一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細(xì)胞領(lǐng)域，公開(kāi)了一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法。本發(fā)明所述方法為牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后與爪蟾卵母細(xì)胞抽提物共孵育，用含2mM?CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。本發(fā)明所述方法高效、穩(wěn)定、安全。本發(fā)明所述牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，組蛋白H3K9乙酰化程度降低，有Oct-4蛋白及多能性標(biāo)志基因Oct-4、Nanog的表達(dá)，表明牛胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)生了重編程，細(xì)胞基因表達(dá)方式發(fā)生改變，表現(xiàn)干細(xì)胞特性，恢復(fù)部分發(fā)育全能性，可作為核供體制備克隆胚胎進(jìn)行體細(xì)胞克隆。
【專利說(shuō)明】一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法，尤其涉及一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程成的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自古以來(lái)，牛就是人類喜愛(ài)飼養(yǎng)的家畜。牛的用途廣泛:肉和乳可供食物，皮是制革原料，角、骨也是工業(yè)原料，牛角還可做藥材及工藝品，里內(nèi)的牛黃更是珍貴的藥材，而且牛還可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等提供役力和肥料。長(zhǎng)久以來(lái)人們一直期望獲得具有一定所需的特性或性質(zhì)牛品種，例如高產(chǎn)肉量的肉牛品種，高產(chǎn)奶量、哺乳間隔期長(zhǎng)以及疾病抵抗力強(qiáng)的奶牛品種等。傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方法最然能夠培養(yǎng)出具有一些特定所需特性的牛品種，但通常這些特性伴隨著一些不需要的性質(zhì)，而且傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方法耗時(shí)、昂貴且遺傳穩(wěn)定性不可靠。
[0003]哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆技術(shù)已有近20年的發(fā)展歷史，其是指通過(guò)顯微操作去核、核供體細(xì)胞的融合、重構(gòu)胚激活等實(shí)驗(yàn)室手段，將某種類型的體細(xì)胞和核受體(一般是成熟卵母細(xì)胞)進(jìn)行體外融合重構(gòu)以形成克隆胚胎，再將克隆胚進(jìn)行胚胎移植給代孕的母畜，達(dá)到大量生產(chǎn)遺傳同質(zhì)哺乳動(dòng)物的一種生物技術(shù)。體細(xì)胞克隆技術(shù)具有四大優(yōu)點(diǎn):一是可以控制性別；二是成本低；三是克服國(guó)外引進(jìn)優(yōu)良品種的限制；四是可快速更新?lián)Q代，擴(kuò)繁優(yōu)良品種。體細(xì)胞克隆技術(shù)在牛的養(yǎng)殖業(yè)中有重要的應(yīng)用前景，對(duì)加速畜種改良、提高乳品質(zhì)量有著重要的作用。應(yīng)用體細(xì)胞克隆技術(shù)可以不受限制地保存某些個(gè)體的優(yōu)良性狀，并迅速地?cái)U(kuò)大優(yōu)良個(gè)體的數(shù)量。體細(xì)胞克隆技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)結(jié)合，可以大大提高轉(zhuǎn)基因的效率，加速實(shí)現(xiàn)動(dòng)物遺傳的改造。體細(xì)胞克隆技術(shù)與乳腺反應(yīng)器技術(shù)結(jié)合，可以直接從乳品中生產(chǎn)藥用蛋白，或改良乳品質(zhì)量。
[0004]雖然體細(xì)胞克隆技術(shù)在小鼠、大鼠、牛、山羊、豬、貓、馬、雪貂、狼、水牛等多種動(dòng)物獲得成功，但體細(xì)胞克隆的效率仍然很低，克隆胚胎的發(fā)育到期率不到5%，克隆動(dòng)物存在著高流產(chǎn)率及新生胎兒高死亡率，只有極少數(shù)克隆動(dòng)物能夠健康存活至成年，這些都嚴(yán)重地制約著克隆技術(shù)的廣泛應(yīng)用和發(fā)展。目前認(rèn)為造成體細(xì)胞克隆效率低的主要原因是高度分化的體細(xì)胞在卵母細(xì)胞質(zhì)中重編程不完全，表觀遺傳修飾異常所致。而分化程度較低的細(xì)胞似乎有較強(qiáng)的重塑性，更易于發(fā)生蛋白的替換。因此將體細(xì)胞克隆與體細(xì)胞重編程相結(jié)合，誘導(dǎo)體細(xì)胞恢復(fù)到較低的分化狀態(tài)，以分化程度較低的細(xì)胞作為核供體進(jìn)行體細(xì)胞克隆以提聞克隆效率。
