)凝血酶切割的A3-C1-C2輕鏈連接的Al-亞基及與Al及A3結(jié)構(gòu)域相對(duì)松散連接的游離A2亞基構(gòu)成。
[0009]為避免過量凝集，F(xiàn)VIIIa必需在活化之后很快滅活。經(jīng)活化的蛋白C (APC)通過在Arg336及Arg562切割的FVIIIa滅活不被認(rèn)為是主要的限速步驟。反倒是非共價(jià)附著的A2亞基從異源二聚體解離是凝血酶活化之后FVIIIa滅活中的限速步驟(Fay etal.1991.J.Biol.Chem.2668957，F(xiàn)ay&Smudzinl992.J.Biol.Chem.267:13246-50)。這是很快的過程，其解釋血漿中FVIIIa的短半衰期，其僅2.1分鐘(Saenko et al.2002.VoxSang.83:89-96)。
[0010]由于FVIII的約12~14小時(shí)的短血漿半衰期，嚴(yán)重的血友病A患者經(jīng)歷預(yù)防性治療FVIII必需每周靜脈內(nèi)(1.V.)施用約3次。每次靜脈內(nèi)施用都麻煩，伴隨疼痛及承擔(dān)感染的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是被診斷為血友病A的患者自己或兒童的父母在家進(jìn)行時(shí)。
[0011]因此非常需要制造出允許制備含F(xiàn)VIII的藥物組合物的具有增加的功能半衰期的FVIII，其必需低頻度施用。
[0012]已做了幾種嘗試，即通過如下手段延長(zhǎng)非活化的FVIII的半衰期:減少其與細(xì)胞受體的相互作用(W003/093313A2，W002/060951A2),將聚合物共價(jià)附著到FVIII(W094/15625,W097/11957 及 US4970300)，包裹 FVIII (W099/55306)，導(dǎo)入新的金屬結(jié)合位點(diǎn)(W097/03193)，通過肽鍵(W097/40145 及 W003/087355)或二硫鍵(W002/103024A2)將 A2結(jié)構(gòu)域共價(jià)附著到A3結(jié)構(gòu)域，或?qū)l結(jié)構(gòu)域共價(jià)附著到A2結(jié)構(gòu)域(W02006/108590)。
[0013]增加FVIII或VWF的功能半衰期的其他方法是FVIII的PEG化(W02007/126808，W02006/053299, W02004/075923)或 VWF 的 PEG 化(W02006/071801)，具有增加的半衰期的PEG化的VWF還會(huì)間接增加血漿中存在的FVIII的半衰期。
[0014]由于以上所列方法中尚未有一種方法得到獲得批準(zhǔn)的FVIII藥物，且由于向FVIII野生型序列導(dǎo)入突變或?qū)牖瘜W(xué)修飾至少要承擔(dān)產(chǎn)生免疫原性FVIII變體的理論風(fēng)險(xiǎn)，因此仍需要開發(fā)呈現(xiàn)延長(zhǎng)的半衰期的修飾的凝血因子VIII分子。
[0015]鑒于潛在的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)，相比延長(zhǎng)FVIIIa的半衰期，更期望延長(zhǎng)非活化形式的FVIII的半衰期。
[0016]有缺失，功能上有缺陷或僅以減少的量在不同形式的馮.維勒布蘭德病(VWD)中可用的VWF是哺乳動(dòng)物血漿中存在的多聚體粘著糖蛋白，其有多種生理功能。初次止血期間，VffF發(fā)揮血小板表面上的特異受體與細(xì)胞外基質(zhì)成分(例如膠原)之間的介質(zhì)的作用。而且，VWF發(fā)揮促凝劑FVIII的載質(zhì)及穩(wěn)定蛋白的作用。VWF在內(nèi)皮細(xì)胞及巨核細(xì)胞中合成為2813個(gè)氨基酸的前體分子。野生型VWF的氨基酸序列及cDNA序列公開于Collins etal.1987，Proc Natl.Acad.Sc1.USA84:4393 - 4397。前體多肽，前原 VffF,由見于成熟的血漿VWF的22個(gè)殘基的信號(hào)肽，741個(gè)殘基的原肽及2050個(gè)殘基的多肽構(gòu)成(Fischer etal., FEBS Lett.351:345-348, 1994)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)切割信號(hào)肽之后，在2個(gè)VWF單體之間形成C-端二硫橋。在轉(zhuǎn)運(yùn)通過分泌通路期間添加12個(gè)N聯(lián)的及10個(gè)O聯(lián)的碳水化合物側(cè)鏈。更重要的是，VWF 二聚體經(jīng)N-端二硫橋多聚化，及在晚期高爾基體中用酶PACE/弗林蛋白酶切割下741個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的原肽。VWF (VWF-HMWM)的原肽以及高分子量多聚體儲(chǔ)存在內(nèi)皮細(xì)胞的魏伯爾-帕拉德小體內(nèi)或血小板的α-顆粒內(nèi)。
[0017]一旦分泌到血漿中，蛋白酶ADAMTS13在VWF的Al結(jié)構(gòu)域內(nèi)切割VWF。血漿VWF因此由整個(gè)范圍的多聚體構(gòu)成，所述范圍從500kDa的單個(gè)二聚體到由分子量超過10，OOOkDa的達(dá)多于20個(gè)二聚體構(gòu)成的多聚體。VWF-HMWM因此具有最強(qiáng)的止血?jiǎng)┗钚?，其可以利托菌素輔因子活性(VWF = RCo)測(cè)量。VWF: RCo/VWF抗原比越高，高分子量多聚體的相對(duì)量越高。
[0018]VWF中的缺陷引發(fā)馮.維勒布蘭德病(VWD)，其特征在于多少顯著的出血表型。3型VWD是最嚴(yán)重形式，其中VWF完全缺失，I型VWD涉及定量喪失WF,且其表型可非常微小。2型VWD涉及VWF的定性缺陷，且可嚴(yán)重如3型VWD。2型VWD有許多亞型，其中一些關(guān)聯(lián)于高分子量多聚體的缺失或減少。2a型Von VWD的特征在于缺失中等的及大的多聚體。2B型VWD的特征在于缺失最高分子量的多聚體。VWD是人最常見的遺傳出血障礙，且可通過用含質(zhì)?；蛑亟M來源的VWF的濃縮物的取代療法治療。VWF可從人血漿中制備，例如描述于EP05503991。EP0784632描述了分離重組VWF的方法。
