一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，其原理在于高濃度的鹽離子在蛋白質(zhì)溶液中可與蛋白質(zhì)競(jìng)爭(zhēng)水分子，從而破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，降低其溶解度，使之從溶液中沉淀出來(lái)。而硫酸銨因其溶解度大，溫度系數(shù)小和不易使蛋白質(zhì)變性而應(yīng)用最廣。因此，本發(fā)明選擇硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工藝進(jìn)行了研究、改進(jìn)，特別是采用親和層析使得制備糜蛋白酶原的收率提高到0.5％～0.6％，同時(shí)得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原。
【專利說(shuō)明】一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)涉及一種應(yīng)用硫酸銨分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原的同時(shí)得到胰蛋白酶原的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]糜蛋白酶原是糜蛋白酶的前體，它屬于絲氨酸蛋白酶，分子量為25000道爾頓。糜蛋白酶又稱胰凝乳蛋白酶，分子量為42000道爾頓，用于肽鏈的酶解，專門水解肽鍵，屬于肽鏈內(nèi)切酶，水解產(chǎn)率很高，但其專一性小于胰蛋白酶。其固體狀態(tài)較穩(wěn)定，呈白色棒狀結(jié)晶；而水溶液極不穩(wěn)定，pH在5~8時(shí)，其活力最強(qiáng)，也最易失去活性。
[0003]胰蛋白酶原為胰蛋白酶的前體，在胰臟中合成，存在于胰液里，分泌到十二指腸中，通過(guò)十二指腸粘膜中的腸激酶的作用，在6位賴氨酸和7位異亮氨酸之間切斷。從N端到第6位置之間的肽鏈(H-val-Asp4-Lys-0H)切斷時(shí)便出現(xiàn)活性，這種激活作用也可以通過(guò)胰蛋白酶的自我催化反應(yīng)進(jìn)行。
[0004]糜蛋白酶為胰腺分泌的一種蛋白水解酶，能迅速分解變性蛋白質(zhì)，作用、用途與胰蛋白酶相似，比胰蛋白酶分解能力強(qiáng)、毒性低、不良反應(yīng)小。一般用于手術(shù)后創(chuàng)口或創(chuàng)傷愈合、抗炎及防止局部積血、水腫、扭傷血腫、乳房手術(shù)后局部腫脹、鼻炎、中耳炎等。也可用于白內(nèi)障摘除、松解睫狀肌韌帶，以減少膜破裂和視網(wǎng)膜損傷。此外，糜蛋白酶與胰蛋白酶或其他化學(xué)藥劑共同治療
[0005]各種炎癥具有協(xié)同作用，故常用于外科創(chuàng)傷及眼睛消腫治療。
[0006]本發(fā)明人自2008年開(kāi)始對(duì)糜蛋白酶的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，特別是在其前體糜蛋白酶原的生產(chǎn)過(guò)程中，不斷 探索，力求優(yōu)化完善工藝參數(shù)，使糜蛋白酶原收率提高到5%~6%，同時(shí)還能得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]1、本發(fā)明提供了一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，是為了解決糜蛋白酶原提取工藝收率低、活性低的缺點(diǎn)，改進(jìn)糜蛋白酶原提取的工藝，從而提高收率，減少蛋白活性損失，特別是采用親和層析得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原。
[0008]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0009]一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，其特征在于:選用硫酸銨分級(jí)沉淀，改進(jìn)糜蛋白酶原提取工藝，特別是采用親和層析將糜蛋白酶原收率提高到0.5%~
0.6%，同時(shí)得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原，更好的保持了蛋白的活性。在發(fā)明技術(shù)方案中，其特征還在于所述提取工藝包括如下步驟:
[0010]I)原料預(yù)處理
[0011]胰臟洗凈后，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0012]2)蛋白浸潰提取
[0013]2.1)取預(yù)處理過(guò)的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿(必要時(shí)應(yīng)絞3次)，加入胰漿2倍量的冰冷硫酸，置冷室中，多次攪拌，浸潰提取。
[0014]2.2)浸潰物過(guò)濾后，濾渣再用I倍量的冰冷硫酸重復(fù)上述過(guò)程，再進(jìn)行過(guò)濾，棄濾渣，合并2次濾液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到40%飽和度，冷室放置，過(guò)夜。
[0015]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過(guò)濾，上清液和濾液合并，得提取液，加入硫酸銨，使硫酸銨濃度達(dá)到70%飽和度，冷室放置過(guò)夜。
[0016]3)分級(jí)沉淀