[0005]體細(xì)胞重編程是指已分化的體細(xì)胞在特定條件下被逆轉(zhuǎn)回原始多能狀態(tài)或轉(zhuǎn)分化為其他類型細(xì)胞。誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法主要有體細(xì)胞核移植、細(xì)胞融合、特定轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)導(dǎo)等。
[0006]體細(xì)胞核移植是指將供體細(xì)胞移入去核卵母細(xì)胞中，在卵母細(xì)胞質(zhì)中各種因子作用下，去分化恢復(fù)發(fā)育全能性，形成胚胎，移入受體后發(fā)育成新個(gè)體的過(guò)程。1997年世界首例成體細(xì)胞克隆綿羊Dolly誕生，證實(shí)了高度分化的體細(xì)胞有恢復(fù)全能性并發(fā)育成新個(gè)體的能力，開(kāi)啟了體細(xì)胞核移植研究的熱潮。因此，體細(xì)胞核移植技術(shù)為研究體細(xì)胞重編程的分子機(jī)制提供了廣闊的思路。體細(xì)胞核移植雖然在多種哺乳動(dòng)物獲得成功，但其機(jī)制仍不明確，供體核存在著重編程不完全、表觀遺傳修飾異常等現(xiàn)象，克隆效率很低，即使是在牛上，總效率也低于10% ;而且該技術(shù)還受到倫理道德和國(guó)家法規(guī)的干預(yù)，嚴(yán)重制約著這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。
[0007]細(xì)胞融合是指在自發(fā)或人工誘導(dǎo)下，兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞合并成一個(gè)雙核或多核細(xì)胞的過(guò)程。實(shí)驗(yàn)證明在大多數(shù)雜交細(xì)胞中，分化程度較低的細(xì)胞往往占據(jù)主導(dǎo)地位。1976年，Miller和Ruddle首次證實(shí)細(xì)胞融合可以使體細(xì)胞重編程恢復(fù)多能性。他們將小鼠胸腺細(xì)胞與胚胎癌細(xì)胞雜交，產(chǎn)生的四倍體表達(dá)多潛能性細(xì)胞標(biāo)志，將雜交細(xì)胞注入裸鼠中可以形成包含3個(gè)胚層組織的畸胎瘤。近年來(lái)體細(xì)胞與胚胎生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞進(jìn)行的雜合也獲得了相似的結(jié)果。雖然細(xì)胞融合技術(shù)避免了卵母細(xì)胞來(lái)源困難、基因操作復(fù)雜等問(wèn)題，但多倍體的存在致使雜合體基因組不穩(wěn)定，具有潛在風(fēng)險(xiǎn)；并且四倍體狀態(tài)阻滯細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育，因此細(xì)胞融合后需移除來(lái)源于ES、EC、EG細(xì)胞的染色體，但目前尚未找到有效去除多余染色體的方法，細(xì)胞融合技術(shù)在體細(xì)胞重編程中的應(yīng)用有較大的局限性。
[0008]Yamanaka和Takahashi將4個(gè)對(duì)細(xì)胞重編程至關(guān)重要的因子0ct4、Sox2、Klf4和C-Myc導(dǎo)入小鼠成纖維細(xì)胞，獲得類胚胎干細(xì)胞性質(zhì)的誘導(dǎo)多潛能性干細(xì)胞，具有強(qiáng)大的更新能力和分化潛能，這一里程碑式的發(fā)現(xiàn)，開(kāi)啟了特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程研究的新篇章。特定轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞命運(yùn)的直接轉(zhuǎn)變，摒棄了干細(xì)胞和卵母細(xì)胞帶來(lái)的倫理道德問(wèn)題，在細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)方面有廣闊的應(yīng)用前景。但目前細(xì)胞誘導(dǎo)效率低，且面臨誘發(fā)癌癥的威脅，嚴(yán)重制約著它的應(yīng)用。因此，進(jìn)一步探究重編程機(jī)制，建立高效、穩(wěn)定、安全的誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程的方法是目前科學(xué)界亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種高效、穩(wěn)定、安全的誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0011]一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法，牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后與爪蟾卵母細(xì)胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
[0012]優(yōu)選的，所述牛胎兒成纖維細(xì)胞由40日齡牛胎兒軀干部組織經(jīng)75%酒精和含1%雙抗的PBS中漂洗后在T25培養(yǎng)瓶中經(jīng)全培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。