[0019] 血漿中FVIII以高親和性結(jié)合von VWF，其保護(hù)其免于成熟前分解代謝，及因此除了其初次止血中的作用之外，還在調(diào)節(jié)血漿FVIII水平中起關(guān)鍵作用，結(jié)果還是控制二次止血的中心因子。血漿中非活化的FVIII束縛于VWF的半衰期為約12~14小時(shí)。3型馮?維勒布蘭德病中，無或幾乎不存在VWF，F(xiàn)VIII的半衰期僅為約6小時(shí)，由于FVIII的降低的濃度，該患者中導(dǎo)致微小到溫和的血友病A的癥狀。VWF對(duì)FVIII的穩(wěn)定作用還用于輔助 CHO 細(xì)胞中 FVIII 的重組表達(dá)(Kaufman et al.1989, Mol Cell Biol)。
[0020]而今，血友病A及VWD的標(biāo)準(zhǔn)治療涉及頻頻靜脈輸注FVIII制劑及VWF濃縮物或包括源于人供者血漿的FVIII及VWF的復(fù)合物的濃縮物，或在FVIII的情況中，基于重組FVIII的藥物制劑。同時(shí)這些取代療法一般有效，例如在經(jīng)歷預(yù)防性治療的嚴(yán)重的血友病A患者中，由于約12小時(shí)的FVIII的短血漿半衰期，F(xiàn)VIII必需每周靜脈內(nèi)(1.V.)施用約3次。非血友病患者中上述1%的FVIII活性水平，例如通過升高0.01U/ml的FVIII水平，將嚴(yán)重的血友病A轉(zhuǎn)變?yōu)闇睾偷难巡。在預(yù)防性治療中，劑量方案設(shè)計(jì)為FVIII活性的低谷水平不降到非血友病患者中FVIII活性的2~3%水平以下。每次靜脈內(nèi)施用都麻煩，伴隨疼痛及承擔(dān)感染的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是常在由被診斷為患血友病A的患者自身或兒童的父母進(jìn)行的家中治療中。此外，頻頻靜脈內(nèi)注射不可避免地導(dǎo)致瘢痕形成，干擾將來的輸注。由于嚴(yán)重的血友病的預(yù)防性治療開始于生命的早期，兒童常常小于2歲，這更難以每周注射FVIII3次到那么小的患者的靜脈內(nèi)。對(duì)于受限的時(shí)期，端口系統(tǒng)的植入常為替代性方法。盡管重復(fù)的感染可發(fā)生，且端口可導(dǎo)致身體運(yùn)動(dòng)期間的不便，然而他們通常認(rèn)為相比靜脈內(nèi)注射有利。
[0021]人循環(huán)中人VWF的體內(nèi)半衰期為約12~20小時(shí)。在VWD (例如3型)的預(yù)防性治療中還高度希望發(fā)現(xiàn)延長(zhǎng)VWF的功能半衰期的方法。另一加長(zhǎng)VWF的功能半衰期的方法是PEG化(W02006/071801 )，PEG化的VWF有增加的半衰期，其還間接加長(zhǎng)血漿中存在的FVIII的半衰期。
[0022]但是，PEG或其他分子與治療性蛋白的化學(xué)綴合總是要承擔(dān)如下風(fēng)險(xiǎn)，由于與其他蛋白的重要相互作用位點(diǎn)被罩住，特異活性降低，化學(xué)綴合在制備該蛋白中增加了額外的步驟，降低了最終產(chǎn)率及加大的制備的成本。對(duì)人健康的長(zhǎng)效影響也不清楚，因?yàn)槟壳耙阎腜EG化的治療性蛋白不是如在馮?維勒布蘭德病的預(yù)防中施用的VWF或在血友病A中施用的FVIII的情況中一樣需要終生施用。
[0023]高度需要得到未被化學(xué)修飾的長(zhǎng)壽的VWF。
[0024]現(xiàn)有技術(shù)中已描述了凝血因子與作為加長(zhǎng)半衰期的多肽的白蛋白(W001/79271)，α -甲胎蛋白(W02005/024044)及免疫球蛋白(W02004/101740)的融合。這些被連接到相應(yīng)治療性蛋白部分的羧基-或氨基-端或者兩端，有時(shí)通過肽接頭連接，優(yōu)選通過由甘氨酸及絲氨酸構(gòu)成的接頭連接。
[0025]Ballance等人(W001/79271)描述了多個(gè)不同治療性多肽融合到人血清白蛋白的N-或C-端融合多肽。其描述了潛在的融合偶體的長(zhǎng)列表，但就是否相應(yīng)白蛋白融合蛋白實(shí)際上保持生物活性及具有提 高的特性，未公開幾乎任何這些多肽的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。所述治療性多肽列表中也提到了 FVIII及VWF。
[0026]本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)認(rèn)真考慮C-端融合，因?yàn)樵贔VIII的氨基酸2303與2332之間的FVIII的甚C-端部分的FVIII的C2結(jié)構(gòu)域包括血小板膜結(jié)合位點(diǎn)，其必要于FVIII功能。這也是為什么這區(qū)域已知有許多導(dǎo)致血友病A的氨基酸突變。因此驚訝地發(fā)現(xiàn)，相對(duì)大的異源多肽(如白蛋白)可融合到FVIII的C-端部分，而不通過阻止血小板結(jié)合阻止FVIII功能。此外，C2結(jié)構(gòu)域還含VWF的結(jié)合位點(diǎn)。這位點(diǎn)及氨基酸序列1649~1689負(fù)責(zé)FVIII與VWF的高親和性結(jié)合。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員還不預(yù)期有C-端白蛋白融合的FVIII會(huì)保持其與VWF結(jié)合。
[0027]驚訝地發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于Ballance等人的預(yù)測(cè)，白蛋白融合到FVIII的N-端不分泌到培養(yǎng)基。因此及因?yàn)槿缟显斒龅睦碛?，更驚訝地發(fā)現(xiàn)，于其C-端部分融合到白蛋白的FVIII分泌到培養(yǎng)基，及保持其包括結(jié)合活化的血小板膜及結(jié)合VWF在內(nèi)的生物功能。
[0028]還驚訝地發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的修飾的FVI11顯示相比野生型FVI11約20%增加的體內(nèi)恢復(fù)。
