一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和液體發(fā)酵生物量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生產(chǎn)技術生物制藥，具體說是一種提高茯苓菌絲體蛋白產(chǎn)量和液體發(fā)酵生物量的方法。該方法包括步驟：（1）茯苓擔孢子懸浮液制備；（2）Co60–γ輻射誘變茯苓擔孢子；（3）擔孢菌株配對；（4）接種馬尾松浸液固體培養(yǎng)基斜面，該培養(yǎng)基由馬尾松提取物、馬鈴薯提取物、葡萄糖組成；（5）接種馬尾松提取物液體發(fā)酵培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基由馬尾松提取物、微晶纖維、葡萄糖、甘油、硫酸銨、硫酸鎂、氫氧化鉀、磷酸組成。本發(fā)明首次經(jīng)誘變獲得了菌絲蛋白含量高的茯苓菌株；采用的馬尾松浸液固體培養(yǎng)基斜面較馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基更有利于茯苓菌絲快速生長；采用的馬尾松液體發(fā)酵培養(yǎng)基更有利于獲得較高的生物量。
【專利說明】一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和液體發(fā)酵生物量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬生產(chǎn)技術生物制藥領域，主要是一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和液體發(fā)酵生物量的方法。
【背景技術】
[0002]茯苓屬藥用真菌，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材和歷史悠久的食品。味甘、淡、平，具有利水滲濕、健脾補中、寧心安神等功效，并具有抗菌、抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗病毒等作用。茯苓菌絲體蛋白含量影響其生長速度，提高茯苓菌絲體蛋白含量能促進菌絲生長速度，而液體深層發(fā)酵技術是獲得茯苓主要藥理活性物質的重要途徑，但是茯苓菌絲生長速度慢，發(fā)酵后產(chǎn)生的生物量少，影響菌絲體中活性物質的產(chǎn)量，與茯苓的大量需要不相符。目前對茯苓的研究集中在茯苓多糖方面，尚未有提高茯苓菌絲體蛋白含量高和液體發(fā)酵生物量方面的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是提供一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和液體發(fā)酵生物量的方法，解決目前茯苓菌絲體蛋白含量低，生長速度慢，生物量低的問題。
[0004]本發(fā)明的目的實現(xiàn)途徑是:收集茯苓孢子，經(jīng)Co60 - Y輻射誘變，進行擔孢菌株配對，得到菌絲體蛋白含量高，生長快的菌株，將該菌株接種于含馬尾松浸液的PDA培養(yǎng)基上，獲得菌塊，將菌塊接種于馬尾松浸液發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C~29°C，80~120 r/min搖床培養(yǎng)5~7天，獲得生物量；
主要包括以下步驟:· (1)收集茯苓擔孢子:用無菌生理鹽水調制孢子濃度為IO4~IO6個/ml，經(jīng)輻射劑量為300Gy~900Gy的Co60 - Y福射誘變獲茶擔孢子；
(2)配對:將誘變茯苓擔孢子懸浮液稀釋10~100倍，于含馬尾松浸液馬鈴薯培養(yǎng)平板中，26~28°C培養(yǎng)5~6天，將不同菌絲兩兩接在同一 PDA培養(yǎng)平板中央，26~28 V培養(yǎng)4~6天，菌絲融為一體，取生長較快的組合，得到誘變菌株；
(3)將誘變的茯苓菌株接種在含馬尾松浸液PDA培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基組成為馬尾松浸液1.0%~4.0%,馬鈴薯水煮液15%~20%，葡萄糖0.8%~1.2%,瓊脂1.5%~2.0%, 25°C~29°C培養(yǎng)5~7天；
(4)菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng):接種誘變菌株的菌塊于馬尾松浸液液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成為馬尾松浸液1.0%~4.0%，微晶纖維0.8%~3.5%，葡萄糖1.0%~3.5%，甘油0.01%~0.05%,硫酸銨0.1%~0.4%,硫酸鎂0.1%~0.3%,氫氧化鉀0.02%~0.06%,磷酸
0.02% ~0.05%, pH 5.5，25°C ~29°C，80 ~120 r/min 搖床培養(yǎng) 5 ~7 天；
(5)分離生物量:發(fā)酵液8XIO4 Pa真空抽濾10 min，無菌水洗滌2~3次收集菌體，60°C烘干至恒重；
(6)菌絲體蛋白含量測定:按照GB5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法測定茯苓菌絲體中蛋白含量；
(7)菌株保藏:誘變菌株保藏于石蠟油中或砂土管中，4°C保存，每一年傳代一次；
本發(fā)明采用Co60 - Y輻射誘變茯苓孢子，進行擔孢菌株配對，獲得了菌絲體蛋白含量高的菌株，經(jīng)過通過馬尾松浸液液體發(fā)酵后，解決現(xiàn)有技術中茯苓菌絲體蛋白含量低、生長速度慢、生物量低的問題，達到了本發(fā)明的目的:
(1)本發(fā)明首次經(jīng)過誘變獲得了菌絲體蛋白含量高、生長速度快的茯苓菌株；
(2)采用的含馬尾松浸液的PDA培養(yǎng)基較馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基更有利于茯苓菌絲體的快速生長；
(3)采用的馬尾松浸液液體發(fā)酵培養(yǎng)基更有利于獲得較高的生物量。
【具體實施方式】
[0005]下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明:
實施例1:
1.菌種lporiacocos)菌核，購自湖南靖州茯苓市場，編號為:湘靖“28”；
2.固體培養(yǎng)基組成為:馬尾松浸液1.0%~4.0%，馬鈴薯水煮液15%~20%，葡萄糖
0.8 ~1.2%,瓊月旨 1.5% ~2.0% ；
3.液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成:馬尾松浸液1.0%~4.0%，微晶纖維0.8%~3.5%，葡萄糖
1.0%~3.5%,甘油0.01%~0.05%,硫酸銨0.1%~0.4%,硫酸鎂0.1%~0.3%,氫氧化鉀0.02% ~0.06%,磷酸 0.02% ~0.05%, pH 5.5 ；
4.菌株誘變與液體發(fā)酵培養(yǎng):將近成熟的茯苓菌核洗凈，在裂紋處表面劃出長3.0 cm,寬1.5 cm，深1.0 cm的開口，于濕度為90%，溫度為26°C下培養(yǎng)15天，傷口處長出的菌絲體扭結形成蜂窩狀子實體后，將溫度調至28°C，干燥環(huán)境中收集孢子。用無菌生理鹽水調制孢子濃度為104~106個/ml，經(jīng)輻射劑量為300 Gray, 600 Gray和900 Gray的Co60 - y輻射誘變茯苓擔孢子。將誘變茯苓擔孢子懸浮液分別稀釋10，100，1000倍，于固體培養(yǎng)平板中，27°C培養(yǎng)7天，將不同菌絲兩兩接在同一固體培養(yǎng)平板中央，26°C培養(yǎng)5天，菌絲融為一體，取生長較快的組合，得到誘變菌株。將誘變菌株接種于固體培養(yǎng)基斜面中，26°C培養(yǎng)7天，取斜面菌塊接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，27°C，100 r/min搖床培養(yǎng)7天，發(fā)酵液8 X IO4Pa真空抽濾10 min,無菌水洗漆2~3次收集菌體,60°C烘干至恒重；
5.菌絲體蛋白檢測:茯苓菌絲體蛋白含量按照GB5009.5-2010《食品中蛋白質的測定》中的第一法凱氏定氮法測定；
結果表明，茯苓誘變菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)后，獲得生物量為1.2~1.5(干g/100ml)，較采用普通液體發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的原發(fā)菌株提高了 15%~30%。茯苓誘變菌株經(jīng)液體發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體蛋白含量為1.96%，同條件下原發(fā)菌株菌絲體蛋白含量為1.48%，誘變菌株較原發(fā)菌株菌絲體蛋白含量提高了 32.43% ;茯苓誘變菌株經(jīng)不含馬尾松浸液的液體發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體蛋白含量為1.89%，同條件下原發(fā)菌株菌絲體蛋白含量為1.15%，誘變菌株較原發(fā)菌株菌絲體蛋白含量提高了 64.34%。
【權利要求】
1.一種提高茯苓菌絲蛋白含量和液體發(fā)酵生物量的方法，其特征在于具體操作步驟如下: (1)收集茯苓擔孢子，用無菌生理鹽水調制孢子濃度為IO4~IO6個/ml，經(jīng)輻射劑量為300Gray~900 Gray的C06O - Y福射誘變獲茶擔孢子； (2)將誘變茯苓擔孢子懸浮液稀釋10~100倍，于固體培養(yǎng)基平板中，26~28°C培養(yǎng)5~6天，將不同菌絲兩兩接在同一固體培養(yǎng)基平板中央，26~28°C培養(yǎng)4~6天，菌絲融為一體，取生長較快的組合，得到誘變菌株； (3)將誘變的茯苓菌株接種在固體培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基組成為馬尾松浸液1.0%~4.0%,馬鈴薯水煮液15%~20%，葡萄糖0.8%~1.2%,瓊脂1.5%~2.0%, 25°C~29°C培養(yǎng)5~7天； (4)接種誘變菌株的菌塊于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基組成為馬尾松浸液1.0%~4.0%，微晶纖維0.8%~3.5%,葡萄糖1.0%~3.5%,甘油0.01%~0.05%,硫酸銨0.1%~0.4%,硫酸鎂0.1%~0.3%,氫氧化鉀0.02%~0.06%,磷酸0.02%~0.05%,水96.25%~87.16%, pH 5.5，25°C~29°C，80 ~120 r/min 搖床培養(yǎng) 5 ~7 天； (5)發(fā)酵液8X104Pa真空抽濾10 min，無菌水洗滌2~3次收集菌體，60°C烘干至恒重； (6)誘變菌株保藏于石蠟油中或砂土管中，4°C保存，每一年傳代一次。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和一體發(fā)酵生物量的方法，其特征在于經(jīng)福射劑量為300`Gray~900 Gray的Co60 - Y福射誘變獲茶擔孢子。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種提高茯苓菌絲體蛋白含量和一體發(fā)酵生物量的方法，其特征在其培養(yǎng)基組分為: (1)馬尾松浸液的PDA培養(yǎng)基:馬尾松浸液1.0%~4.0%，馬鈴薯水煮液15%~20%，葡萄糖0.8~1.2%,瓊脂1.5%~2.0% ； (2)馬尾松浸液液體發(fā)酵培養(yǎng)基:馬尾松浸液1.0%~4.0%，微晶纖維0.8%~3.5%，葡萄糖1.0%~3.5%,甘油0.01%~0.05%,硫酸銨0.1%~0.4%,硫酸鎂0.1%~0.3%,氫氧化鉀 0.02% ~0.06%,磷酸 0.02% ~0.05%, pH 5.5。
【文檔編號】C12N13/00GK103627695SQ201310612653
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權日:2013年11月28日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請人:懷化學院