[0013]
優(yōu)選的，所述毛地黃皂苷溶液濃度為7 μ g/mL。
[0014]優(yōu)選的，所述透化處理為在0°C條件下處理2min。
[0015]優(yōu)選的，所述爪蟾卵母細(xì)胞抽提物制備方法為爪蟾卵去卵膠膜后經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解再經(jīng)高速離心破碎后收集卵母細(xì)胞粗提物。
[0016]優(yōu)選的，所述共孵育為在23°C條件下與共孵育lh。
[0017]優(yōu)選的，所述封閉的時(shí)間為2h。
[0018]優(yōu)選的，所述培養(yǎng)的時(shí)間為6-7d。
[0019]本發(fā)明還提供了上述方法重編程得到的牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。[0020]本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法，所述方法為牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后與爪蟾卵母細(xì)胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。本發(fā)明所述方法高效、穩(wěn)定、安全。經(jīng)本發(fā)明所述方法誘導(dǎo)重編程得到的牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，組蛋白H3K9乙?；潭冉档?，有Oct-4蛋白及多能性標(biāo)志基因0ct-4、Nanog的表達(dá)，表明牛胎兒成纖維細(xì)胞發(fā)生了重編程，細(xì)胞基因表達(dá)方式發(fā)生改變，表現(xiàn)干細(xì)胞特性，恢復(fù)部分發(fā)育全能性，可作為核供體制備克隆胚胎進(jìn)行體細(xì)胞克隆。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1示實(shí)施例5爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞(100X )，其中，圖中A為待處理細(xì)胞、圖中B為抽提物處理中細(xì)胞、圖中C為抽提物處理后細(xì)胞、圖中D為抽提物處理后6d細(xì)胞形成“克隆簇”、圖中E為6d抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)的未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞、圖中F為6d常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)的未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞；
[0022]圖2示實(shí)施例6爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞和未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞H3K9免疫熒光染色分析結(jié)果圖，其中實(shí)驗(yàn)組為爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞，對(duì)照組為未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞；
[0023]圖3示實(shí)施例7爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞和未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞堿性磷酸酶染色圖(100X )，其中，圖中A為抽提物處理后6d細(xì)胞形成克隆簇、圖中B為克隆簇堿性磷酸酶陽(yáng)性、圖中C為未處理對(duì)照細(xì)胞堿性磷酸酶陰性；
[0024]圖4示實(shí)施例8爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞和未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞0ct4免疫熒光染色圖(100X )，其中，圖中A-C為抽提物處理6d后“克隆簇”細(xì)胞0ct4免疫熒光染色呈陽(yáng)性、圖中D-F為未處理對(duì)照細(xì)胞6d后未形成“克隆簇” 0ct4免疫熒光染色呈陰性；圖中A和D為普通光源、圖中B和E為激發(fā)光波長(zhǎng)450-490nm、圖中C和F為激發(fā)光波長(zhǎng)510_560nm ；
[0025]圖5示實(shí)施例9爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞0ct4表達(dá)量的Western Blot檢測(cè)圖，其中，泳道A為爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞，泳道B為未經(jīng)處理對(duì)照細(xì)胞；
