一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特點(diǎn)是在檸檬酸發(fā)酵過程中，向發(fā)酵罐中流加蛋白酶，使培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)水解成小分子肽類、氨基酸等菌種能快速利用的氮源。本發(fā)明不僅可以提高發(fā)酵液中菌種可直接利用的氨基酸含量，還可以使與蛋白結(jié)合的淀粉顆粒充分溶出，降低發(fā)酵液粘度，提高發(fā)酵液中氧的傳遞效率，加快菌種產(chǎn)酸，解決了目前檸檬酸生產(chǎn)中發(fā)酵的初期菌種利用蛋白質(zhì)的效果差的不足，縮短發(fā)酵周期，降低殘總糖和發(fā)酵糧耗，提高企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)檸檬酸的方法，尤其涉及一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]檸檬酸，學(xué)名2-羥基丙烷-1，2，3-三羧酸，分子式C6H8O7 (無水物)，是一種廣泛地應(yīng)用于食品，醫(yī)藥和化工領(lǐng)域的有機(jī)酸。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，各行各業(yè)對檸檬酸的需求量將穩(wěn)步上升，當(dāng)然各企業(yè)面對的挑戰(zhàn)與機(jī)遇也越來越多。主要用于食品工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、化學(xué)工業(yè)，并且在電子、紡織、石油、皮革、建筑、攝影、塑料、鑄造和陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域中也有十分廣闊的應(yīng)用。
[0003]目前，檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)中存在發(fā)酵初期菌種利用蛋白質(zhì)的效果差，菌種生長過慢，發(fā)酵產(chǎn)酸速度較慢，菌種過度消耗碳源，發(fā)酵殘總糖偏高，糖酸轉(zhuǎn)化率偏低，發(fā)酵周期偏長、能耗高，設(shè)備利用率低等不足之處，嚴(yán)重制約了檸檬酸行業(yè)的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述問題，本發(fā)明提出了一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，提高了發(fā)酵產(chǎn)酸速率、縮短了發(fā)酵周期，又能提高產(chǎn)酸和轉(zhuǎn)化率，解決了目前檸檬酸生產(chǎn)中發(fā)酵的初期菌種利用蛋白質(zhì)的效果差的不足，特別是菌種能快速利用的氨基酸不足，造成菌種生長過慢，發(fā)酵產(chǎn)酸延滯，發(fā)酵周期偏長、能耗高和設(shè)備利用率低等問題。
[0005]本發(fā)明的具體步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉；
(2)將步驟(1)所得的玉米粉加水調(diào)漿，并向其中加入耐高溫a-淀粉酶，每克玉米粉加入5-30個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將步驟(2)所得的玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，得液化液；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積2.5-10%的液化液，投入種子罐中，加入氮源，每升發(fā)酵液中加入0.05-0.5g氮源，在80-121°C消毒15-30分鐘后，降溫至30_38°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)26-32h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積10-25%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液過濾得過濾清液；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積65-80%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，80-121°C消毒15-30分鐘后，降溫至35-38 °C ；
(8)將步驟(4)中培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，向發(fā)酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶的添加量為每克干基5-30個(gè)酶單位，干基為發(fā)酵液中的純干物質(zhì)，35-38 °C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵終了。
