一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法，所述方法的關(guān)鍵創(chuàng)新點為使用小型解剖刀在PCR管中將線蟲切開，無需轉(zhuǎn)管，有效地避免了管外切割線蟲后轉(zhuǎn)管造成的DNA損失，從而極大的提高了DNA提取的效率，而且使用本發(fā)明中的方法提取線蟲DNA時無需凍融的環(huán)節(jié)，提取步驟更加簡化。利用本發(fā)明中的方法提取獲得的單條線蟲基因組DNA模板滿足常規(guī)PCR擴增、實時熒光PCR擴增、恒溫擴增等分子檢測技術(shù)的需求。此法高效、穩(wěn)定、成本低、操作簡單、安全無毒，可在基于核酸的分子檢測鑒定中推廣應(yīng)用。
【專利說明】—種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物線蟲檢疫鑒定領(lǐng)域，提供了一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法，具體而言，所述方法通過提取獲得的單條線蟲基因組DNA滿足常規(guī)PCR擴增、實時熒光PCR擴增、恒溫擴增等基于核酸的分子檢測技術(shù)的要求，適用于口岸及農(nóng)林業(yè)相關(guān)檢疫鑒定實驗室應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]對植物線蟲進行準確鑒定是研究線蟲生物學(xué)習(xí)性及其發(fā)病規(guī)律的重要基礎(chǔ)，對進一步制定有效的防治措施具有重要意義。傳統(tǒng)的植物線蟲鑒定方法主要依賴于形態(tài)特征和形態(tài)測量值，要求鑒定者要有極為豐富的經(jīng)驗和技巧?；贒NA的分子鑒定方法對鑒定者的要求相對較低，是形態(tài)鑒定的重要輔助手段，目前在線蟲的分類鑒定中應(yīng)用廣泛。線蟲分子鑒定的首要步驟是DNA的提取，通常來說包括大量線蟲DNA提取和單條線蟲DNA提取兩種方法。而其中單條線蟲DNA提取方法因其需要線蟲量少、無需線蟲純化、簡捷、廉價等優(yōu)點在線蟲分子鑒定中備受青睞。
[0003]關(guān)于單條線蟲DNA微量提取方法有較多的研究報道。Barstead等(1991)和Williams等(1992)使用WLB裂解液成功提取了單條秀麗小桿線蟲的DNA。Powers等(1993)將根結(jié)線蟲二齡幼蟲破碎后直接用于線粒體COII和16S rRNA之間基因的PCR擴增，建立了針對根結(jié)線蟲的二齡幼蟲的快速鑒定方法。Stanton等(1998)以根結(jié)線蟲的二齡幼蟲為材料，系統(tǒng)比較了微波加熱法、水浴加熱法、蛋白酶裂解法、直接磨碎法和NaOH法提取線蟲DNA的效果，發(fā)現(xiàn)NaOH法提取成功率可達81 %，直接磨碎法成功率為50%，其它方法效率較低。Kumari 等(2004)使 用 Triton X-100 法成功提取單條劍線蟲(Xiphinema vuittenezi)的DNA，可用于特異引物PCR擴增，這一點與Stanton等的結(jié)果不同，可能是劍線蟲個體較根結(jié)線蟲更大，DNA更容易提取造成。沈錫權(quán)等(2005)從單條固定海洋線蟲中提取得到基因組DNA，并用于18S rRNA基因PCR擴增，發(fā)現(xiàn)蛋白酶K法獲得的DNA比NaOH裂解法所獲得的更適合PCR擴增。2011年，王江嶺等在王金成等和沈錫權(quán)等的基礎(chǔ)上，提出使用液氮替代_80°C冰箱冷凍線蟲，進一步提高了單條線蟲DNA提取的效率，可高效、穩(wěn)定的提取滑刃類線蟲的DNA，但提取短體線蟲時效果較差。王金成等(2012)對王江嶺等建立的方法進行了再次改進，解決了單條短體線蟲DNA微量提取問題。
[0004]然而，雖然單條線蟲DNA的提取方法很多，但大多數(shù)方法因操作復(fù)雜、步驟繁多或效率不高等原因被淘汰，目前被廣泛應(yīng)用的只有酶裂解法。但實踐表明，酶裂解法的效率和穩(wěn)定性仍然需要優(yōu)化提高，以適合更加多樣的線蟲DNA的提取。
[0005]本研究以相對成熟的凍融-酶裂解法為模型，設(shè)計單條線蟲DNA提取方法，摸清了線蟲切割、液氮凍融和蛋白酶K作用時間對線蟲DNA提取的影響，提出了一種高效、穩(wěn)定、廉價、簡捷的單條線蟲DNA提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)中單條線蟲DNA的提取方法所普遍存在的操作復(fù)雜、步驟繁多以及效率低的缺陷，提供一種高效、穩(wěn)定、廉價、簡捷的單條植物線蟲基因組DNA提取方法，所述方法包括如下步驟:
[0007]步驟一、預(yù)處理:將待提取的線蟲用雙蒸水清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8 μ L雙蒸水的PCR管中，掌上離心機瞬時離心；
[0008]步驟二、切割裂解:在上述PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，隨后加入2 μ L裂解液，所述裂解液為體積比為10:9:1的10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液；
[0009]步驟三、后處理:將步驟二經(jīng)切割裂解的線蟲于56°C保溫Ih后，95°C加熱lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0010]所述雙蒸水即為經(jīng)過兩次蒸餾的無菌水，其通常用于分子生物學(xué)實驗。