[0026]圖6示實(shí)施例10爪蟾卵母細(xì)胞抽提物處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞、以同一來(lái)源、同時(shí)培養(yǎng)的未處理細(xì)胞(抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng))和抽提物處理后常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS)培養(yǎng)細(xì)胞中多能性標(biāo)志基因0ct4、SOX2、NanOg的表達(dá)的電泳圖，GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因；其中，泳道A為抽提物處理干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，泳道B為抽提物處理普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，泳道C為未處理干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，泳道D為未處理普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 本發(fā)明實(shí)施例公開(kāi)了一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0028]為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0029]一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法，牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后與爪蟾卵母細(xì)胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
[0030]抽提物誘導(dǎo)體細(xì)胞重編程是采用卵母細(xì)胞、干細(xì)胞等細(xì)胞提取物與體細(xì)胞共孵育，誘導(dǎo)體細(xì)胞發(fā)生重編程，改變基因表達(dá)模式，引起細(xì)胞去分化，恢復(fù)部分發(fā)與全能性。
[0031]其中，所述牛胎兒成纖維細(xì)胞由40日齡牛胎兒軀干部組織經(jīng)75%酒精和含1%雙抗的PBS中漂洗后在T25培養(yǎng)瓶中經(jīng)全培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。
[0032]所述1%雙抗的PBS是指含lv/v%青霉素和鏈霉素的pH7.4的磷酸鹽緩沖，各青霉素和鏈霉素各0.5v/v%，青霉素終濃度為100U/mL，鏈霉素終濃度為100 μ g/mL。
[0033]所述全培養(yǎng)基即常規(guī)培養(yǎng)基，具體是指DMEM+10%FBS。[0034]所述牛胎兒成纖維細(xì)胞的在T25培養(yǎng)瓶中經(jīng)全培養(yǎng)基培養(yǎng)具體為漂洗后軀干部組織剪成組織碎塊后均勻涂抹在T25培養(yǎng)瓶中，小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入全培養(yǎng)基，倒置放入培養(yǎng)箱中，6_8h后，小心翻瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，l-2d后觀察并補(bǔ)加全培養(yǎng)基，待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，傳代或凍存。
[0035]在一些實(shí)施例中，所述牛胎兒成纖維細(xì)胞透化處理還對(duì)細(xì)胞進(jìn)行清洗，具體為當(dāng)細(xì)胞至50%-60%匯合時(shí)吸去孔中細(xì)胞培養(yǎng)基用預(yù)冷的PBS清洗兩遍后吸凈液體。
[0036]毛地黃阜苷,英文名digitonin,是從紫花毛地黃的葉和種子中得到的一種配糖體。毛地黃皂苷是一種非離子去垢劑，低濃度的毛地黃皂苷溶液使細(xì)胞膜上的膽固醇聚集，可以使細(xì)胞膜出現(xiàn)孔道，而不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。本發(fā)明所述方法以毛地黃皂苷溶液作為細(xì)胞膜透化劑處理牛胎兒成纖維細(xì)胞以提高牛胎兒成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性。其中，所述毛地黃皂苷溶液為毛地黃皂苷溶于PBS液中獲得的溶液。
[0037]本發(fā)明以不同濃度的毛地黃皂苷溶液處理牛胎兒成纖維細(xì)胞，篩選出細(xì)胞膜透化劑的最適濃度，結(jié)果顯示以7 μ g/mL毛地黃皂苷溶液處理牛胎兒成纖維細(xì)胞，有55%的細(xì)胞發(fā)生透化，且細(xì)胞狀態(tài)良好，經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞死亡率小于10%，細(xì)胞透化率與死亡率比值最高。因此，所述毛地黃皂苷溶液濃度優(yōu)選為7 μ g/mL。
[0038]優(yōu)選的，所述透化處理為在0°C條件下處理2min。在一些實(shí)施例中為冰上作用2min,并不時(shí)輕輕搖晃，然后快速吸去毛地黃皂苷溶液，預(yù)冷的PBS清洗3_5遍。