[0029]本領(lǐng)域技術(shù)人員還未想到將人白蛋白融合到VWF的N-或C-端。在N-端融合中，白蛋白部分會(huì)在原肽加工期間被切割下。或如果略去原肽，多聚化不會(huì)發(fā)生。如上所述，VffF的C-端必要于初始二聚化及必要于分泌，如Schneppenheim等人(Schneppenheim R.etal.1996.Defective dimerization of VWF subunits due to a Cys to Arg mutation inVWD type IID.Proc Natl Acad Sci USA93:3581-3586;Schneppenheim R.et al.2001.Expression and characterization of VWF dimerization defects in different typesof VWD.Blood97:2059-2066.)，Baronciani 等人(Baronciani Let al.2000.Molecularcharacterization of a multiethnic group of21patients with VffD type3.Thromb.Haemost84:536-540), Enayat 等人(Enayat MS et al.2001.Aberrant dimerization ofVffF as the result of mutations in the carboxy-terminal region:1dentificationof3mutations in members of3different families with type2A(phenotype IID)VWD.Blood98:674-680)及 Tjernberg 等人(Tjernberg et al.2006.Homozygous C2362F VffFinduces intracellular retention of mutant VffF resulting in autosomal recessivesevere VWD.Br J Haematol.133:409-418)所不。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員不會(huì)想到大蛋白(如人白蛋白)與VWF的C-或N-端的融合，如其預(yù)期VWF的正常二聚化或多聚化一樣，會(huì)被損壞。隨著VWF的更高多聚體在初次止血中最活躍，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)考慮其他方法延長(zhǎng)VWF的功能半衰期。
[0030]現(xiàn)令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，異源多肽(例如白蛋白)與VWF的C-端部分融合，不僅使得VWF嵌合蛋白從哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)及分泌，還得到保持顯著的VWF活性及形成高分子量多聚體的修飾的VWF分子。此外，該修飾的VWF分子呈現(xiàn)延長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期和/或提高的體內(nèi)恢復(fù)。
[0031]【發(fā)明概述】
[0032]本發(fā)明旨在提供具有加長(zhǎng)的體內(nèi)半衰期的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物。
[0033]本發(fā)明中術(shù)語“修飾的FVIII”或“修飾的VWF”是指融合到加長(zhǎng)半衰期的多肽的FVIII或VWF多肽，還含蓋FVIII或VWF的天然等位體，變體，刪除及插入。
[0034]本發(fā)明還旨在提供具有提高的體內(nèi)恢復(fù)的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物。
[0035]本發(fā)明另一目的在于，這修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VffF的復(fù)合物可由哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)，及保持它們相應(yīng)的生物活性。
[0036]總之，本發(fā)明的所述修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVI11與非修飾的VffF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物意料之外地保持生物活性，具有增加的體內(nèi)半衰期及體內(nèi)恢復(fù)。
[0037]本發(fā)明的FVIII被修飾且活化之后A2結(jié)構(gòu)域僅保持非共價(jià)連接到A3結(jié)構(gòu)域的那些實(shí)施方式的潛在益處是僅非活化形式的FVIII的半衰期增加，而活化形式的FVIII的半衰期基本上保持相同，其相比導(dǎo)致活化形式的FVIII穩(wěn)定的FVIII變體，可導(dǎo)致降低的血栓形成風(fēng)險(xiǎn)。
[0038]本發(fā)明的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF分子的復(fù)合物可通過加長(zhǎng)半衰期的蛋白(HLEP)部分與FVIII的C-端部分或與VWF的C-端部分融合產(chǎn)生。
[0039]本發(fā)明中的HLEP選自:白蛋白家族成員，其包括:白蛋白，afamin, α -甲胎蛋白及維生素D結(jié)合蛋白，以及免疫球蛋白恒定區(qū)部分及能在生理?xiàng)l件下結(jié)合白蛋白家族成員以及結(jié)合免疫球蛋白恒定區(qū)部分的多肽。最優(yōu)選的HLEP是人白蛋白。
[0040]本發(fā)明因此涉及于所述修飾的FVIII和/或VWFC-端部分融合到HLEP的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，以及修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，特征在于:所述修飾的FVIII，或者修飾的VWF，以及修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVII1、或野生型VWF、或者野生型VWF與野生型FVIII的復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期。
[0041]本發(fā)明還涉及C-端融合到多于一個(gè)HLEP，其中所述HLEP (其融合幾次)可為相同的HLEP或可為不同HLEP的組合。
[0042]本發(fā)明還涉及于C-端部分融合到HLEP的修飾的FVIII，特征在于，所述修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVII1、或野生型VWF、或者野生型VWF與野生型FVIII的復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)提高的體內(nèi)恢復(fù)。
