一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌pseudozymaaphidisCNm2012，保藏號為CCTCCNO：M2013563。該菌株分離自桑樹葉面，是一種類酵母真菌，在土豆平板培養(yǎng)基上該菌的菌落顏色呈粉紅色，中間部分平滑類似于酵母的菌落，但邊緣長有菌絲；在薩氏液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，其菌體梭狀，大小不一，胞內(nèi)含有許多油滴狀物質(zhì)，隨著生長長出菌絲；菌株的生長適溫為20-30℃，pH6.5-7.5；菌株的18SrDNA序列1416bp，NCBI序列號為KF443200，28SrDNA序列627bp，序列號為KF443201，ITSrDNA序列784bp，序列號為KF443199。該菌可通過捕食桑白粉菌分生孢子對桑白粉病進(jìn)行生物防治，并且對桑樹以及家蠶沒有致病性。
【專利說明】—株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病害生物防治領(lǐng)域，具體涉及一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012。
【背景技術(shù)】
[0002]桑樹是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，除了其葉可以用作飼養(yǎng)家蠶外，其果實(shí)可食用，以及用于提取花青素，其根、莖也可入藥。桑白粉病是由子囊菌亞門核菌綱白粉菌目白粉菌科球針殼屬真菌引起的一種桑樹病害，受害桑葉因營養(yǎng)價值差，品質(zhì)低劣，因而食用它的蠶體質(zhì)變?nèi)酰菀渍T發(fā)蠶病，導(dǎo)致蠶的繭量和繭層量少。桑白粉病的爆發(fā)對整個蠶桑行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此如何防治桑白粉病成了蠶桑產(chǎn)業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。長期以來為了防治桑白粉病，大量使用化學(xué)藥劑，不僅導(dǎo)致藥物殘留，還導(dǎo)致了耐藥病原菌株的產(chǎn)生。因此尋找新的防治白粉病的方法具有十分重要的意義。生物防治方法是近年來研究的熱點(diǎn)，生物防治主要是利用拮抗，競爭，或捕食(寄生或腐生)作用防治病原菌，但目前利用微生物制劑來防治桑樹病害國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]為了減少化學(xué)農(nóng)藥的使用對環(huán)境的污染及生物安全的影響，本發(fā)明提供一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,通過捕食桑白粉菌分生孢子的作用形式來防治桑樹白粉病。
[0004]本發(fā)明所述的菌株從桑樹葉片表面分離，該菌株已于2013年11月10日保藏在湖北省武漢市武漢大學(xué)(郵編:430072，電話:027-68754052)中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，菌株保藏號為 CCTCC NO:M 2013563。
[0005]菌株接種于土豆固體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)4天，培養(yǎng)基上出現(xiàn)中間平滑似酵母，邊緣長出菌絲的粉紅色菌落，顯微觀察，菌體梭狀，大小不一，菌體中央有油滴狀物質(zhì)，隨著生長長出長短不一的菌絲。菌株18SrDNA序列1416bp,序列號為KF443200 ;28SrDNA序列627bp，序列號為KF443201 ;ITSrDNA序列784bp，序列號為KF443199。根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，菌株被鑒定為pseudozyma aphidis ,菌株號CNm2012。
[0006]本發(fā)明所述的P1SewiZozjffla aphidis CNm2012的分離、純化和保種方法是,將發(fā)現(xiàn)對桑白粉菌分生孢子有捕食作用的菌株涂布到含有青鏈霉素的土豆培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)物在純化培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，培養(yǎng)條件:20-30°C，PH 6.5-7.5，然后純化菌株轉(zhuǎn)接到斜面進(jìn)行保種。