[0039]本發(fā)明所述方法在牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后將爪蟾卵母細(xì)胞抽提物與經(jīng)透化的細(xì)胞共孵育。
[0040]其中，所述共孵育優(yōu)選為在23°C條件下與共孵育lh。
[0041]在一些實(shí)施例中所述爪蟾卵母細(xì)胞抽提物的制備方法為爪蟾卵去卵膠膜后經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解再經(jīng)高速離心破碎后收集卵母細(xì)胞粗提物。所述細(xì)胞裂解液是指含2.5mMMgCl2.6H20, 50mM KCl, IOmM Hepes (4-輕乙基喊嚷乙橫酸)和 250mM Sucrose (鹿糖)的水溶液。
[0042]優(yōu)選的，在細(xì)胞裂解液裂解步驟和高速離心破碎步驟前分別加入蛋白酶抑制劑，以防止蛋白水解。所述蛋白酶抑制劑優(yōu)選為抑肽酶或亮肽素。[0043]抑肽酶也稱胰蛋白酶抑制劑，自牛腮腺、牛胰或肺等臟器中提取而得的堿多肽，是一種天然廣譜蛋白酶抑制劑。每I個(gè)單位抑肽酶可使0.Syg甲基胰蛋白酶失活。抑肽酶能與多種蛋白酶的活動(dòng)中心競(jìng)爭(zhēng)一個(gè)賴氨?；种破浠钚裕芤种评w維酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶、凝血酶及凝血因子IV-XII，阻止胰臟中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活等。
[0044]亮肽素屬于玫瑰鏈霉菌產(chǎn)生的胰蛋白酶抑劑，它是許多蛋白酶抑制劑中的一種。亮肽素可抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、組織蛋酶B、血纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶等，它的抑制作用與底物呈競(jìng)爭(zhēng)抑制。對(duì)血纖維蛋白溶酶的抑制IC50為8 μ g/mL,但不抑制糜蛋白酶。
[0045]在一些具體實(shí)施例中所述爪蟾卵母細(xì)胞抽提物的制備方法具體包括:
[0046]步驟1、爪蟾卵分開(kāi)收集于燒杯中，倒掉多余的水，用塑料吸管吸出廢卵，保留輪廓清晰、形態(tài)統(tǒng)一的卵；
[0047]步驟2、移除多余的水和廢卵后，添加新鮮配制的2%半胱氨酸，輕柔攪動(dòng)去卵膠膜；
[0048]步驟3、倒掉上述溶液，0.25 XMMR洗卵三次，I XMMR洗卵一次；
[0049]步驟4、細(xì)胞裂解液漂洗一次，此階段再次用塑料吸管挑除壞卵，細(xì)胞裂解液再漂洗一次；
[0050]步驟5、將卵轉(zhuǎn)移到含ImM二巰基蘇糖醇和100 μ L蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，輕輕攪動(dòng)后倒掉細(xì)胞裂解液并將卵轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，待卵沉淀后用塑料吸管移去離心管上層多余溶液；
[0051]步驟6、800rpm離心10_15s,進(jìn)一步移去離心管上層多余溶液；
`[0052]步驟7、添加抑肽酶或亮肽素到卵頂部，4°C，1000Orpm離心15min，離心后爪蟾卵
破碎、液體呈現(xiàn)分明三層；
[0053]步驟8、用2mL注射器刺入下層上部吸取粗提物，粗提物轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的離心管中添加甘油，4°C混勻，分裝，液氮冷凍，保存于_80°C備用。
[0054]上述爪蟾卵母細(xì)胞抽提物的制備方法首先收集輪廓清晰、形態(tài)統(tǒng)一的卵添加去膠膜緩沖液2%半胱氨酸輕柔攪動(dòng)以去除卵膠膜，去除卵膠膜的攪動(dòng)過(guò)程不要超過(guò)5min，當(dāng)膠膜完全去除后，卵通常聚集在一起，洗液渾濁且有沉淀。攪動(dòng)去除卵膠膜后倒掉去膠膜緩沖液利用MMR洗卵。其中2%半胱氨酸配制方法為2g半胱氨酸鹽酸鹽溶解于IOOmLl X MMR，用NaOH調(diào)pH至7.8。所述MMR包括5mM pH7.8HEPES (4-羥乙基哌嗪乙磺酸)、0.ImM EDTA,IOOmM NaCl、2mM KClUmM MgSO4,2mM CaCl20 所述 MMR 洗卵先經(jīng)過(guò) 0.25XMMR 洗卵再用I XMMR洗卵，且MMR洗卵過(guò)程要盡量快，以避免卵在半胱氨酸和MMR中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。由于卵的質(zhì)量對(duì)于提取物制備的結(jié)果有很大影響，因此經(jīng)MMR洗的卵用細(xì)胞裂解液漂洗后用塑料吸管挑除動(dòng)物極植物極不分明、漂浮、蓬松的壞卵，之后細(xì)胞裂解液再漂洗一次，使卵稍有變形。上述提取卵母細(xì)胞粗提物的方法在細(xì)胞裂解液漂洗后將卵轉(zhuǎn)移到含ImM 二巰基蘇糖醇和5 μ g/mL蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中，輕輕攪動(dòng)后倒掉細(xì)胞裂解液并將卵轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，待卵沉淀后用塑料吸管移去離心管上層多余溶液，之后SOOrpm離心10-15S，進(jìn)一步移去離心管上層多余溶液。