Gm-csf和mart-1雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO:3所示。本發(fā)明所述的雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接GM-CSF基因和MART-1基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人黑色素瘤分化抗原和粒細(xì)胞－巨噬細(xì)胞集落刺激因子，該重組載體可用于黑色素瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對(duì)黑色素瘤產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
【專利說(shuō)明】GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組載體及其制備方法和應(yīng)用，特別是涉及一種雙基因共表達(dá)重組載體及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】 [0002]黑色素瘤(Melanoma),又稱惡性黑色素瘤(Malignant Melanoma,MM),是來(lái)源于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤，多發(fā)生于皮膚體表，亦可見(jiàn)于脈絡(luò)膜、軟腦膜及消化道等，其惡性程度高，是體表腫瘤中死亡率最高的惡性腫瘤。近年來(lái),黑色素瘤的發(fā)病率及相應(yīng)的死亡率在迅速增長(zhǎng)，且發(fā)病年齡愈來(lái)愈早，嚴(yán)重威脅著人類的健康。
[0003]黑色素瘤的傳統(tǒng)治療,是包括手術(shù)、化療、免疫治療等在內(nèi)的綜合治療。目前唯一有效的治療方法是在腫瘤厚度小于I毫米時(shí)通過(guò)手術(shù)切除腫瘤，但由于黑色素瘤的高度侵襲轉(zhuǎn)移性和對(duì)多種化療藥物的耐藥性，導(dǎo)致其療效不佳以及預(yù)后不良。針對(duì)腫瘤患者普遍存在免疫力低下的情況,通過(guò)免疫治療來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，以抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)。近年來(lái)，攜帶外源特異性腫瘤抗原的疫苗已成為腫瘤免疫治療的新方向，包括基因疫苗、腫瘤細(xì)胞疫苗、細(xì)菌疫苗、病毒疫苗及樹(shù)突狀細(xì)胞疫苗等。其中，基因疫苗是通過(guò)特定載體將具有治療作用的基因?qū)爰?xì)胞的治療方法；然而，基因治療只能短時(shí)間提高某種基因?qū)?yīng)蛋白表達(dá)水平，其療效持續(xù)時(shí)間短，缺乏長(zhǎng)期抗腫瘤能力。
[0004]腫瘤之所以能在體內(nèi)增殖、轉(zhuǎn)移，是因?yàn)槿鄙費(fèi)HC抗原等能激活T細(xì)胞的分子，因而不能被T細(xì)胞識(shí)別，無(wú)法激活T細(xì)胞介導(dǎo)的主動(dòng)免疫。因此，要誘導(dǎo)強(qiáng)有力的抗腫瘤免疫應(yīng)答，不僅需要腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)和呈遞，還需要增強(qiáng)共刺激分子和細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫作用。
[0005]粒細(xì)胞一巨卩遼細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage ColonyStimulating Factor, GM-CSF)是一種重要的免疫調(diào)節(jié)分子,它不僅可誘導(dǎo)在T細(xì)胞免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的DC細(xì)胞成熟、分化，而且在免疫治療過(guò)程中可增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，以促進(jìn)DC等APC分化、成熟和活化以及上調(diào)協(xié)同刺激分子(如CD86)的表達(dá)水平，增強(qiáng)中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的吞噬作用和ADCC效應(yīng)等活性，促進(jìn)Th、Tc、NK細(xì)胞在腫瘤部位浸潤(rùn)，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。GM-CSF目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤的免疫治療，GM-CSF以其顯著的免疫調(diào)節(jié)作用和低毒性，成為腫瘤疫苗重要的免疫佐劑，GM-CSF還可作為化療的輔助用藥，提升腫瘤患者外周血白細(xì)胞水平(主要為粒細(xì)胞與單核細(xì)胞數(shù)量)的同時(shí)，誘導(dǎo)機(jī)體的免疫系統(tǒng)活化，加強(qiáng)對(duì)腫瘤的免疫；除上述生物學(xué)效應(yīng)外，GM-CSF還能增加腫瘤基質(zhì)分泌血管生成抑制素，抑制腫瘤的血管生成和轉(zhuǎn)移；轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的腫瘤疫苗在黑色素瘤的免疫治療研究中取得了顯著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治療方法只是局部地提高機(jī)體的GM-CSF蛋白表達(dá)水平，其免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤能力較小，而且缺乏免疫治療的靶向性。
[0006]MART-1 (人黑色素瘤分化抗原)是黑素瘤分化的相關(guān)抗原，其參與黑素小體成熟，表達(dá)于黑素瘤和黑素瘤細(xì)胞系，在多數(shù)類固醇腫瘤(包括腎上腺皮質(zhì)腫瘤)、黑色素細(xì)胞病變以及血管周細(xì)胞瘤中表達(dá)。MART-1有較強(qiáng)的免疫原性，易于被細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)識(shí)別，產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答，被認(rèn)為是黑素瘤免疫治療的最佳候選者。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]基于此，有必要針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，該重組載體可用于黑色素瘤的基因免疫治療，既能發(fā)揮細(xì)胞因子的免疫調(diào)節(jié)作用，又能靶向性地針對(duì)黑色素瘤產(chǎn)生特異性抗腫瘤效應(yīng)。
[0008]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供所述GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法。
[0009]本發(fā)明的再一個(gè)目的是，提供所述GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體在黑色素瘤免疫治療中的應(yīng)用。
[0010]GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF基因；所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3 所示。
[0011]在其中一 個(gè)實(shí)施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為PIRES2-GM-CSF-MART-1重組載體；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