[0043]本發(fā)明的另一實(shí)施方式是于C-端部分融合到HLEP的修飾的FVIII多肽，特征在于，所述修飾的FVIII以比野生型FVIII更高的產(chǎn)率分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0044]本發(fā)明另一方面是編碼所述修飾的FVIII和/或所述修飾的VWF的多核苷酸或多核苷酸的組合。
[0045]本發(fā)明還涉及包括本文所述的多核苷酸的質(zhì)?；蜉d體,涉及包括本文所述的多核苷酸或質(zhì)?；蜉d體的宿主細(xì)胞。
[0046]本發(fā)明另一方面是產(chǎn)生修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者修飾的FVIII與修飾的VffF的復(fù)合物的方法，包括:
[0047](a)在所述修飾的凝血因子表達(dá)的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞 '及
[0048](b)任選從宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基回收所述修飾的凝血因子。
[0049]本發(fā)明還涉及包括修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VffF的復(fù)合物，或者非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，多核苷酸，或本文所述的質(zhì)?；蜉d體的藥物組合物。
[0050]本發(fā)明另一方面是本發(fā)明的修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，或者非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，一種或多種多核苷酸，或一種或多種質(zhì)粒或載體，或宿主細(xì)胞用于制備治療或預(yù)防血凝集障礙的藥物的用途。
[0051]【發(fā)明詳述】
[0052]本發(fā)明涉及復(fù)合物，其包括:FVIII及von VWF，或其獨(dú)立多肽成分之一，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端部分融合到加長(zhǎng)半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。
[0053]本發(fā)明還涉及修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VffF的復(fù)合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中所述修飾的FVIII于FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或所述修飾的VWF于VWF的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分。
[0054]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式涉及修飾的FVIII,或者修飾的VWF,或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中，
[0055](a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或
[0056](b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或
[0057](c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或
[0058](d)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或
[0059](e)所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的 功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期。
[0060]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期。
[0061]本發(fā)明的另一實(shí)施方式是:修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中，
[0062](a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或
[0063](b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或
[0064](c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或
[0065]Cd)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或
[0066](e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期。
[0067]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期。
[0068]本發(fā)明的再一實(shí)施方式是修飾的FVIII，或者修飾的VWF，或者包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中，
[0069](a)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或
[0070](b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或
[0071](c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或
[0072]Cd)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或
[0073](e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)。
