G418抗性標(biāo)記在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及G418抗性標(biāo)記的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，以G418的抗性為木霉抗性篩選標(biāo)記。該農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法包括將G418抗性基因與經(jīng)過酶切并去磷酸化的載體p1300連接成p1300-neo載體；農(nóng)桿菌菌株活化并培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.6，并用15～25mmol/L?CaCl2重懸菌體，制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；將p1300-neo載體與農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，35～40℃保溫至少3min，用LB培養(yǎng)基在25～35℃培養(yǎng)，再用含卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選出重組農(nóng)桿菌；將處于對數(shù)生長期且OD660值為0.6～0.8的活化的重組農(nóng)桿菌菌液與木霉分生孢子懸液混勻并誘導(dǎo)培養(yǎng)，再用含G418的M-100培養(yǎng)基在25～30℃培養(yǎng)并篩選出抗G418的木霉。本發(fā)明為木霉菌增加了一種新的抗性選擇標(biāo)記，為研究木霉的基因功能帶來了巨大方便，而且價格便宜。
【專利說明】G418抗性標(biāo)記在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳工程領(lǐng)域，具體來說涉及一種G418抗性標(biāo)記在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]木霉菌廣泛存在于土壤環(huán)境中，是土壤微生物的重要類群，也見于植物殘體及動物糞便上，在植物根圍、葉圍、種子及球莖等生態(tài)環(huán)境中也大量存在。自從上世紀(jì)30年代以來，這類有益微生物已廣泛用于植物病害的生物防治、纖維素酶的生產(chǎn)、生物修復(fù)功能。木霉能夠降解氰化物、農(nóng)藥、甲醛、柴油、酚類及吸附重金屬等。
[0003]農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法為木霉菌的遺傳改良和功能基因研究提供了有效手段。在木霉菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系中，最常用的選擇標(biāo)記基因是潮霉素抗性基因。通過潮霉素抗性標(biāo)記可以篩選獲得木霉突變體菌株，進(jìn)一步進(jìn)行木霉菌基因功能的研究，更好地發(fā)揮木霉在生物防治、環(huán)境修復(fù)以及工業(yè)產(chǎn)品生產(chǎn)中的應(yīng)用。但在研究木霉基因功能時，往往需要對野生木霉進(jìn)行基因敲除實驗，在此基礎(chǔ)上對敲除突變體進(jìn)行基因功能互補(bǔ)驗證實驗。此時，僅僅有一種抗性選擇標(biāo)記往往不能滿足要求，必須要有新的抗性選擇標(biāo)記才可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選。長期以來，用于木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記僅有潮霉素B抗性標(biāo)記，缺乏其它有效的抗性選擇標(biāo)記。因此，擴(kuò)展木霉菌顯性篩選標(biāo)記具有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的 第一個目的是提供一種G418在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用方法，該應(yīng)用方法是以G418的抗性為木霉抗性篩選標(biāo)記，以解決木霉菌遺傳轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記不足的問題。
[0005]本發(fā)明的第二個目的是提供一種新的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，以解決通常通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化，步驟比較繁瑣的問題。
[0006]實現(xiàn)上述第二個發(fā)明目的的技術(shù)方案為:所述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法包括
[0007](1)將從？31034質(zhì)粒中回收的6418抗性基因與經(jīng)過酶切并去磷酸化的載體？1300連接，構(gòu)建成pl300-neo載體；