[0012]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為PIRES2-MART-1-GM-CSF重組載體；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
[0013]本發(fā)明所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0014]I)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段；
[0015]2)將步驟I)得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段連接于載體，構(gòu)建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重組載體；
[0016]3)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段；
[0017]4)將步驟3)得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體。
[0018]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的pIRES2-GM-CSF-MART-l重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0019]A)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)序列的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有EcoRI和BamH I酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示；
[0020]B)構(gòu)建pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶EcoR 1、BamH I分別酶切pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟A)得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體；[0021]C)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:從黑色素瘤細(xì)胞A375獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到MART-1基因片段混合物，其中的一種MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0022]D)構(gòu)建pIRES2-GM-CSF-MART-l重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1、Not I酶切步驟B)得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體，將步驟C)得到的MART-1基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到 pIRES2-GM-CSF-MART-l 重組載體。
[0023]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟A)所述的GM-CSF特異性引物為:
[0024]GM-CSF 上游引物:5 ’ -CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3，，
[0025]GM-CSF 下游引物:5 ’ -TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3，。
[0026]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟C)所述的MART-1特異性引物包括MART-1第一引物對(duì)和MART-1第二引物對(duì)，所述的MART-1第一引物對(duì)由MART-1上游長(zhǎng)引物和MART-1下游長(zhǎng)引物組成，所述的MART-1第二引物對(duì)由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物組成:
[0027]MART-1第一引物對(duì)為:
[0028]MART-1 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’，
[0029]MART-1 下游長(zhǎng)引物:5’-GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ；
[0030]MART-1第二引物對(duì)為:
[0031]MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’，
[0032]MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
[0033]在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述的pIRES2-MART-l-GM-CSF重組載體的制備方法，包括以下步驟:
[0034]a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MART-1基因片段:從黑色素瘤細(xì)胞A375獲取cDNA作為模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MART-1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0035]b)構(gòu)建pIRES2-MART-l-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Xho 1、EcoR II分別酶切pIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MART-1-EGFP重組載體；
[0036]c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端；
[0037]d)構(gòu)建pIRES2-MART-l-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX 1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體，將步驟c)得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得至Ij pIRES2-MART-l-GM-CSF 重組載體。
[0038]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟a)所述的MART-1特異性引物為:
[0039]MART-1 上游引物:5，-AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3，，[0040]MART-1 下游引物:5 ’ -CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3 ’。
[0041]在其中一個(gè)實(shí)施例中，步驟c)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)引物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成:
[0042]GM-CSF第一引物對(duì)為:
[0043]GM-CSF 上游長(zhǎng)弓丨物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0044]GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’-GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ；
[0045]GM-CSF第二引物對(duì)為:
[0046]GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，
[0047]GM-CSF 下游短引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
[0048]本發(fā)明所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體在黑色素瘤基因免疫治療中的應(yīng)用。
[0049]在其中一個(gè)實(shí)施例中，將所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染黑色素瘤患者自身或異體分離的樹(shù)突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，進(jìn)行黑色素瘤基因免疫治療。
[0050]本發(fā)明所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，采用IRES序列來(lái)連接GM-CSF基因和MART-1基因，能夠在同一載體中同時(shí)表達(dá)人黑色素瘤分化抗原(MART-1)以及粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，可減少基因載體的用量，減少非治療相關(guān)的外源基因序列的引入。其中，MART-1是腫瘤靶向性的相關(guān)抗原，GM-CSF是發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，兩者聯(lián)合使用，既可以發(fā)揮細(xì)胞因子的的免疫調(diào)節(jié)作用，又可以靶向性地產(chǎn)生特異性的抗腫瘤效應(yīng)，從而能夠獲得更好的黑色素瘤免疫治療效果。將雙基因共表達(dá)重組載體轉(zhuǎn)染黑色素瘤患者自身或異體分離的樹(shù)突狀細(xì)胞后植入患者體內(nèi)，MART-1的大量表達(dá)，可刺激樹(shù)突狀細(xì)胞遞呈MART-1多肽與MHC復(fù)合物，而刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生特異性殺傷性T細(xì)胞，靶向性地殺傷表達(dá)MART-1多肽的腫瘤細(xì)胞；而GM-CSF的大量表達(dá)，能進(jìn)一步增強(qiáng)主要和次要的抗體反應(yīng)，還能誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟、分化，促進(jìn)T細(xì)胞免疫反應(yīng)，一方面增強(qiáng)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，另一方面作為免疫佐劑，協(xié)同擴(kuò)大抗腫瘤免疫效應(yīng)。
[0051]IRES序列是來(lái)源于某些病毒和細(xì)胞mRNA5’端的一段非翻譯區(qū)，可以不依賴帽的方式啟動(dòng)遠(yuǎn)端的mRNA翻譯，可在上游啟動(dòng)子的控制下和與之相連的基因共同轉(zhuǎn)錄，在同一轉(zhuǎn)錄本上翻譯出不同的 蛋白。IRES連接多基因進(jìn)行共表達(dá)時(shí)，多個(gè)基因的mRNA在同一條轉(zhuǎn)錄子上，但轉(zhuǎn)錄后的翻譯過(guò)程相互獨(dú)立，上游基因以傳統(tǒng)方式進(jìn)行翻譯，下游基因依靠IRES序列以不依賴帽的方式進(jìn)行翻譯，保證了各個(gè)基因的獨(dú)立結(jié)構(gòu)及功能。利用IRES代替內(nèi)部啟動(dòng)子，不但可使多基因共表達(dá)載體大大縮小，而且還克服了傳統(tǒng)多基因表達(dá)載體中啟動(dòng)子之間的相互抑制現(xiàn)象，避免融合蛋白的產(chǎn)生。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0052]圖1為實(shí)施例一所得的含有特異性酶切位點(diǎn)序列的GM-CSF基因片段的電泳圖，其中，I為GM-CSF基因，M為標(biāo)記；
[0053]圖2 為 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒圖譜；
[0054]圖3為實(shí)施例二所得的PIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體圖譜；
[0055]圖4為實(shí)施例二所得的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0056]圖5為實(shí)施例二所得的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0057]圖6為實(shí)施例三所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的MART-1基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物B，M為標(biāo)記；
[0058]圖7為實(shí)施例三所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0059]圖8為實(shí)施例四所得的pIRES2-GM-CSF-MART-l重組載體圖譜；
[0060]圖9為實(shí)施例四所得的pIRES2-GM-CSF-MART-l重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為EcoR I/BamH I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為BamH I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0061]圖10為實(shí)施例五所得的含有特異性酶切位點(diǎn)序列的MART-1基因片段的電泳圖，其中，I為MART-1基因，M為標(biāo)記；
[0062]圖11為實(shí)施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體圖譜；
[0063]圖12為實(shí)施例六所得的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體的PCR鑒定電泳圖，其中，I為PCR反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記；
[0064]圖13為實(shí)施例六所得的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記 ；
[0065]圖14為實(shí)施例七所得的帶有限制性內(nèi)切酶粘性末端的GM-CSF基因片段的電泳圖，其中，I為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物C，2為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物D，M為標(biāo)記；
[0066]圖15為實(shí)施例七所述的雜交PCR反應(yīng)的流程圖；
[0067]圖16為實(shí)施例八所得的PIRES2-MART-1-GM-CSF重組載體圖譜；
[0068]圖17為實(shí)施例八所得的PIRES2-MART-1-GM-CSF重組載體的酶切鑒定電泳圖，其中，I為Xho I/EcoR I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，2為EcoR I/Not I雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，3為Xho I/NotI雙酶切反應(yīng)產(chǎn)物，M為標(biāo)記。
