定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針及其應(yīng)用，引物的核苷酸序列為序列表中序列3和序列4；探針的核苷酸序列為序列表中序列5。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明提供的肺炎克雷伯氏菌特異性引物和探針序列，可用于對肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行定性、定量檢測，通過提取待檢測樣品中的DNA，再結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中肺炎克雷伯氏菌DNA含量的目的，可用于食品檢測、科研及臨床診斷，針對于食品樣品、患者咽拭子、鼻咽分泌物、人痰液標(biāo)本、血樣等樣品中肺炎克雷伯氏菌DNA進(jìn)行定性、定量分析，對判斷肺炎克雷伯氏菌感染的發(fā)生、治療效果評價以及病情的動態(tài)觀察具有重要意義，同時將在臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
【專利說明】定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)屬于革蘭氏陰性腸桿菌科(Enterobacteraceae)克雷伯氏菌(Klebsiella)屬，分3個亞種:肺炎亞種(subsp.pneumoniae)、鼻炎亞種(subsp.azaenae)和鼻硬結(jié)亞種(subsp.rhinoscleromatis)。廣泛分布與自然界，是人和動物腸道、呼吸道的條件致病菌，當(dāng)機(jī)體免疫力降低或長期大量使用抗生素導(dǎo)致菌群失調(diào)時引起感染，可引起肺炎、支氣管炎、敗血癥、腦膜炎、肝膿腫、眼內(nèi)炎、泌尿系統(tǒng)發(fā)炎，或是傷口感染等，若治療不當(dāng)則死亡率極高，目前是除大腸桿菌外的醫(yī)源性感染最重要的條件致病菌。
[0003]目前，國內(nèi)食品衛(wèi)生微生物檢驗的方法主要采用國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN/T)，該類標(biāo)準(zhǔn)主要由傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、鏡檢觀察、生化鑒定等實(shí)驗組成，操作步驟繁雜，工作量大，從培養(yǎng)到生化鑒定耗時5-8天，同時檢測精準(zhǔn)度低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測的要求。臨床檢測需要痰培養(yǎng)或血培養(yǎng)等檢測，檢測周期長，不能滿足治療的需求。常規(guī)PCR技術(shù)目前存在操作繁瑣、易交叉污染導(dǎo)致假陽性等缺點(diǎn)。免疫學(xué)檢測技術(shù)具有以實(shí)現(xiàn)快速簡便低成本等優(yōu)勢，但是要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，目前存在特異性差、靈敏度低等準(zhǔn)確性不高等缺點(diǎn)，只 能作為輔助檢測手段。近些年興起的環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增技術(shù)具有操作簡便、快捷、靈敏度高、不依賴昂貴設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，非常適合基層實(shí)驗室使用，但是存在著引物設(shè)計困難、準(zhǔn)確性和敏感性差、假陽性率偏高等缺點(diǎn)，市場不成熟。
[0004]實(shí)時突光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技術(shù)從常規(guī)PCR定性檢測邁上量化的臺階，它相對常規(guī)PCR技術(shù)先進(jìn)、操作簡便、利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)實(shí)時監(jiān)測、絕對定量和快速檢測的目的，同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，相對于普通PCR耗時更少，只需2小時即可完成全部檢測，近幾年實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)已在各大醫(yī)院、檢測機(jī)構(gòu)、科研部門得到了很好的推廣和實(shí)用，因此非常適合臨床檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，提供了一組肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)特異性引物和探針序列，建立一種能廣泛應(yīng)用于臨床的快速、靈敏、特異性好的用熒光定量PCR檢測方法。
[0006]本發(fā)明采用基因克隆技術(shù)，將肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段插入到載體pMD18_T中，獲得含有RecA基因片段的重組質(zhì)粒，以此作為標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)肺炎克雷伯氏菌RecA基因片段設(shè)計并合成一組特異性引物和探針，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立以實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)為平臺的檢測方法，并對所建立的方法進(jìn)行有效性評估試驗。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為:一對用于肺炎克雷伯氏菌RecA基因保守片段序列的引物，所述引物的核苷酸序列為序列表中序列I和序列2，稱其為外圍引物，用于標(biāo)準(zhǔn)品的制備，所述外圍引物為:上游引物為5’ -TTCTTCTGCGTCGTTGCC-3’，下游引物為5’ -GCTGGCGGGTAACCTGAA-3’，采用該引物以肺炎克雷伯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌(ATCC4352)的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物為499bp。