[0006]首先，將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后的玉米粉過60目篩透過率為60%以上，若玉米粉粒度過大，不利于液化；若玉米粉粒度過小，會給粉碎工序增加較大的難度，增加電耗和工作量，所以粉碎后的玉米粉60目的透過率在60%以上時(shí)利于液化并且節(jié)約成本。加水調(diào)漿，調(diào)漿后玉米粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-35%，在此質(zhì)量分?jǐn)?shù)內(nèi)便于進(jìn)行液化反應(yīng)且節(jié)約成本，玉米粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高造成料液輸送困難，難于液化；過低造成液化噴射所用蒸汽消耗增加，增加生產(chǎn)成本。PH為5.0-7.8，由于pH過高或過低都會使得淀粉酶的活性受到抑制，不利于后期的液化，導(dǎo)致玉米渣中殘留的淀粉較多，造成部分的淀粉的損失，引起資源的浪費(fèi)，所以通過添加少量檸檬酸母液或者生石灰對玉米粉調(diào)漿的PH進(jìn)行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)后控制在
5.0-7.8,在此范圍內(nèi)取得最佳的實(shí)驗(yàn)效果。并向其中加入耐聞溫淀粉酶，每克玉米粉加入5-30個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，加入過多造成生產(chǎn)成本增加，加入過少使得液化效果較差，得玉米粉漿。[0007]將玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，得液化液，第一次噴射液化主要是促進(jìn)淀粉酶與淀粉的迅速作用，使得淀粉初步液化，為了保證淀粉酶和穩(wěn)定性都較高，有利于淀粉的液化，第一次噴射液化溫度為95-97°C，第二次噴射液化主要是高溫條件下蛋白質(zhì)的凝聚和難溶性淀粉酶顆粒的膨脹溶出，降低了液化液的粘度，有利于后續(xù)的過濾，為了促進(jìn)蛋白質(zhì)的凝聚和難溶性淀粉酶顆粒的膨脹溶出，第二次噴射液化溫度為125_130°C，在液化層流罐中維持1-6個(gè)小時(shí)，若維持時(shí)間過短則反應(yīng)不完全，若維持時(shí)間過長則造成時(shí)間的浪費(fèi)，液化DE值為10-35%，通過控制適當(dāng)?shù)囊夯瘜恿鲿r(shí)間來控制最終的液化DE值，液化DE值偏低說明液化效果差，料液發(fā)粘，不利于過濾和發(fā)酵溶氧的提高值偏高說明液化過頭，可能造成非發(fā)酵性糖類產(chǎn)生偏多，不利于菌種利用產(chǎn)酸，因此控制液化DE值為10-35%時(shí)實(shí)驗(yàn)效果最佳。
[0008]取上述占最終發(fā)酵液總體積2.5-10%的液化液，通過控制液化液加量控制種子液培養(yǎng)的有機(jī)氮源含量，體積過高菌種生產(chǎn)過于旺盛，過低菌種生長較差，投入種子罐中，加入氮源，采用蒸汽升溫至80-121°C，若溫度過高會對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)造成破壞，若溫度過低造成消毒不徹底，容易引起染菌，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)確定以上溫度范圍可以取得最佳實(shí)驗(yàn)效果，蒸汽來源容易，操作費(fèi)用低，本身無毒，穿透力強(qiáng)，滅菌徹底的特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。消毒15-30分鐘，高溫消毒條件下時(shí)間過長會造成培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，不利于菌種吸收利用，時(shí)間過短造成消毒不徹底，容易引起染菌，因此消毒15-30分鐘為最佳消毒時(shí)間。降溫至30-38°C，溫度過高會抑制甚至殺死孢子，溫度過低孢子萌發(fā)的慢。接入黑曲霉孢子懸浮液，本申請中所用菌種為黑曲霉，生產(chǎn)中即以黑曲霉孢子懸浮液作為菌種，編號為Co827，由天津工業(yè)微生物研究所購買所得，采用孢子懸浮液易于生產(chǎn)操作，防止孢子逸出，黑曲霉孢子懸浮液的接入量為本領(lǐng)域的常規(guī)用量即可。進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)26-32h，培養(yǎng)時(shí)間過長，菌種趨于老化，生產(chǎn)能力下降，菌體自溶；培養(yǎng)時(shí)間過短，種齡太短，造成發(fā)酵前期生長緩慢。每升發(fā)酵液中加入0.01-0.05g氮源，氮源是菌種合成細(xì)胞物質(zhì)(蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、維生素等)和調(diào)節(jié)代謝的營養(yǎng)基礎(chǔ)物質(zhì)，氮源含量過低菌種生長緩慢，不利于菌種快速進(jìn)入產(chǎn)酸階段；氮源含量過高菌種生長容易過于旺盛，以生長為主而不利于菌種進(jìn)入產(chǎn)酸階段和積累檸檬酸，產(chǎn)酸率不高，選擇以上氮源加入量可以取得最佳實(shí)驗(yàn)效果；本過程中，由于液化液可以直接作為有機(jī)氮源使用，所以只需要加入無機(jī)氮源即可，無機(jī)氮源選自硫酸銨、磷酸氫銨、尿素、硝酸銨、檸檬酸銨中的一種或其混合物。
[0009]取上述占最終發(fā)酵液總體積10-25%的液化液投入發(fā)酵罐，通過添加適當(dāng)?shù)囊夯簛砜刂瓢l(fā)酵液中有機(jī)氮的含量，體積過高菌種生長過于旺盛，產(chǎn)酸偏低，轉(zhuǎn)化率差；體積過低菌種生長緩慢，造成發(fā)酵周期偏長；
將上述剩余的液化液過濾得過濾清液；
