擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt75d1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用；其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。所述生長(zhǎng)素是指吲哚丁酸（IBA）、吲哚丙酸（IPA）或萘乙酸（NAA）。將糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1與所述生長(zhǎng)素任一種放于反應(yīng)管中進(jìn)行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的生長(zhǎng)素糖酯。本發(fā)明的公開(kāi)為利用一種新的酶高效、專(zhuān)一性地合成這些生長(zhǎng)素物質(zhì)的糖酯提供了可行的方法，本發(fā)明實(shí)施后將為生長(zhǎng)素糖酯合成工業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益。
【專(zhuān)利說(shuō)明】擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用；屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】[0002]生長(zhǎng)素是植物的重要激素之一，它對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)控制作用。天然存在的生長(zhǎng)素如吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)以及人工合成的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)如2，4- 二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)等都被廣泛應(yīng)用在科研和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。這些生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)都含有一個(gè)羧基基團(tuán)(-C00H)。在植物體內(nèi)，該羧基上的羥基可與葡萄糖以共價(jià)鍵結(jié)合，從而形成生長(zhǎng)素的糖酯。生長(zhǎng)素的糖酯被認(rèn)為是生長(zhǎng)素的失活形式和貯藏形式(Bartel, 1997)。當(dāng)前，生長(zhǎng)素的糖酯常作為標(biāo)準(zhǔn)品被用在生長(zhǎng)素糖基化修飾等科學(xué)研究中。在化學(xué)和生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)，獲得生長(zhǎng)素糖酯的途徑主要有兩種:從植物中提取和化學(xué)合成。由于在植物中生長(zhǎng)素糖酯的天然含量很低，提取量非常有限，純度難以保證，并且提取過(guò)程復(fù)雜。如果用化學(xué)方法合成，也有過(guò)程復(fù)雜、成本高、環(huán)境污染等缺點(diǎn)。相比之下，生物酶法合成生長(zhǎng)素糖酯化合物則具有效率高、成本低、環(huán)境清潔等優(yōu)點(diǎn)。
[0003]糖基轉(zhuǎn)移酶是專(zhuān)門(mén)負(fù)責(zé)將化合物進(jìn)行糖基化修飾而形成相應(yīng)的糖酯(或糖酯)的一類(lèi)酶。通常來(lái)講，糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)它所催化的底物具有專(zhuān)一性。糖基化修飾過(guò)程在生物體內(nèi)的作用是維持細(xì)胞代謝平衡、維持生物的正常生長(zhǎng)發(fā)育以及有效應(yīng)對(duì)環(huán)境壓力(Lim etal, 2004 ;王軍等，2009)。在合成工業(yè)的實(shí)際應(yīng)用中，糖基轉(zhuǎn)移酶可以通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵、固相酶催化等方法特異性地合成某些化合物的糖酯或糖酯，因此用糖基轉(zhuǎn)移酶作為催化劑在化學(xué)合成工業(yè)上將具有重大應(yīng)用潛力(Lim，2005)。
[0004]在相關(guān)研究中， 申請(qǐng)人:首次發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1對(duì)生長(zhǎng)素類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的催化活性，能夠催化生長(zhǎng)素類(lèi)轉(zhuǎn)變成它們對(duì)應(yīng)的糖酯。經(jīng)過(guò)檢索，目前尚未發(fā)現(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005](I)本發(fā)明的目的
[0006]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用。
[0007](2)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的具體技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用。
[0009]其中:
[0010]所述糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。該糖基轉(zhuǎn)移酶是通過(guò)糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1在大腸桿菌中表達(dá)和純化后獲得的。其擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，該糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1是通過(guò)RT-PCR方法從擬南芥中克隆的。