[0074]本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的體內(nèi)恢復(fù)增加至少10%的體內(nèi)恢復(fù)，或所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物增加至少10%的體內(nèi)恢復(fù)。
[0075]本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式是:
[0076](a)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分，或
[0077](b)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸，或
[0078](C)如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。
[0079]本發(fā)明的另一優(yōu)選的實(shí)施方式是如上所述的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述修飾的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10%，或所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的生物活性的至少10%。
[0080]本發(fā)明還包括制備具有增加的功能半衰期的修飾的FVIII或修飾的VWF的方法，包括將加長(zhǎng)半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分或融合到VffF的主要翻譯多肽的C-端部分；以及制備包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物的方法，通過混合上述方法制備的修飾的FVIII與野生型VWF，或通過混合野生型FVIII與上述方法制備的修飾的VWF，或通過混合上述方法制備的修飾的FVIII與修飾的VWF。
[0081]本發(fā)明還包括下列物質(zhì)用于制備同時(shí)、分開或依次用于治療出血障礙，優(yōu)選用于治療血友病A和/或馮.維勒布蘭德病的聯(lián)合藥物制劑的用途:
[0082]Ca)上述方法制備的修飾的FVIII及野生型VWF，或
[0083](b)野生型FVIII及上述方法制備的修飾的VWF，或
[0084](c)上述方法制備的修飾的FVIII及上述方法制備的修飾的WF0
[0085]本發(fā)明中的“功能半衰期”是所述修飾的FVI11或所述修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物或非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物一旦施用給哺乳動(dòng)物的生物活性半衰期，及可在所述修飾的FVIII或所述修飾的VWF，或者修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，或者非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物已施用之后，從所述哺乳動(dòng)物以不同的時(shí)間間隔取得的血樣品中體外測(cè)量。
[0086]詞〃融合〃或〃融合的〃是指將氨基酸添加到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分。當(dāng)本文說道“融合到FVIII的C-端氨基酸”或“融合到VWF的C-端氨基酸”，時(shí)，是指于成熟的野生型FVIII的氨基酸2332的cDNA序列精確融合到FVIII的C-端氨基酸，或于野生型成熟的VWF的氨基酸2050精確融合到VWF的C-端氨基酸。成熟的FVIII或成熟的VWF是指原肽切割之后的相應(yīng)多肽。但是，本發(fā)明還含蓋本發(fā)明中的“融合到FVIII的C-端部分”或“融合到VWF的C-端部分”，其還可包括分別融合到FVIII和/或VWF分子，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置，直到η個(gè)氨基酸從FVIII和/或VWF的C-端氨基酸被刪除。η是不應(yīng)大于FVIII和/或VWF的氨基酸總數(shù)的5%，優(yōu)選不大于1%的整數(shù)。通常，η是20，優(yōu)選15，更優(yōu)選10，再更優(yōu)選5或更小(例如1，2，3，4或5)。 [0087]在一實(shí)施方式中，所述修飾的FVIII具有以下結(jié)構(gòu):
[0088]N-FVII1-C-L1-H，[式 I]
[0089]其中，
[0090]N是FVIII的N-端部分，
[0091]LI是化學(xué)鍵或接頭序列，
[0092]H 是 HLEP，及
[0093]C是FVIII的C-端部分。
[0094]另一實(shí)施方式中所述修飾的VWF具有以下結(jié)構(gòu):
[0095]N-VWF-C-L1-H，[式 2]
[0096]其中，
[0097]N是VWF的N-端部分，
[0098]LI是化學(xué)鍵或接頭序列，
[0099]H 是 HLEP，及
[0100]C是VWF的C-端部分。
[0101]LI可為由一個(gè)或多個(gè)氨基酸構(gòu)成的化學(xué)鍵或接頭序列，例如I~20，I~15，I~10，1~5或I~3 (例如1，2或3)個(gè)氨基酸，及其可彼此相同或不同。通常，接頭序列不存在于野生型凝血因子的相應(yīng)位置。存在于LI中的適宜氨基酸的例包括Gly及Ser。
[0102]優(yōu)選的HLEP序列如下所述。本發(fā)明還包括到相應(yīng)HLEP的精確“N-端氨基酸”的融合體，或到相應(yīng)HLEP的“N-端部分”的融合體，其包括:N-端刪除HLEP的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
[0103]本發(fā)明的所述修飾的FVIII或所述修飾的VWF或所述修飾的FVIII與非修飾的VffF的復(fù)合物，非修飾的FVIII與所述修飾的VWF的復(fù)合物或所述修飾的FVIII與修飾的VffF的復(fù)合物可包括多于一個(gè)HLEP序列，例如2或3個(gè)HLEP序列。這些多個(gè)HLEP序列可串聯(lián)融合到FVIII的C-端部分和/或VWF的C-端部分，例如作為連續(xù)重復(fù)子。