由于再次離心后移去多余溶液既需將多余液體移除干凈，又需小心避免丟失卵，因此最好采用移液器或注射器操作。在移除多余溶液后高速離心使爪蟾卵破碎，卵母細(xì)胞抽提物釋放。為了防止蛋白水解，在離心前加入蛋白酶抑制劑，所述蛋白酶抑制劑的終濃度至5μ g/mL，所述蛋白酶抑制劑優(yōu)選為抑肽酶或亮肽素。爪蟾卵離心破碎后液體呈現(xiàn)分明三層，上層為黃色脂質(zhì)，中層為棕色細(xì)胞粗提物，下層為近黑色的細(xì)胞碎片。用2mL注射器刺入下層上部吸取粗提物，轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的離心管中添加甘油，4°C混勻，分裝，液氮冷凍，保存于-80°C備用。注射器吸取粗提物時(shí)需要注意避免混入雜質(zhì)。而與粗提物混合的甘油的終濃度為5%。為了獲得更多的抽提物，還可以重復(fù)加入蛋白酶抑制劑后高速離心的步驟。
[0055]在一些實(shí)施例中通常促使爪蟾超數(shù)排卵以獲得更多的爪蟾卵，進(jìn)而獲得更多的爪蟾卵母細(xì)胞抽提物。所述爪蟾超數(shù)排卵優(yōu)選為注射激素超排卵。所述激素優(yōu)選為孕馬血清促性腺激素和/或人絨毛膜促性腺激素。
[0056]孕馬血清促性腺激素即PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin),也稱為馬絨毛膜促性腺激素，它是在懷孕母馬血清中發(fā)現(xiàn)的一種激素，并已知在妊娠馬屬動(dòng)物(驢、斑馬等)都有產(chǎn)生，是一種糖蛋白激素。PMSG分子與垂體促性腺激素一樣，也是由α和β亞單位組成，而β亞單位是表現(xiàn)其活性的主要部分。PMSG具有類似垂體分泌卵泡刺激素(FSH)和促黃體素(LH)的雙重活性，但以FSH的作用為主，因此有著明顯的促卵泡發(fā)育的作用，同時(shí)有一定的促排卵和黃體形成的功能。
[0057]人絨毛膜促性腺激素(HCG)是由胎盤(pán)的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β 二聚體的糖蛋白組成，也具有FSH和LH的功能，即促排卵和黃體形成的功能。
[0058]在一些實(shí)施例中所述非洲爪蟾超數(shù)排卵具體為選擇性成熟雌性非洲爪蟾，于背部淋巴囊處淺表注射100 μ L、濃度為IIU/μ L新鮮配制的孕馬血清促性腺激素，收卵前一天同樣位置注射100 μ L、濃度為5IU/μ L人絨毛膜促性腺激素，注射后16-22h后，取出非洲爪蟾，倒掉多余水分，收取爪蟾卵。其中，注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素后爪蟾需放置于0.1M鹽水中，以防止爪蟾感染。注射孕馬血清促性腺激素后再次注射人絨毛膜促性腺激素需在收卵前一天進(jìn)行，通常是注射孕馬血清促性腺激素3-30天后。
[0059]本發(fā)明所述方法在爪蟾卵母細(xì)胞抽提物與經(jīng)透化處理的牛胎兒成纖維細(xì)胞共孵育后用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
[0060]其中，含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道的封閉時(shí)間優(yōu)選為2h。而抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為6-7d。而所述抽提物處理培養(yǎng)基是指含5v/v%FBS，lv/v%青霉素和鏈霉素，0.lmM2-巰基乙醇，lv/v%非必須氨基酸，ImM谷氨酰胺，0.3 μ M核苷酸的DMEM低糖培養(yǎng)液。
[0061]本發(fā)明步驟D在包含ATP-再生體系的爪蟾卵母細(xì)胞抽提物與F4代牛胎兒成纖維細(xì)胞共孵育完畢后吸去抽提物，全培養(yǎng)基清洗3-5遍，用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞2h,以封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道。然后去除上述培養(yǎng)基，加入抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)，隔天換新鮮的抽提物處理培養(yǎng)基并清除死細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)6-7d。
[0062]本發(fā)明在抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后進(jìn)行H3K9相對(duì)免疫熒光染色分析細(xì)胞乙?；兓闆r。在抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)6d后，分別進(jìn)行堿性磷酸酶染色實(shí)驗(yàn)、0ct4相免疫突光染色分析、0ct4蛋白的western blot檢測(cè)以及0ct4、Sox2、Nanog的RT-PCR擴(kuò)增檢測(cè)，以檢測(cè)細(xì)胞干性、多能性因子0ct4表達(dá)情況以及多能性標(biāo)志基因0ct4、Sox2、Nanog表達(dá)。結(jié)果顯示，堿性磷酸酶染色呈陽(yáng)性，組蛋白H3K9乙?；潭冉档?，并檢測(cè)到Oct-4蛋白的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)到多能性標(biāo)志基因Oct-4、Nanog的表達(dá)，表明本發(fā)明所述誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程成多能干細(xì)胞的方法能引起體細(xì)胞基因表達(dá)方式改變，表現(xiàn)干細(xì)胞特性，恢復(fù)部分發(fā)育全能性。