【具體實(shí)施方式】
[0069]下述實(shí)施例中，所用到的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，例如PCR技術(shù)、引物設(shè)計(jì)技術(shù)、載體構(gòu)建技術(shù)、檢測(cè)技術(shù)、電泳技術(shù)等均為基因工程中的常規(guī)技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)實(shí)現(xiàn)(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，科學(xué)出版社第三版；或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)。在操作過(guò)程中所用到的設(shè)備、試劑、載體、菌株等，均為通過(guò)市場(chǎng)購(gòu)買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
[0070]實(shí)施例一:獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段
[0071]1、引物設(shè)計(jì)
[0072]根據(jù)GM-CSF基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO:1所示)和pIRES2_EGFP質(zhì)粒載體上預(yù)期插入的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異性引物如下:
[0073]GM-CSF上游引物(如序列表中SEQ ID NO: 4所示):
[0074]5? -CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3?(下劃線部分為 EcoR I 酶切位點(diǎn)序列)，
[0075]GM-CSF下游引物(如序列表中SEQ ID NO: 5所示):
[0076]5’ -TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’ (下劃線部分為 BamH I 酶切位點(diǎn)序列)。[0077]2、獲取cDNA模板
[0078]TRIzon法從CIK細(xì)胞(Cytokine-1nduced Killer,細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)或者人外周血分離的單個(gè)核細(xì)胞中，提取RNA (TRIzon總RNA提取試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為CW0580)，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA (反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為RR019A)。
[0079]3、獲取含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段
[0080]以所得到的cDNA為模板，在上述含有特異性酶切位點(diǎn)的上、下游引物的作用下，通過(guò)PCR反應(yīng)獲得GM-CSF基因片段，其上游含有EcoR I酶切位點(diǎn)序列，下游含有BamH I酶切位點(diǎn)序列，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0081]PCR反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0082]
eDNA 模板(IOOng/pL)1.0pL,
GM-CSF 上游弓 I物(ΙΟμΜ)2.0μ[,
GM-CSF 下游引物(IΟμΜ)2.0pL,
2X Prime STAR Max DNA Polymerase 25μΙ_,
天菌蒸懷水20^Lo
[0083]其中，2XPrime STAR Max DNA Polymerase為DNA聚合酶-緩沖液復(fù)合物，購(gòu)自寶生物(大連)有限公司，產(chǎn)品編號(hào)為R045A。
`[0084]PCR反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;98°C變性10s，55°C退火5s，72°C延伸5s，30個(gè)循環(huán)；72°C最終延伸5min。
[0085]實(shí)施例二:pIRES2-GM-CSF_EGFP重組載體的構(gòu)建
[0086]使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和BamH I，分別酶切pIRES2_EGFP質(zhì)粒(該質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)處含有EcoR 1.BamH I酶切位點(diǎn))以及實(shí)施例一所得的GM-CSF基因片段，得到酶切后線性化的PIRES2-EGFP載體以及酶切后的GM-CSF基因序列；采用T4DNA連接酶體系進(jìn)行連接反應(yīng)，在22°C下孵育30分鐘，然后在70°C下滅活5分鐘，構(gòu)建pIRES2_GM-CSF_EGFP重組載體(如圖3所示)。
[0087]由PIRES2-EGFP質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(如圖2所示)可知，GM-CSF基因插入p IRES2-EGFP質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，位于質(zhì)粒載體的自身序列IRES的上游(如圖3所示)，即在同一啟動(dòng)子啟動(dòng)下的GM-CSF和EGFP序列分別表達(dá)。
[0088]1、雙酶切 pIRES2-EGFP 質(zhì)粒
[0089]酶切反應(yīng)體系如下(50 μ L):
[0090]
【權(quán)利要求】
1.GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，其沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有GM-CSF基因、IRES序列和MART-1基因，或者沿載體轉(zhuǎn)錄方向依次連接有MART-1基因、IRES序列和GM-CSF 基因； 所述GM-CSF基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述MART-1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，所述IRES序列的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO:3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2-GM-CSF-MART_l重組載體；其中，GM-CSF基因位于IRES序列的上游，MART-1基因位于IRES序列的下游。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體，其特征在于:所述的載體為PIRES2-EGFP質(zhì)粒載體，所述的雙基因共表達(dá)重組載體為pIRES2-MART-l-GM_CSF重組載體；其中，MART-1基因位于IRES序列的上游，GM-CSF基因位于IRES序列的下游。
4.權(quán)利要求1所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: O獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段； 2)將步驟I)得到的GM-CSF基因片段或MART-1基因片段連接于載體，構(gòu)建含有GM-CSF基因或MART-1基因的重組載體； 3)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段； 4)將步驟3)得到的MART-1基因片段或GM-CSF基因片段連接于步驟2)得到的重組載體，構(gòu)建所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體。