[0104]FVIII可在各階段經(jīng)蛋白水解加工。例如，如上所述，在其分泌到血漿期間，單鏈FVIII在細(xì)胞內(nèi)在B-A3邊界及在B-結(jié)構(gòu)域內(nèi)的不同位點(diǎn)被切割。重鏈經(jīng)金屬離子束縛到具有結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)A3-C1-C2的輕鏈。FVIII經(jīng)在重鏈內(nèi)的氨基酸Arg372及Arg740及在輕鏈內(nèi)的Argl689蛋白水解切割而活化產(chǎn)生活化的由Al結(jié)構(gòu)域，A2結(jié)構(gòu)域，及輕鏈(A3-C1-C2)構(gòu)成的FVIII異源二聚體，73kDa片段。因此，活躍形式的FVIII (FVIIIa)構(gòu)成由通過二價(jià)金屬離子連接物與凝血酶切割的A3-C1-C2輕鏈連接的Al-亞基及與Al及A3結(jié)構(gòu)域相對(duì)松散連接的游離A2亞基。
[0105]因此，本發(fā)明還含蓋不存在為單鏈多肽，但由經(jīng)非共價(jià)鍵彼此連接的幾個(gè)多肽(例如I個(gè)或2個(gè)或3個(gè))構(gòu)成的修飾的FVIII。
[0106]優(yōu)選N - FVII1- C包括FVIII的全長(zhǎng)序列。只要保持FVIII的生物活性，還包括FVIII的N-端，C-端或內(nèi)部缺失。如果具有缺失的FVIII保持至少10%，優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少50%，最有選至少75%的野生型FVIII的生物活性，則在本發(fā)明中認(rèn)為保持生物活性。FVIII的生物活性可如下所述由本領(lǐng)域技術(shù)人員測(cè)定。
[0107]測(cè)定FVIII的生物活性的適宜測(cè)試?yán)缫徊交騼刹侥囼?yàn)(Rizza etal.1982.Coagulation assay of FVII1:C and FIXa in Bloom ed.The Hemophilias.NY Churchchill Livingstonl992)或顯色底物 FVII1:C 試驗(yàn)(S.Rosen，1984.Scand JHaematol33:139-145, suppl.)。將這些參考文獻(xiàn)的內(nèi)容通過引用并入本文。成熟的野生型的人凝血因子FVIII的cDNA序列及氨基酸序列分別顯示于SEQ ID N0:14及SEQ ID NO:
15。說道特定序列的氨基酸位置，是指所述氨基酸在FVIII野生型蛋白中的位置，及不排除突變的存在，所述突變例如在所述序列中的其他位置的缺失，插入和/或置換。例如，SEQID NO:15的〃Glu2004〃中的突變不排除在修飾的同源體中，在SEQ ID NO:15的位置I~2332的一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失。
[0108]術(shù)語〃凝血因子V III"，〃因子VIII〃及“FVIII"在本文互換使用?！蜃覸III"包括:野生型凝血因子FVIII，以及具有野生型凝血因子FVIII的促凝劑活性的野生型凝血因子FVIII的衍生物。衍生物可相比野生型FVIII的氨基酸序列有缺失，插入和/或添加。術(shù)語FVIII包括:蛋白水解加工形式的FVIII，例如活化之前的形式，包括重鏈及輕鏈。
[0109]術(shù)語"FVIII"包括具有野生型因子VIII的生物活性的至少25%，更優(yōu)選至少50%，最有選至少75%的任何FVIII變體或突變體。
[0110]作為非限制性實(shí)施例，F(xiàn)VIII分子包括:阻止或減少APC切割的FVIII突變體(Amanol998.Thromb.Haemost.79:557-563),進(jìn)一步穩(wěn)定 A2 結(jié)構(gòu)域的 FVIII突變體(W097/40145)，導(dǎo)致增加的表達(dá)的FVIII突變體(Swaroop et al.1997.JBC272:24121-24124),降低其免疫原性的 FVIII 突變體(LolIar1999.Thromb.Haemost.82:505-508)，由差異表的重鏈及輕鏈重構(gòu)的 FVIII (Oh et al.1999.Exp.Mol.Med.31:95-100),降低與受體結(jié)合導(dǎo)致FVIII如HSPG (硫酸乙酰肝素蛋白聚糖)和/或LRP (低密度脂蛋白受體關(guān)聯(lián)蛋白)分解代謝的FVIII突變體(Ananyeva etal.2001.TCM, 11:251-257)，二硫鍵-穩(wěn)定的 FVIII 變體(Gale et al.，2006.J.Thromb.Hemost.4:1315-1322)，具有提高的分泌特性的 FVIII 突變體(Miao et al.，2004.Bloodl03:3412-3419),具有增加的輔因子特異活性的FVIII突變體(Wakabayashi etal.，2005.Biochemistry44:10298-304),具有提高的生物合成及分泌，將少的ER伴侶蛋白相互作用，提高的ER-Golgi轉(zhuǎn)運(yùn)，增加的活化或針對(duì)滅活的抗性及提高的半衰期的FVIII突變體(總結(jié)于Pipe2004.Sem.Thromb.Hemost.30:227-237)。所有這些FVIII突變體及變體通過引用整體并入本文。[0111]VffF可在各階段經(jīng)蛋白水解加工。例如，如上所述，蛋白酶ADAMTS13在VWF的A2結(jié)構(gòu)域內(nèi)切割VWF。因此，本發(fā)明還含蓋已被蛋白水解切割(例如被ADAMTS13)的修飾的VWF。所述切割會(huì)產(chǎn)生在它們的末端包括至少I個(gè)或最多2個(gè)已被ADAMTS13切割的VWF單體的VffF多聚體鏈。
[0112]優(yōu)選N-VWF-C包括VWF的全長(zhǎng)序列。只要保持VWF的生物活性，還包括VWF的N-端，C-端或內(nèi)部缺失。如果具有缺失的VWF保持至少10%，優(yōu)選至少25%，更優(yōu)選至少50%，最有選至少75%的野生型VWF的生物活性，則在本發(fā)明中認(rèn)為保持生物活性。野生型VWF的生物活性可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用利托菌素輔因子活性(Federici AB etal.2004.Haematologica89:77-85), VWF 與血小板糖蛋白復(fù)合物 Ib-V-1X 的 GP Iba 的結(jié)合(Sucker et al.2006.Clin Appl Thromb Hemost.12:305-310),或膠原結(jié)合試驗(yàn)(Kallas&Talpsep.2001.Annals of Hematology80:466-471)的方法來測(cè)定。