[0017]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過(guò)濾至干，加入3倍于濾餅重的冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40%和70%飽和度分級(jí)沉淀；
[0018]3.2)將最后一次70%飽和度沉淀濾餅，加入1.5倍于濾餅重的冰水溶解，并加入
0.5倍濾餅重量的飽和硫酸銨溶液。
[0019]4)親和層析
[0020]4.1)用適量的0.01-0.3mol / L，PH5-10的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0021]4.2)將混合液流經(jīng)此柱，流速控制在I~5mL / min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液；
[0022]4.3)平衡后，用0.l-5mol / L的NaCL溶液洗脫完全，得含胰蛋白酶原的淋洗液。
[0023]5)結(jié)晶
[0024]5.1)將含糜蛋白酶原的淋洗液，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH5.0，于25°C恒溫箱中靜置，保溫，進(jìn)行結(jié)晶。
[0025]5.2)將結(jié)晶減壓抽濾，干燥后得糜蛋白酶原。
[0026]經(jīng)核算，所得糜蛋白酶收率約為0.5%~0.6%。
[0027]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是:
[0028]選用硫酸銨分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原，可以提高提取糜蛋白酶原的效率，并且使其理化性質(zhì)和生物活性保持穩(wěn)定，從而有利于下一步對(duì)糜蛋白酶原進(jìn)行精制，最終使糜蛋白酶的各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)。更重要的是，通過(guò)工藝的不斷改進(jìn)和完善，特別是采用親和層析將糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，同時(shí)得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原，節(jié)約成本，提高了經(jīng)濟(jì)效益。
【具體實(shí)施方式】
[0029]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，而不以任何方式限制。
[0030]實(shí)施例1
[0031]1)原料預(yù)處理
[0032]胰臟洗凈后，去掉脂肪、結(jié)締組織等雜物，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0033]2)蛋白浸潰提取
[0034]2.1)將預(yù)處理過(guò)的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿，稱重后積滿IOOkg投入反應(yīng)罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0035]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過(guò)濾，濾干后，得到濾渣86kg。再用86L冰冷硫酸重復(fù)上述過(guò)程，再進(jìn)行過(guò)濾，棄濾渣，合并2次濾液共270L，加入固體硫酸銨65.34kg,使硫酸銨濃度達(dá)到40%飽和度，冷室放置，過(guò)夜。
[0036]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過(guò)濾，上清液和濾液合并，得提取液264L，加入固體硫酸銨54.12kg，使硫酸銨濃度達(dá)到70%飽和度，冷室放置過(guò)夜。[0037]3)分級(jí)沉淀
[0038]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過(guò)濾至干稱重46.68kg，加入140L冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40%和70%飽和度分級(jí)沉淀；
[0039]3.2)取第二次70%飽和度沉淀濾餅9.6kg，加入14.4L冰水溶解，并加入4.8L飽和硫酸銨溶液。
[0040]4)親和層析
[0041]4.1)用80L0.2mol / L，PH8的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0042]4.2)將混合液19.2L流經(jīng)此柱，流速控制在2mL / min左右，得到含糜蠆白酶原的淋洗液16.4L ；
[0043]4.3)平衡后，用36.8L1.5mol / L的NaCL溶液洗脫，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.4L。
[0044]5)結(jié)晶
[0045]5.1)將含糜蛋白酶原的淋洗液16.4L，用5mol / L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH5.0，于25°C恒溫箱中靜置，保溫48h進(jìn)行結(jié)晶；
[0046]5.2)將結(jié)晶減壓抽濾，干燥后得糜蛋白酶原0.55kg。
[0047]經(jīng)核算，所得糜蛋白酶原收率為0.55%。
[0048]實(shí)施例2
[0049]I)原料預(yù)處理
[0050]胰臟洗凈后，去掉脂肪、結(jié)締組織等雜物，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液中，驟然冷卻，在零度左右保存。
[0051]2)蛋白浸潰提取