[0008](2)農(nóng)桿菌菌株用LB培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)至0D_值為0.3~0.6，收集菌體，并用15~25mmol/L CaCl2重懸菌體，制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞；
[0009](3)將(I)中pl300_neo載體與(2)中農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，35~40°C保溫至少3min，用LB培養(yǎng)基在25~35°C培養(yǎng)，再用含卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選出重組農(nóng)桿菌并通過PCR確認(rèn)含G418抗性基因；
[0010](4)將處于對數(shù)生長期且OD66tl值為0.6~0.8的活化的重組農(nóng)桿菌菌液與木霉分生孢子懸液混勻并誘導(dǎo)培養(yǎng)，再用含G418的M-100培養(yǎng)基在25~30°C培養(yǎng)并篩選出抗G418的木霉。[0011]該農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法與現(xiàn)有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法的區(qū)別在于以G418的抗性為篩選標(biāo)記。
[0012]其中，
[0013]構(gòu)建pl300_neo載體時用Xba I酶切質(zhì)粒pSM334和載體pl300。
[0014]木霉分生孢子懸液通過將木霉菌株接種于PDA培養(yǎng)基，24~30°C光照培養(yǎng)木霉菌，用無菌生理鹽水洗下木霉分生孢子得到。
[0015]活化的重組農(nóng)桿菌菌液通過將農(nóng)桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)農(nóng)桿菌至OD66tl達(dá)0.6~0.8得到。其中，LB液體培養(yǎng)基中可含卡那霉素和鏈霉素；誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含乙酰丁香酮和葡萄糖。
[0016]步驟(2)中的LB培養(yǎng)基中還可以含有福利平；步驟(4)中M-100培養(yǎng)基中可含頭
孢霉素。
[0017]上述木霉為野生型深綠木霉。
[0018]本發(fā)明的第三個目的是提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系，該體系與現(xiàn)有木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的區(qū)別在于:以從PSM334質(zhì)粒中回收的G418抗性基因與經(jīng)過酶切并去磷酸化的載體pl300連接成的pl300-neo為載體。
[0019]本發(fā)明的優(yōu)點在于:木霉菌具有非常重要的生物工程價值，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。在研究木霉的基因功能時，往往需要對野生木霉進(jìn)行基因敲除實驗，在此基礎(chǔ)上對敲除突變體進(jìn)行基因功能互補(bǔ)驗證實驗。此時，僅僅有一種抗性選擇標(biāo)記不能滿足需要，必須要有新的抗性`選擇標(biāo)記才可以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化子的篩選，但在木霉中除了潮霉素抗性選擇標(biāo)記外一直未找到其他合適的抗生素抗性選擇標(biāo)記。本發(fā)明首次以G418作為木霉的抗性選擇標(biāo)記，并經(jīng)過了嚴(yán)格的實驗論證，為木霉菌增加了一種新的抗性選擇標(biāo)記，這為木霉的基因功能研究帶來了巨大方便。Pl300-neo載體的構(gòu)建，改變了以往G418作為顯性篩選標(biāo)記在木霉菌中一直沒有得到成功和廣泛應(yīng)用的狀況，為木霉菌突變體的篩選和基因功能的研究等遺傳操作提供一個經(jīng)濟(jì)又比較高效的工具。該載體也可以廣泛應(yīng)用于其他絲狀真菌的遺傳研究中去。
[0020]此外，潮霉素價格昂貴，每克價格大約為5000元，而G418的價格大約僅為潮霉素的十分之一，本發(fā)明也表明以G418作為抗性篩選標(biāo)記時，其在PDA培養(yǎng)基中的使用濃度約為25 μ g/mL,遠(yuǎn)低于潮霉素通常250 μ g/mL的使用濃度。因此以G418作為木霉的抗性篩選標(biāo)記可以大大節(jié)約成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1深綠木霉T23對G418的敏感性測試結(jié)果，圖中上排從左到右G418濃度依次為分別為O μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL,下排從左到右G418濃度依次為分別為15 μ g/mL、20 μ g/mL、25 μ g/mL。