取上述占最終發(fā)酵總體積65-80%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，通過添加適當(dāng)?shù)囊夯^濾液來控制發(fā)酵液中有機(jī)氮的含量，體積過高氮源含量偏低，菌種生長過于緩慢，造成發(fā)酵周期偏長；體積過高菌種生長過于旺盛，造成發(fā)酵產(chǎn)酸偏低，轉(zhuǎn)化率低，80-121 °C消毒，若溫度過高會對培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)造成破壞，若溫度過低造成消毒不徹底，容易引起染菌，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)確定以上溫度范圍可以取得最佳實(shí)驗(yàn)效果。消毒15-30分鐘，高溫消毒條件下時(shí)間過長會造成培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)被破壞，不利于菌種吸收利用，時(shí)間過短造成消毒不徹底，容易引起染菌，因此消毒15-30分鐘為最佳消毒時(shí)間之后降溫至35-38°C，溫度過高會抑制甚至殺死孢子，溫度過低孢子萌發(fā)的慢。 [0010]將上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，向發(fā)酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶的添加量為每克干基5-30個(gè)酶單位，35-38°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵終了。
[0011]發(fā)酵過程中，本發(fā)明采用流加蛋白酶的方式來進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，主要是因?yàn)樵诓煌陌l(fā)酵階段料液的PH不同，需要考慮流加不同的蛋白酶，本發(fā)明中采用流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶中的一種或兩種，流加速度為4-10kg/h，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，黑曲霉自身通過代謝產(chǎn)生部分蛋白酶，若流加速度過快，蛋白酶濃度急速增加會抑制菌種代謝生長；若流加速度過慢又達(dá)不到水解發(fā)酵液中蛋白質(zhì)的作用，影響菌種生長及快速代謝利用氨基酸、小分子肽類物質(zhì)等，因此將流加速度控制在4-10kg/h可以取得最佳試驗(yàn)效果。流加時(shí)間為l_8h，這主要是因?yàn)榈鞍酌缸饔玫淖罴裵H范圍在2.5-8.0之間，隨發(fā)酵進(jìn)行料液pH逐漸降低，在8h時(shí)料液pH已經(jīng)降到2.5以下，已經(jīng)超出蛋白酶作用的最佳范圍，因此將流加時(shí)間控制在l_8h。當(dāng)流加兩種蛋白酶時(shí)選擇先流加中性蛋白酶再流加酸性蛋白酶，這主要是因?yàn)榱骷映跗赑H值較高，這個(gè)階段中性蛋白酶的活性高，隨發(fā)酵的進(jìn)行pH值降低，酸性蛋白酶的活性高，選擇以上順序可以保證兩種蛋白酶發(fā)揮最佳的活性。通過流加蛋白酶能加快發(fā)酵液中蛋白質(zhì)物質(zhì)的水解，提高發(fā)酵液中氨基酸、小分子肽類物質(zhì)的含量，有利于菌種快速的吸收利用，加快菌種的生長與產(chǎn)酸。若蛋白酶的添加量過低蛋白質(zhì)的水解效果較差，起不到明顯的促進(jìn)菌種生長的作用，而添加量過大會造成成本的上升，所以本發(fā)明中蛋白酶的添加量為每克干基5-30個(gè)酶單位。本發(fā)明中的中性蛋白酶為蘇柯漢(濰坊)生物有限公司提供的SUKAPro NE中性蛋白酶，酶活力為50000U/mL，適用pH范圍為6.0-8.0，溫度為10-60°C ;酸性蛋白酶為山東隆大生物工程有限公司提供的真菌酸性蛋白酶，酶活力為50000U/mL或100000U/mL，適用pH范圍為2.5-6.0，溫度為30_50°C，上述中性蛋白酶和真菌酸性蛋白酶均為市售商品。
[0012]由于溫度過低，菌種生長代謝速度緩慢，導(dǎo)致發(fā)酵周期過長；溫度過高會對菌種生長、代謝產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致產(chǎn)生其他的雜酸、代謝物質(zhì)，給后續(xù)的提取增加負(fù)擔(dān)，所以發(fā)酵溫度控制在35-38°C。當(dāng)發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)為0-0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)為0-1.0%時(shí)即為發(fā)酵終了可終止發(fā)酵。最終的發(fā)酵液可以采用常用的鈣鹽法提取其中的檸檬酸。
[0013]本發(fā)明所述的最終發(fā)酵總體積是根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過程中發(fā)酵罐的體積確定的。
[0014]發(fā)酵過程中正常產(chǎn)酸量采用酸堿滴定法，以氫氧化鈉作為標(biāo)準(zhǔn)液，酚酞作為指示劑進(jìn)行測定。具體步驟如下:
1、試劑和溶液
1.1氫氧化鈉:C (NaOH)=0.1429mol/L因氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定液需標(biāo)定，濃度以標(biāo)定濃度c為準(zhǔn)，系數(shù)=c/0.1429
1.2酚酞:10g/L乙醇溶液
2、檢測方法
吸取ImL待測料液于三角瓶中，加水50mL，加2滴酚酞指示劑，用c (NaOH ) =0.1moL/L氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色，半分鐘內(nèi)不褪色為終點(diǎn)。
[0015]3、結(jié)果計(jì)算:
以質(zhì)量比分?jǐn)?shù)表示檸檬酸的含量按下式計(jì)算:
X% =VX c/0.1429