[0008]本發(fā)明的第二個目的是提供了一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針，所述引物的核苷酸序列為序列表中序列3和序列4 ;所述探針的核苷酸序列為序列表中序列5。探針為Taqman探針，該組引物和探針是根據(jù)上述RecA基因保守片段設(shè)計，其中上游引物為 5’ -1TCTTCTGCGTCGITGCC-3’，下游引物為 5’ -GCGATCACCTGGCTGAAAG-3’，探針為 5’-TCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGA-3’。
[0009]本發(fā)明的第三個目的是提供了一組如上所述的用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針的衍生序列，所述引物的衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一至數(shù)個堿基得到的序列；所述探針的衍生序列包括探針5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA、DABCYL 或 BHQ。
[0010]本發(fā)明的第四個目的是提供了一種用于檢測肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，包括上述引物和探針。
[0011]本發(fā)明的第五個目的是提供了上述的一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針在定量檢測肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明的第六個目的是提供了上述的一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針的衍生序列在定量檢測 肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的第七個目的是提供了上述的一種用于檢測肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒在定量檢測肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
[0014]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供的一組肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)特異性引物和探針序列，可用于對肺炎克雷伯氏菌進(jìn)行定性、定量檢測，通過提取待檢測樣品中的DNA，再結(jié)合實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可達(dá)到準(zhǔn)確定量待測標(biāo)本中肺炎克雷伯氏菌DNA含量的目的，可用于食品檢測、科研及臨床診斷，針對于食品樣品、患者咽拭子、鼻咽分泌物、人痰液標(biāo)本、血樣等樣品中肺炎克雷伯氏菌DNA進(jìn)行定性、定量分析，對判斷肺炎克雷伯氏菌感染的發(fā)生、治療效果評價以及病情的動態(tài)觀察具有重要意義，同時將在臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為靈敏度實(shí)驗結(jié)果。
[0016]其中A12-A19 對應(yīng)質(zhì)粒濃度分別為 1.00X 108copies/ml、l.0OX 107copies/ml、
[0017]1.0OX I 06cop ies/ml>l.00 X 105copies/ml、l.0OX I 04cop i e s/ml >
1.00 X 103copies/ml、
[0018]1.0OX 102copies/ml、陰性對照。
[0019]圖2為特異性實(shí)驗結(jié)果。
[0020]其中A4-A17分別為:大腸埃希菌、奇異變形桿菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、淋病奈瑟菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、乙型溶血性鏈球菌、鼠傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、福氏志賀菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎克雷伯氏菌、陰性對照?！揪唧w實(shí)施方式】
[0021]下述實(shí)驗例中所用方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成和完成。
[0022]實(shí)施例1:
[0023]RecA基因序列標(biāo)準(zhǔn)品的制備:
[0024]為建立實(shí)時熒光定量PCR方法，要先制備方法所需的外部標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)包含高度保守、特異的序列，要保證反應(yīng)的高特異性。本發(fā)明采用肺炎克雷伯氏菌RecA基因序列保守區(qū)作為靶序列。主要采用PCR技術(shù)擴(kuò)增肺炎克雷伯氏菌RecA基因序列，利用基因重組技術(shù)將其連接到質(zhì)粒載體PMD18-T中，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pMD18-T-KpRecA，并進(jìn)行相應(yīng)的PCR鑒定和測序鑒定，最后經(jīng)定量作為待建立方法的標(biāo)準(zhǔn)品，為下一步的方法及評估奠定基礎(chǔ)。