[0022]圖2 pl300_neo質(zhì)粒的酶切驗證圖，其中M為DNA Marker ;I為pl300_neo ;2為Xba I 酶切 P1300 ;3 為 EcoR I 酶切 pl300_neo ;4 為 Xba I 酶切 pl300_neo。
[0023]圖3 G418抗性基因分析圖
【具體實施方式】[0024]下面結(jié)合附圖和【專利附圖】

【附圖說明】解釋本發(fā)明的【具體實施方式】
[0025]實施例中涉及的主要材料和試劑來源
[0026]木霉:野生型深綠木霉T23，來源于阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)院。
[0027]質(zhì)粒pl300:將質(zhì)粒pCAMBIA1300中潮霉素抗性基因片段酶切去除改造而成，來源于阜陽師范學(xué)院生命科學(xué)院。
[0028]農(nóng)桿菌:根癌農(nóng)桿菌AGL-1，來源于上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院。
[0029]質(zhì)粒pSM334:來源于中國農(nóng)科院。
[0030]限制性內(nèi)切酶Xba I和EcoR 1:來源于Fermentas生物公司。
[0031]G418:來源于德國MERCK公司。
[0032]實施例中涉及的主要試劑、培養(yǎng)基的配制方法
[0033]誘導(dǎo)培養(yǎng)基:1XMM Salts，10mmol/L葡萄糖，0.5%甘油，濕熱滅菌，冷卻到50°C后,加入40mmol/L4-嗎啉乙磺酸。
[0034]其中IXMM Salts:稱取 KH2P043.625g，K2HP045.125g，NaCl0.375g，MgSO4 7H201.250g, CaCl2.2H200.165g, FeSO4 7H200.0062g, (NH4)2SO4L 250g,加水定容至lOOOmL，稀釋 2.5 倍。
[0035]M-100 培養(yǎng)基:葡萄糖 10g，硝酸鉀(KNO3) 3g，M-100 鹽溶液(Salt Solution)62.5mL，瓊脂粉1.5g，重蒸水定容到lOOOmL，濕熱滅菌，冷卻到50°C左右加入相應(yīng)體積的頭孢霉素和潮霉素母液以達(dá)到所需的終濃度。
[0036]其中M-100鹽溶液(Salt Solution):稱取磷酸二氫鉀(KH2PO4) 16g，硫酸鈉(Na2SO4) 4g，氯化鉀(KCl) 8g，七水合硫酸鎂(MgSO4 7H20) 2g，氯化鈣(CaCl2) lg,M-100 痕量鹽溶液(Trace Element Solution) 8mL,重蒸水定容到1000mL。其中，M-100痕量鹽溶液(Trace Element Solution):稱取亞磷酸(H3PO3) 30mg,四水合氯化猛(MnCl2'4H20) 70mg,氯化鋅(ZnCl2) 200mg，鑰酸鈉(Na2MoO4 2H20) 20mg,六水合氯化鐵(FeCl3 6H20) 50mg,五水硫酸銅(CuSO4 5H20) 200mg，重蒸水定容到 500mL。
[0037]實施例一
[0038]1.G418抗生素在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用
[0039]由于G418抗性選擇基因在木霉上是首次使用，必須進(jìn)行敏感性測試來確定木霉對G418是否敏感，以及篩選培養(yǎng)基中G418的合適使用濃度。結(jié)果表明:隨著PDA培養(yǎng)基中G418濃度的升高，野生木霉生長受到的抑制效果明顯增強(qiáng)，在G418濃度為25 μ g/mL的PDA平板上，野生型深綠木霉T23菌株培養(yǎng)90h未見明顯生長跡象，生長被完全抑制。表明25 μ g/mL的G418濃度能有效地抑制野生型深綠木霉T23的生長，因此可以G418抗生素的抗性為木霉抗性篩選標(biāo)記。為有效地進(jìn)行深綠木霉的遺傳轉(zhuǎn)化篩選，選擇25 μ g/mL的G418濃度作為遺傳轉(zhuǎn)化的篩選濃度。
[0040]2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法
[0041](I)構(gòu)建 pl300_neo 載體
[0042]用Xba I酶切質(zhì)粒PSM334，回收大小約為2.1kb的G418抗性基因片段，與經(jīng)過Xba I酶切，并進(jìn)行去磷酸化的載體pl300連接，構(gòu)建成pl300-neo載體。構(gòu)建成的pl300-neo載體通過EcoR I和Xba I酶切，分別與對照質(zhì)粒pl300相比，發(fā)現(xiàn)酶切后的兩DNA片段大小相差在2kb左右(圖2)，與理論預(yù)期一致，表明大小約為2.1kb的G418抗性基因片段已經(jīng)連接到P1300質(zhì)粒上。
[0043](2)制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
[0044]將根癌農(nóng)桿菌菌株在LB平板上活化，將活化的根癌農(nóng)桿菌菌液接種到含福利平的LB液體培養(yǎng)基，29°C培養(yǎng)至OD6tltl值為0.6，預(yù)冷后離心收集菌體，棄上清，再用預(yù)冷的15mmol/L CaCl2 重懸沉淀。