[0113]在上述定義內(nèi)〃FVIII〃和/或〃VWF〃還包括可在個(gè)體之間存在及出現(xiàn)的天然等位變異。在上述定義內(nèi)“FVIII"和/或〃VWF〃還包括FVIII及或VWF的變體。該變體與野生型序列相差一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基。該差異的例可包括保守氨基酸置換，即具有類似特性的氨基酸組內(nèi)置換，例如(I)小氨基酸，(2)酸性氨基酸，(3)極性氨基酸，(4)堿性氨基酸，(5)疏水性氨基酸，及(6)芳族氨基酸。所述保守置換的例顯示于下表。
[0114]表1
[0115]
【權(quán)利要求】
1.復(fù)合物，其包括:因子VIII(FVIII)及馮?維勒布蘭德因子(VWF)，或其獨(dú)立多肽成分之一，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分或其獨(dú)立成分中的至少一種于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端部分融合到加長(zhǎng)半衰期的多肽(HLEP)的N-端部分。
2.修飾的FVIII，或者 修飾的von VWF，或者 包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中， 所述修飾的FVIII于FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分，或 所述修飾的VWF于VWF的主要翻譯多肽的C-端部分融合到HLEP的N-端部分。
3.權(quán)利要求1或2的 修飾的FVIII，或者 修飾的VWF，或者 包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中， Ca)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或 (b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或 (c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或 Cd)所述包括非修飾的FVIII及修飾`的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期，或 (e)所述修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物具有相比包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期延長(zhǎng)的功能半衰期。
4.權(quán)利要求3的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中， 所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期，或 所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的功能半衰期增加至少25%的功能半衰期。
5.權(quán)利要求1或2的 修飾的FVIII，或者 修飾的VWF，或者 包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中 Ca)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或 (b)所述修飾的VWF具有相比野生型VWF的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或 (c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或 Cd)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VffF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期，或 (e)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期延長(zhǎng)的抗原半衰期。
6.權(quán)利要求5的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中， 所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期，或 所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的抗原半衰期增加至少25%的抗原半衰期。
7.權(quán)利要求1或2的 修飾的FVIII，或者 修飾的VWF，或者 包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物，其中 Ca)所述修飾的FVIII具有相比野生型FVIII的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或 (b)所述修飾的VWF具有 相比野生型VWF的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或 (c)所述包括修飾的FVIII及非修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或 Cd)所述包括非修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)，或 Ce)所述包括修飾的FVIII及修飾的VWF的復(fù)合物具有相比所述包括野生型FVIII及野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的體內(nèi)恢復(fù)增加的體內(nèi)恢復(fù)。
8.權(quán)利要求7的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中， 所述修飾的多肽具有相比相應(yīng)野生型多肽的體內(nèi)恢復(fù)增加至少10%的體內(nèi)恢復(fù)，或所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有相比野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物增加至少10%的體內(nèi)恢復(fù)。