式中，V為滴定消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，讀取結(jié)果應(yīng)保留2位小數(shù)。
[0016]兩次平行測定酸度之差不大于0.1%，取其算術(shù)平均值為測定結(jié)果。
[0017]4、取樣及樣品預(yù)處理:
發(fā)酵過程產(chǎn)酸，每隔4小時(shí)在發(fā)酵罐取樣口取樣，先將取樣杯用醪液沖洗兩次，然后取醪液約300mL，取樣杯里放250目濾網(wǎng)濾掉菌絲體，吸取清液檢測。臨近放罐時(shí)加大取樣頻次。
[0018]還原糖的量采用以下具體步驟進(jìn)行測定:
1、試劑:
1.1費(fèi)林甲液:30gCuS04加蒸餾水1000mL溶液。
[0019]1.2費(fèi)林乙液:100g酒石酸鉀鈉，加108gNa0H、8g黃血鹽加蒸餾水配制成1000mL溶液。
[0020]1.3標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液:精確稱取Ig無水葡萄糖，加5mL濃鹽酸配制成1000mL溶液。
[0021]1.4次甲基藍(lán):4g/L乙醇溶液
2、檢測方法:
于250mL三角瓶中，加費(fèi)林甲、乙液各5mL，吸取發(fā)酵液0.1mL放入，加次甲基藍(lán)指示劑I滴，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖滴定至藍(lán)色消失為終點(diǎn)。同時(shí)作空白試驗(yàn)。
[0022]3、結(jié)果計(jì)算:
以質(zhì)量百分?jǐn)?shù)表示的總糖含量(X1)按下式計(jì)算:
X1 =V 0 -V I
式中:
V!為滴定試樣時(shí)用去葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL ；
V^為空白實(shí)驗(yàn)時(shí)用去葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積/mL ；
4、取樣及樣品預(yù)處理:
發(fā)酵過程還原糖檢測，每隔8小時(shí)在發(fā)酵罐取樣口取樣，取樣杯里放250目濾網(wǎng)濾掉菌絲體，吸取清液檢測。
[0023]另外，本發(fā)明中液化液過濾后的玉米糖渣可以用于生產(chǎn)高蛋白飼料，而發(fā)酵液過濾后的菌絲體可以用來提取殼聚糖或檸檬酸糟飼料。[0024]綜上所述，本發(fā)明將采用目前普遍采用的連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，同時(shí)通過流加中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的一種或兩種，并調(diào)整相應(yīng)的生產(chǎn)參數(shù)與之適應(yīng)，加快菌種吸收利用氮源的速度，促進(jìn)菌種的生長和產(chǎn)酸，提高了整體發(fā)酵強(qiáng)度，縮短了發(fā)酵周期，達(dá)到了節(jié)能降耗的效果，為檸檬酸行業(yè)的發(fā)展指明方向；同時(shí)，玉米糖渣具有較高的附加值，可以用于生產(chǎn)高蛋白飼料，而發(fā)酵液過濾后的菌絲體可以用來提取殼聚糖或生產(chǎn)檸檬酸糟飼料，同樣具有可觀的經(jīng)濟(jì)效益，具有良好的市場前景，既減少了對環(huán)境的污染，變廢為寶，又能創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益，綜合提高了企業(yè)的競爭力和經(jīng)濟(jì)效益。本發(fā)明中添加的蛋白酶是黑曲霉自身生長過程中產(chǎn)生的一種酶類代謝物，本發(fā)明中通過流加蛋白酶是在不補(bǔ)充碳源、氮源前提下通過外加酶來促進(jìn)菌種的生長代謝和產(chǎn)酸，從而達(dá)到高產(chǎn)酸、高轉(zhuǎn)化率、低糧耗的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0025]實(shí)施例1
一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為75%；
(2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%，pH值為6.22，并向其中加入耐高溫a-淀粉酶，每克玉米粉加入5個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為95°C，第二次噴射溫度為125°C，在液化層流罐中維持1.5個(gè)小時(shí)，液化DE值為 22.2% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積2.5%的液化液，投入種子罐中，加入硫酸銨，每升發(fā)酵液中加入0.05g硫酸銨，在121°C消毒30分鐘后，降溫至32°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)26h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積20%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積70%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，100°C消毒30分鐘后，降溫至37 C ；
(8)向步驟(7)中的培養(yǎng)基中流加中性蛋白酶至發(fā)酵罐中，流加速度為5kg/h，流加6h，35°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%,即為發(fā)酵終了，中性蛋白酶的添加量為每克干基5個(gè)酶單位。