5.權(quán)利要求2所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: A)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)序列的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有EcoR I和BamH I酶切位點(diǎn)的GM-CSF基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:6所示； B)構(gòu)建pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶EcoRI、BamH I分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟A)得到的GM-CSF基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體； C)獲得含有酶切粘性末端的MART-1基因片段:從黑色素瘤細(xì)胞A375獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的MART-1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到MART-1基因片段混合物，其中的一種MART-1基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； D)構(gòu)建pIRES2-GM-CSF-MART-l重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX1、Not I酶切步驟B)得到的pIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體，將步驟C)得到的MART-1基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-GM-CSF-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-GM-CSF-MART-1 重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟A)所述的GM-CSF特異性引物為: GM-CSF 上游引物:5’ -CGGAATTCATGTGGCTGCAGA-3’，GM-CSF 下游引物:5’ -TTGGATCCTCACTCCTGGACTGGCT-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟C)所述的MART-1特異性引物包括MART-1第一引物對(duì)和MART-1第二引物對(duì)，所述的MART-1第一引物對(duì)由MART-1上游長(zhǎng)弓丨物和MART-1下游長(zhǎng)弓丨物組成，所述的MART-1第二引物對(duì)由MART-1上游短引物和MART-1下游短引物組成: MART-1第一引物對(duì)為: MART-1 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGCCAAGAGAAGATGCTCACT-3’， MART-1 下游長(zhǎng)引物:5’ -GGCCGCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’ ； MART-1第二引物對(duì)為: MART-1 上游短引物:5’ -ATGCCAAGAGAAGATGCTCACTTCATC-3’， MART-1 下游短引物:5’ -GCTTAAGGTGAATAAGGTGGTGGTGAC-3’。
8.權(quán)利要求3所述的GM-CSF和MART-1雙基因共表達(dá)重組載體的制備方法，包括以下步驟: a)獲得含有特異性酶切位點(diǎn)的MART-1基因片段:從黑色素瘤細(xì)胞A375獲取cDNA作為模板，用含有Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)序列的MART-1特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到含有Xho I和EcoR I酶切位點(diǎn)的MART-1基因片段，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； b)構(gòu)建pIRES2-MART-l-EGFP重組載體:用限制性內(nèi)切酶Xho1、EcoR II分別酶切PIRES2-EGFP質(zhì)粒以及步驟a)得到的MART-1基因片段，并采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MART-1-EGFP重組載體； c)獲得含有酶切粘性末端的GM-CSF基因片段:從CIK細(xì)胞獲取cDNA作為模板，用含有BstX I和Not I酶切粘性末端的GM-CSF特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得到的PCR反應(yīng)產(chǎn)物再進(jìn)行雜交PCR反應(yīng)，得到GM-CSF基因片段混合物，其中的一種GM-CSF基因片段具有BstX I和Not I酶切粘性末端； d)構(gòu)建pIRES2-MART-l-GM-CSF重組載體:用限制性內(nèi)切酶BstX1、Not I酶切步驟b)得到的pIRES2-MART-l-EGFP重組載體，將步驟c)得到的GM-CSF基因片段混合物與酶切后線性化的PIRES2-MART-1-EGFP重組載體混合，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，得到PIRES2-MART-1-GM-CSF 重組載體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟a)所述的MART-1特異性引物為: MART-1 上游引物:5’ -AACTCGAGATGCCAAGAGAAGATGC-3’， MART-1 下游引物:5’ -CGGAATTCTTAAGGTGAATAAGGTG-3’。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟C)所述的GM-CSF特異性引物包括GM-CSF第一引物對(duì)和GM-CSF第二引物對(duì)，所述的GM-CSF第一引物對(duì)由GM-CSF上游長(zhǎng)弓丨物和GM-CSF下游長(zhǎng)引物組成，所述的GM-CSF第二引物對(duì)由GM-CSF上游短引物和GM-CSF下游短引物組成: GM-CSF第一引物對(duì)為: GM-CSF 上游長(zhǎng)引物:5’ -AACCATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’， GM-CSF 下游長(zhǎng)引物:5’ -GGCCGCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’ ；GM-CSF第二引物對(duì)為:GM-CSF 上游短引物:5’ -ATGTGGCTGCAGAGCCTGCT-3’，GM-CSF 下游短 引物:5’ -GCTCACTCCTGGACTGGCTC-3’。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103602695SQ201310611566
【公開(kāi)日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月25日
【發(fā)明者】左百樂(lè), 曹毓琳, 栗炳南, 林俊堂, 豐慧根, 連杰 申請(qǐng)人:河南省華隆生物技術(shù)有限公司