[0007]本發(fā)明以捕食作用的方式來防治桑白粉病,試驗(yàn)表明菌株/zsewi/oiywa aphidisCNm2012對桑樹及家蠶沒有致病性。
[0008]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖 1、pseudozyim aphidis CNm2012 菌體的形態(tài)特征
28°C,在180r/min的轉(zhuǎn)速下于薩氏液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)7天飽pseudozyma aphidisCNm2012菌體的顯微結(jié)構(gòu)圖，刻度標(biāo)尺為20 μ m。
[0009]圖l、psoudozym3 aphidis CNm2012菌株基于ITS rDNA的系統(tǒng)進(jìn)化分析樹 'Upseudozyma屬的14個種的ITS rDNA序列進(jìn)行比對,依據(jù)臨近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)
化樹，括弧內(nèi)為菌株ITS rDNA序列的序列號。
[0010]摩[IPseudozyma aphidis CNm2012菌株對桑白粉菌分生孢子的捕食作用
利用倒置顯微鏡對CNm2012菌株與桑白粉菌孢子混合液進(jìn)行每小時跟蹤拍攝所得的顯微圖，刻度標(biāo)尺為20 μ m。
[0011]圖4、以桑白粉菌為營養(yǎng)的aphidis CNm2012菌株的生長曲線圖
用CNm2012菌株與不同濃度的桑白粉菌分生孢子共同培養(yǎng)，每隔12小時取樣檢驗(yàn)其0D600的吸光值(每組皆以各自濃度的桑白粉菌分生孢子懸液作為空白對照)。
[0012]圖5、田間試驗(yàn)防治效果顯微鏡觀察 在桑葉感染桑白粉菌早期以CNm2012菌株處理過的桑葉和對照桑葉在一周之后的表面顯微形態(tài)，A是CNm2012菌株處理過的桑葉表面，B是對照桑葉表面，刻度標(biāo)尺為100 μ m。
[0013]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明菌株/zsewi/ozjffla o^CNm2012的田間使用與化學(xué)農(nóng)藥相比不污染環(huán)境或產(chǎn)生藥害，也不會導(dǎo)致耐藥病原菌株的產(chǎn)生；菌株對生長條件的要求不苛刻，生長迅速，容易制備和生產(chǎn)菌劑；菌株可以顯著抑制桑白粉菌病斑個數(shù)的增加，顯著減少分生孢子的產(chǎn)生、擴(kuò)散與感染傳播，釋放到環(huán)境可發(fā)揮持續(xù)的防治作用。
【具體實(shí)施方式】
[0014]實(shí)施例1 pseudozyma aphidis CNm2012 的分離和鑒定
1.菌株的分離與純化
(I)分離。培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，青鏈霉素3g，單蒸水1L。將在觀察白粉菌分生孢子發(fā)芽過程中，發(fā)現(xiàn)的對其有捕食作用的菌株涂布到培養(yǎng)基上28°C恒溫培養(yǎng)。
[0015](2)純化。薩氏培養(yǎng)基:葡萄糖40g,酵母膏IOg,蛋白胨IOg,瓊脂粉36g,單蒸水1000ml, PH 6.5-7.5。挑取培養(yǎng)物在該培養(yǎng)基上劃線接種菌株，28°C恒溫培養(yǎng)。
[0016](3)保種。土豆培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂18g，單蒸水1L。將純化的菌株在該培養(yǎng)基上斜面保存。
[0017]2.菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征 (I)形態(tài)學(xué)特征
Pseudozyma aphidis CNm2012的菌落常常是二態(tài)的:中間部分呈粉紅色的漿糊狀或者奶油狀，而邊緣則有呈放射狀生長的菌絲。它的生長初期像酵母:兩端芽殖，常常合軸繁殖。菌絲透明有隔，在隔附近梗狀旁枝的出現(xiàn)使得芽分生孢子由紡錘形和橢圓形變成圓柱狀，常常會出現(xiàn)短的氣生菌絲鏈，有的氣生菌絲會有分支，有的則沒有，氣生菌絲鏈都是由紡錘形的枝分生孢子組成。氣生菌絲的出現(xiàn)常常使得其菌落出現(xiàn)絨毛，或者看起來像披上了一層白霜。隨著菌株的老齡化，菌落看起來具有馬蹄紋形狀。
[0018](2)分子生物學(xué)特征
純化菌株接種在薩氏液體培養(yǎng)基(葡萄糖4g,酵母膏Ig,蛋白胨lg，單蒸水100ml,PH6.5-7.5) Φ, 20-30°C, 150-200r/min,振蕩培養(yǎng) 10-20 天。接下來 5000 轉(zhuǎn)離心 5 分鐘，丟棄上清液，然后再用無菌水沖洗三次，沖洗方法是重懸、離心、棄液。然后于烘箱中40°C烘10-15小時，再用液氮將其研碎，提取菌體基因組。