[0063]因此本發(fā)明還提供了所述誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法重編程得到的牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
[0064]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。其中所用的試劑及試劑盒均為市售產(chǎn)品可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買(mǎi)得到或按現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道自行制備得到。
[0065]實(shí)施例1:非洲爪蟾的超數(shù)排卵
[0066]選擇性成熟雌性非洲爪蟾，背部淋巴囊處淺表注射100 μ L新鮮配制的PMSG (濃度為liu/μυ。注射后爪蟾放置于0.1M鹽水中，防止爪蟾感染。收卵前一天(通常是注射PMSG3-30d后)同樣位置注射100 μ LHCG (濃度為5IU/y L)。注射后爪蟾單獨(dú)放置于0.1M鹽水中。16-22h后，取出非洲爪蟾，倒掉多余水分，收取爪蟾卵。
[0067]實(shí)施例2:爪蟾卵母細(xì)胞內(nèi)容物提取
[0068]1.爪蟾卵分開(kāi)收集于燒杯中，倒掉多余的水，用塑料吸管吸出廢卵，保留輪廓清晰、形態(tài)統(tǒng)一的卵。
[0069]2.移除多余的水和廢卵后，添加新鮮配制的2%半胱氨酸，輕柔攪動(dòng)去卵膠膜，過(guò)程不要超過(guò)5min。當(dāng)膠膜完全去除后，卵通常聚集在一起，洗液渾濁且有沉淀。
[0070]3.倒掉去膠膜緩沖液，0.25XMMR洗卵三次，IXMMR洗卵一次，洗卵過(guò)程要盡量快，以避免卵在半胱氨酸和MMR中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。
`[0071]4.細(xì)胞裂解液漂洗一次，此階段再次用塑料吸管挑除壞卵(動(dòng)物極植物極不分明、漂浮、蓬松的卵)，細(xì)胞裂解液再漂洗一次，使卵稍有變形。
[0072]5.將卵轉(zhuǎn)移到含ImM 二巰基蘇糖醇和5 μ g/mL蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液中。輕輕攪動(dòng)后倒掉細(xì)胞裂解液并將卵轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，待卵沉淀后用塑料吸管移去離吸管上層多余溶液。
[0073]6.800rpm離心10_15s，進(jìn)一步移去離心管上層多余溶液。此步驟既需將多余液體移除干凈，又需小心避免丟失卵，最好采用移液器或注射器操作。
[0074]7.添加抑肽酶或亮肽素到卵頂部(根據(jù)卵的體積終濃度至5yg/mL)，4°C，1000Orpm離心15min。離心后爪蟾卵破碎、液體呈現(xiàn)分明三層，上層為黃色脂質(zhì)，中層為棕色細(xì)胞粗提物，下層為近黑色的細(xì)胞碎片。
[0075]8.用2mL注射器抽取刺入下層上部吸取粗提物，注意避免混入雜質(zhì)。
[0076]9.將粗提物轉(zhuǎn)移到一個(gè)預(yù)冷的離心管中，添加抑肽酶或亮肽素到卵頂部(根據(jù)卵的體積終濃度至5 μ g/mL), 4°C, 1000Orpm離心15min。
[0077]10.同樣方法吸取抽提物，用吸管將抽提物轉(zhuǎn)移到一個(gè)4°C預(yù)冷的干凈的離心管中，添加甘油，4 °C混勻。
[0078]11.將抽提物分裝，液氮冷凍，保存于-80°C備用。
[0079]實(shí)施例3:胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
[0080]屠宰場(chǎng)取回40日齡牛胎兒清洗干凈，轉(zhuǎn)移入超凈工作臺(tái)中去除羊膜，用鑷子和剪刀去除和牛胎兒頭、尾、四肢和內(nèi)臟，保留軀干部組織。將剩下的軀干部組織依次經(jīng)75%酒精和含1%雙抗的PBS中漂洗3次。用消毒的剪刀將清洗后的組織剪成大約Imm2左右的組織碎塊。組織碎塊中添加少許血清，用巴氏吸管吸取碎塊，均勻涂抹在T25培養(yǎng)瓶中。小心翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入ImL全培養(yǎng)基，倒置放入培養(yǎng)箱中。6-8h后，小心翻瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。l-2d后觀察并補(bǔ)加液，待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)，傳代培養(yǎng)至F4代凍存。