[0011]上述生長(zhǎng)素是指吲哚丁酸(IBA)、吲哚丙酸(IPA)或萘乙酸(NAA)。
[0012]本發(fā)明提供新的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1能夠催化多種生長(zhǎng)素物質(zhì)形成糖酯。
[0013]將糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1與生長(zhǎng)素之一放于反應(yīng)管中，按實(shí)施例2中所指出的條件進(jìn)行酶促反應(yīng)，即可催化合成相應(yīng)的生長(zhǎng)素糖酯。
[0014](3)本發(fā)明實(shí)施后可能帶來(lái)的有益效果
[0015]本發(fā)明是在國(guó)內(nèi)外首次提出擬南芥的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1可以催化多種生長(zhǎng)素化合物生成其糖酯物質(zhì)。本發(fā)明的公開(kāi)為體外利用酶催化方法合成這些生長(zhǎng)素物質(zhì)的糖酯物提供了可行的方法。用提取方法或化學(xué)合成方法獲得生長(zhǎng)素糖酯物不僅效率低，而且缺乏專(zhuān)一性。而用糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1催化方法則可以高效、專(zhuān)一性的合成吲哚丁酸、吲哚丙酸、萘乙酸等相對(duì)應(yīng)的的糖酯(見(jiàn)附圖1至附圖5)。本發(fā)明實(shí)施后將為生長(zhǎng)素糖酯合成工業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)效益。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1.純化的融合蛋白GST-UGT75D1用SDS-PAGE檢測(cè)。
[0017]其中，M為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；75D1為純化的GST-UGT75D1融合蛋白，其中有表達(dá)的GST帶，是一種在pGEX純化系統(tǒng)中比較常見(jiàn)的現(xiàn)象；GST為GST標(biāo)簽蛋白，作為對(duì)照。
[0018]圖2.純化后的融合蛋白GST-UGT75D1催化吲哚丁酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。
[0019]其中I為對(duì)照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無(wú)糖酯合成；2為實(shí)驗(yàn)組，純化的GST-UGT75D1融合蛋白與吲哚丁酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對(duì)照反應(yīng)體系多出一個(gè)明顯的產(chǎn)物峰(箭頭b所指)，該產(chǎn)物被推測(cè)為吲哚乙酸糖酯。圖中的a為底物吲哚丁酸。
[0020]圖3.吲哚丁酸的催化產(chǎn)物用質(zhì)譜(LC-MS)鑒定。
[0021]其中上圖表示吲哚丁酸糖酯的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，下圖表示吲哚丁酸的催化產(chǎn)物的質(zhì)譜圖。兩圖特征峰相同，證明吲哚丁酸在酶的催化下形成了糖酯。
[0022]圖4.純化后的融合蛋白GST-UGT75D1催化吲哚丙酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。
[0023]其中I為對(duì)照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無(wú)糖酯合成；2為實(shí)驗(yàn)組，純化的GST-UGT75D1融合蛋白與吲哚丙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對(duì)照反應(yīng)體系多出一個(gè)明顯的產(chǎn)物峰(箭頭c所指)，該產(chǎn)物即為吲哚丙酸糖酯。
[0024]圖5.純化后的融合蛋白GST-UGT75D1催化萘乙酸形成糖酯，催化產(chǎn)物用高效液相色譜(HPLC)分析。
[0025]其中I為對(duì)照組，純化的GST標(biāo)簽蛋白與萘乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，無(wú)糖酯合成；2為實(shí)驗(yàn)組，純化的GST-UGT75D1融合蛋白與萘乙酸和UDP-葡萄糖的反應(yīng)體系，比只含有GST標(biāo)簽蛋白的對(duì)照反應(yīng)體系多出一個(gè)明顯的產(chǎn)物峰(箭頭d所指)，該產(chǎn)物即為
萘乙酸糖酯。
【具體實(shí)施方式】[0026]實(shí)施例1擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT7OT1的克隆、原核表達(dá)與酶蛋白純化
[0027]1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT7OT1的克隆
[0028]本發(fā)明涉及的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1是通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增技術(shù)從擬南芥中克隆的。首先利用TRIzoI方法從擬南芥幼嫩葉片提取RNA，然后用RT-PCR方法擴(kuò)增得到該基因的編碼區(qū)cDNA。擴(kuò)增時(shí)用的一對(duì)引物是:
[0029]UGT75Dl-a:5， -CAGGATCATGGCCAACAACAATTCCAACT，；
[0030]UGT75Dl-b:5’ -GCGTCGACTCACATGTGCTCATCGACAAAAG-3’。