9.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端部分。
10.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端部分融合到HLEP的N-端氨基酸。
11.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物的至少一種多肽成分于其主要翻譯產(chǎn)物的C-端氨基酸融合到HLEP的N-端氨基酸。
12.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中， 所述修飾的多肽具有野生型多肽的生物活性的至少10%，或 所述包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物具有野生型FVIII與野生型VWF的相應(yīng)復(fù)合物的生物活性的至少10%。
13.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述HLEP選自:白蛋白家族蛋白及免疫球蛋白恒定區(qū)。
14.權(quán)利要求13的修飾的多肽，或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物，其中所述HLEP是白蛋白或其片段。
15.以上權(quán)利要求中任一項(xiàng)的重組的修飾的FVIII，其中所述重組的修飾的FVIII以比野生型FVIII更高產(chǎn)率由哺乳動(dòng)物細(xì)胞分泌。
16.多核苷酸或多核苷酸組,其編碼權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)的多肽,或者包括所述修飾的多肽的復(fù)合物或包括多種所述修飾的多肽的復(fù)合物。
17.質(zhì)?；蜉d體,所述質(zhì)?；蜉d體包括權(quán)利要求16的多核苷酸,或質(zhì)粒或載體組,所述組包括權(quán)利要求16的多核苷酸組。
18.權(quán)利要求17的質(zhì)?；蜉d體，或者質(zhì)?；蜉d體組，所述質(zhì)?；蜉d體是表達(dá)載體。
19.權(quán)利要求17的載體或載體組，其為用于人基因治療的轉(zhuǎn)移載體。
20.宿主細(xì)胞，其包括: 權(quán)利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或者 權(quán)利要求17~19中任一項(xiàng)的質(zhì)?；蜉d體,或者質(zhì)粒或載體組。
21.產(chǎn)生修飾的VWF的方法，包括: Ca)在所述修飾的VWF表達(dá)的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞；及 (b)任選從宿主細(xì)胞或從培養(yǎng)基回收所述修飾的VWF。
22.藥物組合物，其包括: 權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)的多肽或包括所述修飾的多肽的復(fù)合物， 權(quán)利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或 權(quán)利要求17~19中任一項(xiàng)的質(zhì)粒或載體,或者質(zhì)?；蜉d體組。
23.下列用于制備治療或預(yù)防血凝集障礙的藥物的用途: 權(quán)利要求1~15中任一項(xiàng)的多肽或包括所述修飾的多肽的復(fù)合物， 權(quán)利要求16的多核苷酸或多核苷酸組，或 權(quán)利要求17~19中任一項(xiàng)的質(zhì)?；蜉d體,或者質(zhì)?；蜉d體組,或 權(quán)利要求20的宿主細(xì)胞。
24.權(quán)利要求23的用途，其中所述血凝集障礙是血友病A。
25.權(quán)利要求23的用途，其中所述血凝集障礙是馮.維勒布蘭德病。
26.權(quán)利要求23~25中任一項(xiàng)的用途，其中所述治療包括人基因治療。
27.制備具有增加的功能半衰期的修飾的FVI11或修飾的VWF的方法，包括將加長(zhǎng)半衰期的多肽的N-端部分融合到FVIII的主要翻譯多肽的C-端部分或融合到VWF的主要翻譯多肽的C-端部分。
28.制備下列復(fù)合物的方法: 包括修飾的FVIII與非修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括非修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物，或者 包括修飾的FVIII與修飾的VWF的復(fù)合物， 如下制備: 混合通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的FVIII與野生型VWF，或 混合野生型FVIII與通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的VWF，或 混合通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的FVIII與修飾的VWF。
29.下列物質(zhì)用于制備同時(shí)、分開或依次用于治療出血障礙，優(yōu)選用于治療血友病A和/或馮.維勒布蘭德病的聯(lián)合藥物制劑的用途: Ca)通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的FVIII及野生型VWF，或 (b)野生型FVIII及通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的VWF，或 (c)通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的FVIII及通過權(quán)利要求27的方法制備的修飾的VWF。
【文檔編號(hào)】C12N15/62GK103739712SQ201310596839
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2009年6月24日 優(yōu)先權(quán)日:2008年6月24日
【發(fā)明者】T·魏默, S·舒爾特, H·米茲尼爾, U·克龍塞勒, H·林德, W·朗 申請(qǐng)人:德國(guó)杰特貝林生物制品有限公司