[0045](3) pl300-neo載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
[0046]將pl300_neo載體加到溶化的根癌農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，混勻；混勻液依次冰浴30min、液氮速凍2min、37°C保溫3min、冰浴2min后，加入LB液體培養(yǎng)基在28°C培養(yǎng)6h后，取菌液涂布于含卡那霉素和利福平的YEB選擇平板上，28°C倒置培養(yǎng)，選擇重組農(nóng)桿菌并通過PCR確認(rèn)含G418抗性基因。
[0047](4)重組農(nóng)桿菌的活化培養(yǎng)
[0048]將重組農(nóng)桿菌菌株接種到含卡那霉素和鏈霉素的LB的液體培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)，再用含乙酰丁香酮和葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基29°C培養(yǎng)至OD66tl達(dá)0.6。
[0049](5)制備深綠木霉分生孢子懸液
[0050]野生型深綠木霉T23接種于馬鈴薯葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基)，28°C光照培養(yǎng)5天，用無菌生理鹽水洗下分生孢子，血球計數(shù)板計數(shù)，調(diào)整分生孢子濃度為IO7個/mL。
[0051](6)農(nóng)桿菌介 導(dǎo)的深綠木霉遺傳轉(zhuǎn)化
[0052]首先將玻璃紙覆蓋在含乙酰丁香酮和葡萄糖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，再混勻活化好的重組農(nóng)桿菌和野生型深綠木霉分生孢子懸液，然后將混勻液涂布到玻璃紙上，25°C黑暗培養(yǎng)2天，將玻璃紙轉(zhuǎn)移到含G418和頭孢霉素的M-100平板上，28°C培養(yǎng)3天，篩選出抗G418的野生型深綠木霉轉(zhuǎn)化子。
[0053]3.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系
[0054]篩選出抗G418的野生型深綠木霉轉(zhuǎn)化子后，再將其轉(zhuǎn)至含有25 μ g/mL的G418的PDA上進(jìn)行二次篩選，然后在PDA上繼代培養(yǎng)7代后，仍能在含25 μ g/mL G418的PDA上正常生長的轉(zhuǎn)化子確認(rèn)為是穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子。
[0055]根據(jù)G418抗性基因序列設(shè)計引物對pl/p2，通過PCR擴(kuò)增來進(jìn)一步鑒定是否為轉(zhuǎn)化子，其中引物對P 1/ρ2分別為，
[0056]P1:ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGC
[0057]p2:TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG
[0058]通過ATMT獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)過連續(xù)多代的繼代后仍能在含G418的抗性平板上生長。經(jīng)PCR檢測，轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)增出G418抗性基因片段(如圖3所示)，表明為陽性轉(zhuǎn)化子。
[0059]因此可以建立一種新的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系，該遺傳轉(zhuǎn)化體系與現(xiàn)有木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系的區(qū)別在于以G418抗生素的抗性為篩選標(biāo)記。
[0060]實施例二
[0061]除以下技術(shù)特征之外，其它技術(shù)特征均與實施例1相同。
[0062](2)中活化的農(nóng)桿菌菌液接種到含福利平的LB液體培養(yǎng)基，29°C培養(yǎng)至0D_值為
0.3,預(yù)冷后離心收集菌體,棄上清,再用預(yù)冷的20mmol/L CaCl2重懸沉淀。
[0063](3)中pl300-neo載體和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻液35°C保溫4min ;加入LB液體培養(yǎng)基中后在25°C培養(yǎng)4h后，取菌液涂布于含卡那霉素和利福平的YEB選擇平板上。[0064](4)中重組農(nóng)桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD66tl達(dá)0.8。