[0031]RT-PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94°C (預(yù)變性)，5min ;94°C (變性)，IOs ;55 °C (退火)，15s ;72°C (延伸)，2min ;35cycle ;72°C (終延伸)，lOmin?；厥詹⒓兓瘮U(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增獲得的目的基因UGT75D1與EcoRV單酶切的中間載體pBluescript SK連接，獲得載體pB75Dl，對(duì)克隆到的基因進(jìn)行測(cè)序。
[0032]2.UGT75D1的序列信息與特性
[0033]對(duì)克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，該基因的cDNA編碼區(qū)長(zhǎng)度為1425bp，編碼474個(gè)氨基酸，編碼的蛋白質(zhì)分子量為53.9KD，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。其C端有一個(gè)含44個(gè)氨基酸的PSPG盒，該盒是催化小分子化合物的糖基轉(zhuǎn)移酶共同具有的保守序列，說(shuō)明克隆的基因是擬南芥的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
[0034]3.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1的原核表達(dá)載體構(gòu)建
[0035]在公開(kāi)通用的原核表達(dá)載體PGEX-2T的基礎(chǔ)上，按照《分子克隆》(Sambrook等編著)所示的方法，對(duì)該載體進(jìn)行改造，使其多克隆位點(diǎn)包含BamHI和Sail。用BamHI和SalI雙酶切該表達(dá)載體，回收載體片段備用。同時(shí)用BamHI和SalI雙酶切前述載體pB75Dl，回收得到目的基因片段，并將其連入上`述原核表達(dá)載體中，得到擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT7OT1的原核表達(dá)載體PGEX-75D1。
[0036]4.轉(zhuǎn)化大腸桿菌、誘導(dǎo)蛋白表達(dá)及酶蛋白的純化
[0037]將上述原核表達(dá)載體pGEX-75Dl轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株XLl_Blue，PCR和酶切驗(yàn)證正確后，保存菌種，此菌種用于融合蛋白(GST-UGT7OT1)的表達(dá)純化。
[0038]在添加了氨芐青霉素(100mg/L)的2XYT液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)上述菌種，以活化該菌種。然后將過(guò)夜培養(yǎng)物按照1:100 (過(guò)夜培養(yǎng)物:新的2XYT液體培養(yǎng)基)的比例擴(kuò)大至75ml培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl=0.8。然后加入IPTG至0.2mM，轉(zhuǎn)到20°C震蕩培養(yǎng)24h以誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。到時(shí)間后通過(guò)離心收集菌體。
[0039]菌體加入2ml Blast Buffer (0.5mM EDTA，750mM 蔗糖，200mM Tris_HCl，pH=8.0)重懸,立即加入14ml稀釋的(1/2 X )Blast Buffer (事先添加2mg溶菌酶),混勻后于冰上放置30min，離心收集菌體，用PBS(內(nèi)含0.2mM的PMSF)重懸，冰上放置30min后1000Orpm離心20min，取上清。在上清中加入100 μ I的谷胱甘肽瓊脂糖珠子，按照pGEX蛋白純化手冊(cè)操作，最后用Elution Buffer (50mM Tris-HCl，IOmM還原型谷胱甘肽，pH=8.0)洗脫目的蛋白。目的蛋白的純度用SDS-PAGE方法檢測(cè)，蛋白濃度按照Bradford試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法進(jìn)行測(cè)定(用BSA作為蛋白標(biāo)準(zhǔn))。
[0040]實(shí)施例2擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1催化生長(zhǎng)素糖酯的合成
[0041]1.生長(zhǎng)素的酶催化反應(yīng)
[0042]用純化到的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT7? I的融合蛋白(GST-UGT75DI，能夠反映UGT75D1的催化活性，屬于常用的做法)進(jìn)行體外的酶催化反應(yīng)，選取6種生長(zhǎng)素化合物作為底物，包括吲哚丙酸(IPA)、吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)。催化反應(yīng)中用UDP-葡萄糖作
為糖的供體。酶促反應(yīng)體系如下:
[0043]
【權(quán)利要求】
1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT75D1在催化合成生長(zhǎng)素糖酯中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT7OT1的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，其擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT75D1的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述生長(zhǎng)素是吲哚丁酸(IBA)、吲哚丙酸(!PA)或萘乙酸(NAA)。
【文檔編號(hào)】C12P19/58GK103614436SQ201310612101
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】侯丙凱, 張桂芝 申請(qǐng)人:山東大學(xué)