[0019]ITS引物對為
ITSl (5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')
ITS4 (5; -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，
26S引物對為
NL-1(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAA-3’) NL-4(5’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)，
18S引物對為
NSl (5’ - GTAGTCATATGCTTGTCTC- 3’)
NS6 (5’ — GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC 3’)
用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，獲得ITS rDNA序列784bp、18S rDNA序列1416bp，28S rDNA序列627bp。在NCBI中應(yīng)用BLAST軟件對這三個序列進(jìn)行比對，并基于ITSrDNA構(gòu)建進(jìn)化樹，依據(jù)鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示該菌株與聚為一枝(圖2)。
[0020]依據(jù)菌株的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征，菌株CNm2012被鑒定為pseudozymaaphidisο
[0021]實(shí)施例2菌株P(guān)1SewiZozjffla aphidis CNm2012對桑白粉菌分生孢子捕食作用的顯微觀察
稱取馬鈴薯100g，葡萄糖10g，瓊脂9g，單蒸水500ml，PH6.5-7.5，將配置好的培養(yǎng)基置入高壓鍋中120°C滅菌30分鐘。將菌株CNm2012在該P(yáng)DA板上進(jìn)行活化。然后用500ml的三角瓶對菌株進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵所用的培養(yǎng)基是薩氏培養(yǎng)基，其配方是:葡萄糖4g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨lg，單蒸水100ml,PH6.5-7.5。發(fā)酵條件是:溫度20_30°C，180r/min，發(fā)酵4天。將發(fā)酵好的菌液1000轉(zhuǎn)離心5分鐘去除上清液，再用無菌水沖洗三次，沖洗方法是重懸、離心、棄液。將上述步驟所得到的菌體與白粉菌分生孢子混合，重懸于無菌水中，對其進(jìn)行跟蹤觀察(圖3)。
[0022]根據(jù)對該菌株與桑白粉菌分生孢子混合在一起的跟蹤觀察發(fā)現(xiàn)，白粉菌分生孢子的出現(xiàn)吸引了菌株aphidis CNm2012,該菌株圍繞著白粉菌分生孢子生長,并且利用其進(jìn)行繁殖。
[0023]實(shí)施例3基于桑白粉菌為營養(yǎng)的aphidis CNm2012菌株的生長曲線測定
將CNm2012菌株分別與不同濃度的桑白粉菌分生孢子混合成100ml的懸液，懸液中包含有濃度為 105cfu/ml 的 CNm2012 菌株，濃度分別為 6 X IO2 cfu/ml、6X 103cfu/ml、6X IO4cfu/ml的桑白粉菌分生孢子。將混合液置于28°C，180r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔12小時取樣檢驗(yàn)其0D600的吸光值(每組皆以各自濃度的桑白粉菌分生孢子懸液作為空白對照)。試驗(yàn)設(shè)置105cfu/ml濃度的CNm2012水溶液為陰性對照。結(jié)果顯示:CNm2012菌株的吸光光度值隨著桑白粉菌分生孢子濃度的增加而增加(表1),表明aphidis CNm2012菌株確實(shí)將桑白粉菌作為了營養(yǎng)進(jìn)行了捕食(圖4)。
[0024]表1.CNm2012菌株以桑白粉菌為營養(yǎng)生長的0D600值
【權(quán)利要求】
1. 一株對桑白粉菌分生孢子具有捕食作用的真菌aphidis CNm2012,其保藏號為 CCTCC NO: M 2013563。
【文檔編號】C12N1/14GK103642699SQ201310608814
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】邱欣, 汪靜杰, 張琳, 馮麗春, 段正巧, 劉艷萍, 陳倩茜, 萬永繼 申請人:西南大學(xué)