[0081]實(shí)施例4:細(xì)胞透化濃度篩選
[0082]取4代生長(zhǎng)良好和牛胎兒成纖維細(xì)胞，傳代接種于24孔板中。胎兒成纖維細(xì)胞長(zhǎng)至50%-60%匯合時(shí)開(kāi)始透化處理，吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，細(xì)胞用預(yù)冷的PBS清洗兩遍。向每孔快速添加200 μ L不同濃度的細(xì)胞膜透化劑digitonin，培養(yǎng)皿迅速冰上作用2min，期間不時(shí)輕輕搖晃。透化2min后快速吸去培養(yǎng)皿中的digitonin溶液,用預(yù)冷的PBS清洗3-5遍，以除去殘留的digitonin溶液。采用10 μ g/mL PI染液細(xì)胞染色5min，熒光顯微鏡下觀察染色情況。每種濃度重復(fù)3次，每次隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)，按下式計(jì)算透化率，透化率=染色細(xì)胞數(shù)目/總細(xì)胞數(shù)。并采用SAS8.0軟件對(duì)不同digitonin濃度下獲得的透化率進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析。
[0083]試驗(yàn)首先選擇透化劑digitonin濃度為1、5、10、15、20 μ g/mL進(jìn)行初步篩選,通過(guò)PI染色(PI能進(jìn)入細(xì)胞膜破損細(xì)胞或死細(xì)胞但不能進(jìn)入活細(xì)胞)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)digitonin濃度達(dá)到10 μ g/mL時(shí)，85%以上的細(xì)胞被染色，即發(fā)生細(xì)胞膜透化，但以此濃度處理后細(xì)胞狀態(tài)較差，經(jīng)培養(yǎng)后超過(guò)80%細(xì)胞死亡，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0084]進(jìn)一步縮小篩選范圍，選擇digitonin濃度為5、6、7、8、9μ g/mL進(jìn)行篩選,結(jié)果表明當(dāng)濃度為x/mL時(shí)有55%的細(xì)胞發(fā)生透化(表2)，且細(xì)胞狀態(tài)良好，經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞死亡率小于10%。digitonin濃度為7 μ g/mL下，細(xì)胞透化率與死亡率比值最高，所以本發(fā)明所述方法采用透化劑digitonin濃度為7 μ g/mL。
[0085]表1不同digitonin濃度透化效率比較(1-20 μ g/mL)
[0086]
【權(quán)利要求】
1.一種誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程的方法，其特征在于，牛胎兒成纖維細(xì)胞經(jīng)毛地黃皂苷溶液透化處理后與爪蟾卵母細(xì)胞抽提物共孵育，用含2mM CaCl2的全培養(yǎng)基封閉細(xì)胞膜上的可逆孔道，然后抽提物處理培養(yǎng)基培養(yǎng)誘導(dǎo)牛胎兒成纖維細(xì)胞重編程獲得牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述牛胎兒成纖維細(xì)胞由40日齡牛胎兒軀干部組織經(jīng)75%酒精和含1%雙抗的PBS中漂洗后在T25培養(yǎng)瓶中經(jīng)全培養(yǎng)基培養(yǎng)得到。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛地黃皂苷溶液濃度為7μ g/mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述透化處理為在0°C條件下處理2min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述爪蟾卵母細(xì)胞抽提物制備方法為爪蟾卵去卵膠膜后經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解再經(jīng)高速離心破碎后收集卵母細(xì)胞粗提物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述共孵育為在23°C條件下與共孵育lh。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述封閉的時(shí)間為2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)的時(shí)間為6-7d。
9.權(quán)利要求1所述方法重編程`得到的牛胎兒成纖維多能干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】C12N5/073GK103667179SQ201310611835
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】杜衛(wèi)華, 范宗興, 朱化彬 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所