[0025]一、模板DNA的制備:
[0026]1、提取肺炎克雷伯氏菌基因組DNA，用作PCR擴(kuò)增的模板:
[0027]吸取500 ill培養(yǎng)的肺炎克雷伯氏菌(編號ATCC 10031)菌液加入到1.5ml離心管中1000Orpm離心I分鐘，取上清，加入200 U I滅菌的TE buffer，震蕩懸浮，然后放入到沸水浴鍋中煮沸10分鐘后，迅速置于冰上放置5分鐘，1000Orpm離心3分鐘，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中_20°C保存。
[0028]二、ITS序列片段的PCR擴(kuò)增:
[0029]1、引物的設(shè)計與合成:
[0030]本發(fā)明通過對NCBI數(shù)據(jù)庫中肺炎克雷伯氏菌RecA基因全序列進(jìn)行生物信息學(xué)比對分析，選取適合設(shè)計引物和探針的保守片段序列為祀目標(biāo)，應(yīng)用Primer express3軟件、Primer Premier6軟件以及01igo7軟件,設(shè)計了一組實(shí)時突光定量PCR引物和探針以及一組相關(guān)序列的外圍引物。
[0031]本發(fā)明選取的擴(kuò)增序列如下:
[0032]5， -TTCTTCTGCGTCGTTGCCGTCAACAACGAAGTCTGGCTTCGCATCCTGATTGTTGAGCAGCAGTTCGCGCACTTTCTTCTCAATCTCTTTCGCCGCCGCCGGGTTCTCTTTCAGCCAGGTGATCGCGTTCGCTTTACCCTGACCGATTTTGTCGCCGTTGTAGCTATACCAGGCACCCGCTTTCTCAATCAGCTTCTCTTTTACGCCGAGGTCTACCAGCTCGCCGTAGAAGTTGATGCCTTCGCCGTAGAGGATCTGGAATTCGGCCTGTTTAAACGGCGCGGCGATCTTGTTTTTCACCACTTTGACGCGGGTTTCGCTGCCGACGACATTGTCGCCCTCTTTCACCGCGCCGATGCGGCGAATGTCCAGACGCACAGAGGCGTAGAACTTCAGCGCGTTACCACCGGTAGTGGTTTCCGGGTTACCGAACATCACGCCAATTTTCATACGGATCTGGTTGATAAAGATCAGCAGCGTGTTGGACTGCTTCAGGTTACCCGCCAGC-3，。
[0033]該外圍引物序列如下:
[0034]上游引物:KprecA19F:5，-1TCTTCTGCGTCGITGCC-3，；
[0035]下游引物:kprecA527R:5，-GCTGGCGGGTAACCTGAA-3’ ；
[0036]擴(kuò)增片段大小為:508bp。
[0037]2、PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件:
[0038]以提取得到的DNA溶液為模板，上述外圍引物KpreCA19F/kpreCA527R為擴(kuò)增引物，采用下述體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增。[0039]PCR體系如表1所示。
[0040]表1
[0041]
【權(quán)利要求】
1.一對用于肺炎克雷伯氏菌RecA基因保守片段序列的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為序列表中序列I和序列2。
2.一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針，其特征在于，所述引物的核苷酸序列為序列表中序列3和序列4 ;所述探針的核苷酸序列為序列表中序列5。
3.—組如上述權(quán)利要求2所述的用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針的衍生序列，其特征在于，所述引物的衍生序列包括引物序列的互補(bǔ)鏈序列、引物序列向5’端和3’方向延伸一至數(shù)個堿基或刪減一至數(shù)個堿基得到的序列；所述探針的衍生序列包括探針5’端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)FAM、TET、JOE、HEX或VIC，3’端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA、DABCYL 或 BHQ。
4.一種用于檢測肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求I和2所述的引物和探針。
5.權(quán)利要求2所述的一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針在定量檢測肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求3所述的一組用于定量檢測肺炎克雷伯氏菌的引物和探針的衍生序列在定量檢測肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求4所述的 一種用于檢測肺炎克雷伯氏菌的實(shí)時熒光定量PCR試劑盒在定量檢測肺炎克雷伯氏菌中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/11GK103642910SQ201310614228
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2013年11月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】車團(tuán)結(jié), 李琳, 尤崇革 申請人:車團(tuán)結(jié)