[0026]發(fā)酵液送至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來生產(chǎn)檸檬酸糟飼料。
[0027]實(shí)施例2 一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為80%；
(2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%,pH值為5.0，并向其中加入耐高溫a -淀粉酶，每克玉米粉加入10個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為96°C，第二次噴射溫度為128°C，在液化層流罐中維持I個(gè)小時(shí)，液化DE值為10% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積7.5%的液化液，投入種子罐中，加入硫酸銨和硝酸銨，每升發(fā)酵液中加入0.04g硫酸銨和0.06g硝酸銨，在100°C消毒20分鐘后，降溫至300C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)32h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積15%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6 )將步驟(3 )中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積75%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，80°C消毒20分鐘后，降溫至36 C ；
(8 )向步驟(7 )中的培養(yǎng)基中流加酸性蛋白酶至發(fā)酵罐中，流加酸性蛋白酶8h，流加速度為5kg/h，36°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%，即為發(fā)酵終了，酸性蛋白酶的添加量為每克干基20個(gè)酶單位。
[0028]發(fā)酵液送 至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來提取殼聚糖。
[0029]實(shí)施例3
一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為67.5% ；
(2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，pH值為5.92，并向其中加入耐高溫a -淀粉酶，每克玉米粉加入15個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為95°C，第二次噴射溫度為130°C，在液化層流罐中維持3.5個(gè)小時(shí)，液化DE值為 35% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積10%的液化液，投入種子罐中，加入檸檬酸銨和磷酸氫銨，每升發(fā)酵液中加入0.25g檸檬酸銨和0.05g磷酸氫銨，在121°C消毒15分鐘后，降溫至38°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)27h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積20%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積70%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，90°C消毒30分鐘后，降溫至37 C ；
(8 )向步驟(7 )中的培養(yǎng)基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至發(fā)酵罐中，先流加中性蛋白酶2h,流加速度為5kg/h,再流加酸性蛋白酶6h,流加速度為5kg/h, 37°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%,還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%，即為發(fā)酵終了，中性蛋白酶的添加量為每克干基5個(gè)酶單位，酸性蛋白酶的添加量為每克干基15個(gè)酶單位。
[0030]發(fā)酵液送至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來生產(chǎn)檸檬酸糟飼料。
[0031]實(shí)施例4 一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為60%；
(2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%，pH值為7.8，并向其中加入耐高溫a -淀粉酶，每克玉米粉加入30個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為97°C，第二次噴射溫度為125°C，在液化層流罐中維持6個(gè)小時(shí)，液化DE值為10% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積7.5%的液化液，投入種子罐中，加入尿素、檸檬酸銨和磷酸氫銨，每升發(fā)酵液中加入0.1g尿素、0.1g檸檬酸銨和0.05g磷酸氫銨，在90°C消毒25分鐘后，降溫至32°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)28h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積25%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積65%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，121°C消毒25分鐘后，降溫至37 C ；