[0052]2.1)將預(yù)處理過(guò)的胰臟投入絞肉機(jī)中絞碎成胰漿，稱重后積滿IOOkg投入反應(yīng)罐，加入200L冰冷硫酸。置冷室中，每I~2h攪拌I次，浸潰提取24h。
[0053]2.2)浸潰物用粗濾袋(或二層紗布)過(guò)濾，濾干后，得到濾渣88kg。再用88L冰冷硫酸重復(fù)上述過(guò)程，再進(jìn)行過(guò)濾，棄濾渣，合并2次濾液共275L，加入固體硫酸銨66.55kg,使硫酸銨濃度達(dá)到40%飽和度，冷室放置，過(guò)夜。
[0054]2.3)虹吸上清液，底層沉淀加入適量硅藻土作助濾劑，減壓過(guò)濾，上清液和濾液合并，得提取液268L，加入固體硫酸銨54.94kg，使硫酸銨濃度達(dá)到70%飽和度，冷室放置過(guò)夜。
[0055]3)分級(jí)沉淀
[0056]3.1)次日上層清液棄去，底層沉淀減壓過(guò)濾至干稱重48.67kg，加入146L冰水使之溶解，重復(fù)用硫酸銨40%和70%飽和度分級(jí)沉淀；
[0057]3.2)取第二次70%飽和度沉淀濾餅9.8kg，加入14.7L冰水溶解，并加入4.9L飽和硫酸銨溶液。
[0058]4)親和層析[0059]4.1)用82L0.15mol / L，PH7的Tris-HCL緩沖液平衡親和層析快膠柱；
[0060]4.2)將混合液19.6L流經(jīng)此柱，流速控制在3mL / min左右，得到含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L ；
[0061]4.3)平衡后，用38.5Llmol / L的NaCL溶液洗脫，得含胰蛋白酶原的淋洗液37.6L。
[0062]5)結(jié)晶
[0063]5.1)將含糜蛋白酶原的淋洗液16.8L，用5mol / L氫氧化鈉調(diào)節(jié)PH5.0，于25°C恒溫箱中靜置，保溫48h進(jìn)行結(jié)晶；
[0064]5.2)將結(jié)晶減壓抽濾，干燥后得糜蛋白酶原0.58kg。
[0065]經(jīng)核算，所得糜蛋白酶原收率為0.58%。
[0066]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對(duì)本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何簡(jiǎn)單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種分級(jí)沉淀提取糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的方法，應(yīng)用硫酸銨分級(jí)沉淀法對(duì)糜蛋白酶原和胰蛋白酶原提取工藝進(jìn)行了研究、改進(jìn)通過(guò)工藝參數(shù)的研究、改進(jìn)，提高了蛋白提取的效率，減少了蛋白活性的損失，特別是采用親和層析并且得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述糜蛋白酶原和胰蛋白酶原是通過(guò)以牛胰或豬胰等為原料，將原料依次經(jīng)過(guò)預(yù)處理、蛋白浸潰提取、分級(jí)沉淀、親和層析、結(jié)晶制備得到的。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述提取工藝包括如下步驟: (1)胰臟洗凈后 ，立即浸入預(yù)先冰凍好的硫酸溶液保存； (2)將上述胰臟絞成胰漿，加入冰冷硫酸置于冷室中，攪拌后浸潰提取； (3)過(guò)濾,濾液中加入硫酸銨,冷室放置過(guò)夜后,減壓過(guò)濾； (4)經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀后得含糜蛋白酶原和胰蛋白酶原的混合液； (5)再經(jīng)過(guò)親和層析，將兩者分離，得胰蛋白酶原和含糜蛋白酶原的淋洗液； (6)將含糜蛋白酶原的淋洗液于恒溫箱中靜置結(jié)晶，減壓抽濾，得糜蛋白酶原。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，胰臟在絞碎前，始終在冰冷的硫酸溶液中保存。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述硫酸溶液的濃度均為0.0125mol/ L。
6.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，為了更好的提取蛋白，硫酸銨沉淀可反復(fù)進(jìn)行。
7.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析快膠柱包括:DEAE-Sepharose2B FF, DEAE-Sepharose4B FF, DEAE-Sepharose6B FF, DEAE-SepharoseCL-2B FF，DEAE-Sepharose CL-4B FF，DEAE-Sepharose CL-6BFF。
8.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于:所述親和層析條件為:平衡液選用0.01-0.3mol / L，PH5-10的Tris-HCL緩沖液，流速控制在I~5mL / min左右，洗脫液選用 0.l-5mol / L 的 NaCL 溶液。
9.如權(quán)利要求1~6所述的方法，其特征在于:所得糜蛋白酶原收率提高到0.5%~0.6%，同時(shí)得到副產(chǎn)品胰蛋白酶原。
【文檔編號(hào)】C12N9/76GK103667227SQ201310616061
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月23日
【發(fā)明者】劉乃山, 林曉磊, 孫延年, 葛翠鳳 申請(qǐng)人:青島康原藥業(yè)有限公司