[0065](6)中玻璃紙轉(zhuǎn)移到含G418和頭孢霉素的M-100平板上，25°C培養(yǎng)7天，并篩選出抗G418的野生型深綠木霉轉(zhuǎn)化子。
[0066]實施例2
[0067]除以下技術(shù)特征之外，其它技術(shù)特征均與實施例1相同。
[0068](2)中活化的根癌農(nóng)桿菌菌液接種到含福利平的LB液體培養(yǎng)基，29°C培養(yǎng)至0D_值為0.5，預(yù)冷后離心收集菌體，棄上清，再用預(yù)冷的25mmol/L CaCl2重懸沉淀。
[0069](3)中pl300_neo載體和農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻液40°C保溫5min ;加入LB液體培養(yǎng)基中后在35°C培養(yǎng)5h后，取菌液涂布于含G418的YEB選擇平板上。
[0070](4)中重組農(nóng)桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，用誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD66tl達(dá)0.7。
[0071](6)中玻璃紙轉(zhuǎn)移到含G418和頭孢霉素的M-100平板上，30°C培養(yǎng)7天，并篩選出抗G418的野生型深綠木霉轉(zhuǎn) 化子。
【權(quán)利要求】
1.一種G418在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征是:以G418的抗性為木霉抗性篩選標(biāo)記。
2.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，包括 (1)將篩選標(biāo)記基因與經(jīng)過酶切并去磷酸化的載體P1300連接，構(gòu)建成pl300-neo載體； (2)將農(nóng)桿菌用LB培養(yǎng)基活化并培養(yǎng)至0D_值為0.3~0.6，收集菌體，并用15~25mmol/L CaCl2重懸所述菌體，制備農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞； (3)將步驟(1)中所述pl300-neo載體與步驟(2)所述農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞混勻，在35~40°C保溫至少3min，再用LB培養(yǎng)基在25~35°C培養(yǎng)后，然后用含卡那霉素和利福平的YEB培養(yǎng)基培養(yǎng)并篩選出重組農(nóng)桿菌并通過PCR確定含篩選標(biāo)記基因； (4)將處于對數(shù)生長期且OD66tl值為0.6~0.8的活化的所述重組農(nóng)桿菌菌液與木霉的分生孢子懸液混勻并誘導(dǎo)培養(yǎng)，再用M-100培養(yǎng)基在25~30°C培養(yǎng)并篩選出帶有篩選標(biāo)記基因的木霉， 其特征在于:所述篩選標(biāo)記為G418抗性，所述篩選標(biāo)記基因為從pSM334質(zhì)粒中回收的G418抗性基因。
3.如權(quán)利要求2所述的農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述木霉分生孢子懸液是通過將木霉接種到PDA培養(yǎng)基，24~30°C光照培養(yǎng)木霉菌，再用無菌生理鹽水洗下木霉分生孢子得到。
4.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述活化的重組農(nóng)桿菌菌液是將所述目的農(nóng)桿菌菌株接種到LB液體培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)，再用誘導(dǎo)培養(yǎng)基29°C培養(yǎng)至OD660達(dá)0.6~0.8得到。
5.如權(quán)利要求4所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含乙酰丁香酮和葡萄糖和/或所述LB液體培養(yǎng)基中含卡那霉素和鏈霉素。
6.如權(quán)利要求2所述的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化方法，其特征在于:所述步驟(2)中的LB培養(yǎng)基中含有福利平和/或所述步驟(4)中M-100培養(yǎng)基中含頭孢霉素。
7.一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)的木霉遺傳轉(zhuǎn)化體系，其特征是:以從PSM334質(zhì)粒中回收的G418抗性基因與經(jīng)過酶切并去磷酸化的載體P1300連接成的pl300-neo為載體。
【文檔編號】C12N15/80GK103820487SQ201310611921
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】唐俊, 陳捷, 馬越, 張雷 申請人:阜陽師范學(xué)院