(8)向步驟(7)中的培養(yǎng)基中流加酸性蛋白酶至發(fā)酵罐中，流加酸性蛋白酶12h，流加速度為5kg/h，38°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%，即為發(fā)酵終了，酸性蛋白酶的添加量為每克干基30個(gè)酶單位。
[0032]發(fā)酵液送至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來提取殼聚糖。
[0033]實(shí)施例5
一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為68%；
(2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，pH值為6.17，并向其中加入耐高溫a -淀粉酶，每克玉米粉加入20個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為95°C，第二次噴射溫度為128°C，在液化層流罐中維持2個(gè)小時(shí)，液化DE值為21.2% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積5%的液化液，投入種子罐中，加入檸檬酸銨和磷酸氫銨，每升發(fā)酵液中加入0.35g檸檬酸銨和0.15g磷酸氫銨，在IirC消毒30分鐘后，降溫至37°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)30h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積15%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積75%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，111°C消毒30分鐘后，降溫至37 C ；(8 )向步驟(7 )中的培養(yǎng)基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至發(fā)酵罐中，先流加中性蛋白酶Ih,流加速度為10kg/h,再流加酸性蛋白酶5h,流加速度為4kg/h, 37°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%，即為發(fā)酵終了，中性蛋白酶的添加量為每克干基5個(gè)酶單位，酸性蛋白酶的添加量為每克干基10個(gè)酶單位。
[0034]發(fā)酵液送至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來生產(chǎn)檸檬酸糟飼料。
[0035]實(shí)施例6
一種檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，其步驟為:
(1)將玉米粉碎制備玉米粉，粉碎后玉米粉60目的透過率為71%； (2)將玉米粉加水調(diào)漿至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為27%，pH值為6.05，并向其中加入耐高溫a -淀粉酶，每克玉米粉加入15個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿；
(3)將上述玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，第一次噴射溫度為95°C，第二次噴射溫度為127°C，在液化層流罐中維持3個(gè)小時(shí)，液化DE值為25% ；
(4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積5%的液化液，投入種子罐中，加入硫酸銨、檸檬酸銨和磷酸氫銨，每升發(fā)酵液中加入0.1g硫酸銨、0.25g檸檬酸銨和0.1Og磷酸氫銨，在121°C消毒30分鐘后，降溫至38°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)29h ；
(5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積15%的液化液投入發(fā)酵罐；
(6)將步驟(3)中剩余的液化液采用板框過濾機(jī)過濾得過濾清液，過濾得玉米糖渣用于生廣聞蛋白飼料；
(7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積80%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，90°C消毒30分鐘后，降溫至37 C ；
(8 )向步驟(7 )中的培養(yǎng)基中流加中性蛋白酶和酸性蛋白酶至發(fā)酵罐中，先流加中性蛋白酶2h，流加速度為7.5kg/h，再流加酸性蛋白酶5h，流加速度為6kg/h，37°C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵罐正常產(chǎn)酸每小時(shí)的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W檸檬酸/V發(fā)酵液)低于0.1%，還原糖的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)(W還原糖/V發(fā)酵液)低于1.0%，即為發(fā)酵終了，中性蛋白酶的添加量為每克干基10個(gè)酶單位，酸性蛋白酶的添加量為每克干基15個(gè)酶單位。
[0036]發(fā)酵液送至提取車間采用鈣鹽法提取發(fā)酵液中的檸檬酸，發(fā)酵液過濾后的菌絲體用來提取殼聚糖。
[0037]將實(shí)施例1-6的各項(xiàng)指標(biāo)與現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的各項(xiàng)指標(biāo)明顯優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)，結(jié)果如表1:1發(fā)酵周期(h)I產(chǎn)酸(％)I轉(zhuǎn)化率(％)I發(fā)酵指數(shù)(g/L.h)
現(xiàn)有技術(shù) 60.7_ 16.6795.28_2.74_
實(shí)施例1 — 5418707ToT.523.35
實(shí)施例 2_ 5618~57102.033.32
實(shí)施例 3 ^ 5920 45ToT.243.47
實(shí)施例 4 — 6220~7198?623.34
實(shí)施例 5^5217797102.673.46
實(shí)施例 6 丨54|l8.93|l02.32丨3.51
綜上所述，本發(fā)明檸檬酸發(fā)酵過程流加蛋白酶的方法，采用目前普遍采用的連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，同時(shí)通過流加中性蛋白酶或酸性蛋白酶中的一種或兩種，并調(diào)整相應(yīng)的生產(chǎn)參數(shù)與之適應(yīng)，加快菌種吸收利用氮源的速度，促進(jìn)菌種的生長和產(chǎn)酸，提高了整體發(fā)酵強(qiáng)度，縮短了發(fā)酵周期，提高了產(chǎn)酸 量和轉(zhuǎn)化率，達(dá)到了節(jié)能降耗的效果；同時(shí)，玉米糖渣具有較高的附加值，可以用于生產(chǎn)高蛋白飼料，而發(fā)酵液過濾后的菌絲體可以用來提取殼聚糖或生產(chǎn)檸檬酸糟飼料，既減少了對環(huán)境的污染，變廢為寶，又能創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益，綜合提高了企業(yè)的競爭力和經(jīng)濟(jì)效益。
【權(quán)利要求】
1.一種檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:其步驟為: (1)將玉米粉碎制備玉米粉； (2)將步驟(1)所得的玉米粉加水調(diào)漿，并向其中加入耐高溫a-淀粉酶，每克玉米粉加入5-30個(gè)酶單位的耐高溫a -淀粉酶，得玉米粉漿； (3)將步驟(2)所得的玉米粉漿輸送至噴射液化裝置經(jīng)過兩次連續(xù)噴射液化工藝進(jìn)行液化，得液化液； (4)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積2.5-10%的液化液，投入種子罐中，加入氮源，每升發(fā)酵液中加入0.05-0.5g氮源，在80-121°C消毒15-30分鐘后，降溫至30_38°C，接入黑曲霉孢子懸浮液進(jìn)行培養(yǎng)基培養(yǎng)26-32h ； (5)取步驟(3)中占最終發(fā)酵液總體積10-25%的液化液投入發(fā)酵罐； (6)將步驟(3)中剩余的液化液過濾得過濾清液； (7)取步驟(6)中占最終發(fā)酵總體積65-80%的過濾清液投入發(fā)酵罐中，80-121°C消毒15-30分鐘后，降溫至35-38 °C ； (8)將步驟(4)中培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，向發(fā)酵罐中流加蛋白酶，蛋白酶添加量為每克干基5-30個(gè)酶單位，干基為發(fā)酵液中的純干物質(zhì)，35-38 °C通風(fēng)攪拌至發(fā)酵終了。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(1)所述的粉碎后的玉米粉過60目篩透過率為60%以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(2)所述的玉米粉調(diào)漿后玉米粉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10-35%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(2)所述的玉米粉調(diào)漿后 pH 為 5.0-7.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(3)所述的第一次噴射溫度為95-97°C，第二次噴射溫度為125-130°C，在液化層流罐中維持1_6個(gè)小時(shí)，液化DE 值為 10-35%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(4)所述的氮源為無機(jī)氮源，選自硫酸銨、磷酸氫銨、尿素、硝酸銨、檸檬酸銨中的一種或其混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檸檬酸生產(chǎn)發(fā)酵工藝，其特征在于:步驟(8)所述的蛋白酶為中性蛋白酶、酸性蛋白酶中的一種或兩種，流加速度為4-10kg/h，流加時(shí)間為l-8h。
【文檔編號】C12R1/685GK103642855SQ201310608179
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月27日
【發(fā)明者】寇光智, 李昌濤, 蔣水星, 秦緒斌, 周昊, 梁培森 申請人:日照金禾博源生化有限公司