[0011]所述裂解液中的IOXPCR Buffer和20mg/mL的蛋白酶K均為TAKARA公司生產(chǎn)，商品編號分別為ROOlB和9033 ；
[0012]優(yōu)選地，本申請還進一步地涉及一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法，可在步驟二的切割步驟之后、裂解步驟之前，增加凍融步驟，具體為:在上述PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，反復(fù)凍融2次，所述凍融采用液氮凍融lmin，65°C水浴2min,隨后加入2 μ L裂解液，再進行步驟三的后處理步驟。
[0013]本申請的方法適用于多種植物線蟲的基因組DNA，特別的，適用于穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、松材線蟲(Bursaphelenchus xy lophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、六線頭墊刃線蟲(Cephalenchus hexalineatus)或小環(huán)線蟲(Criconemella sp.)。
[0014]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的進步在于:使用小型解剖刀在PCR管中將線蟲切開，無需轉(zhuǎn)管，有效地避免了管外切割線蟲后轉(zhuǎn)管造成的DNA損失，從而明顯的提高了線蟲DNA的提取效率。此法高效、穩(wěn)定、成本低、操作簡單、安全無毒，可在基于核酸的分子檢測鑒定中推廣應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1采用切割、裂解步驟來提取單條線蟲DNA的PCR擴增檢測結(jié)果；
[0016]圖2采用切割、凍融和裂解步驟來提取單條線蟲DNA的PCR擴增檢測結(jié)果；
[0017]圖3采用凍融和裂解步驟來提取單條線蟲DNA的PCR擴增檢測結(jié)果；
[0018]圖4采用裂解步驟來提取單條線蟲DNA的PCR擴增檢測結(jié)果；
[0019]圖中各字母含義如下:A:穿刺短體線蟲；B:南方根結(jié)線蟲；C:松材線蟲；D:擬松材線蟲；E:六線頭墊刃線蟲；F:小環(huán)線蟲.M =DNAmarker DL2000 ;泳道為線蟲重復(fù)。
【具體實施方式】
[0020]為能進一步了解本發(fā)明的
【發(fā)明內(nèi)容】
、特點及功效，茲舉以下實施例，并配合附圖詳細說明如下:
[0021]標本來源
[0022]本實驗測試了 6個線蟲群體，其中包括I個穿刺短體線蟲群體,I個南方根結(jié)線蟲群體，I個松材線蟲群體，I個擬松材線蟲群體,I個六線頭墊刃線蟲群體和I個小環(huán)線蟲群
體，詳情見下表:
[0023]
線蟲種類拉丁學(xué)名寄主植物 ?相關(guān)描述
N0._Species_Scientific nameHost plants Source Code_Description
1* Pratylenchus石八共^.PPl 30 新鮮百合種球根部
1線蟲 peLtrcms胃二I 中分離
2南方根結(jié)線蟲β黃瓜天津 ΜΙ?3()新鮮土壤中分離
3松機蟲 S=Zhm 松木美國BY0經(jīng)冗菌彥抓培
4擬松材線蟲B.mucnmatus松木中國
5六線頭墊刃線蟲髙山杜鵑比利日寸BC1120新鮮培養(yǎng)離介質(zhì)中分
^.p.?哩蟲苗MH12 新鮮培養(yǎng)介質(zhì)中分
6小環(huán)線蟲 CnconemeHa sp.黒麥草美國 ⑴離
[0024]注:PP、M1、BX、BM、BC、MH分別為6種線蟲拉丁文名稱的簡寫。
[0025]實施例1、采用“切害I]、裂解步驟”提取單條線蟲基因組DNA的效果
[0026]單條線蟲DNA提取方法:用雙蒸水將線蟲清洗干凈,挑取單條線蟲放入含8 μ L雙蒸水的PCR管中，瞬時離心，在PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，隨后加入2 μ L裂解液(所述裂解液為10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1),10XPCR Buffer 與 20mg/mL 蛋白酶 K 均購自 TAKARA 公司)，56°C保溫 lh，95°C加熱 lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0027]單條線蟲DNA提取效果評價:單條線蟲DNA提取效果通過PCR擴增線蟲核糖體28SrRNA上D2D3基因片段的效率進行評價。
[0028]1.PCR 擴增:
[0029]PCR 擴增引物:上游引物為 D2A(5' -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3')，下游引物為 D3B (5' -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3')；
[0030]PCR 擴增體系(50 μ L):10 X PCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mmol/L) 2 μ L，D2A (10 μ mol/L) I μ L, D3B (10 μ mol/L) I μ L, rTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，模板DNAlO μ L，ddH2030.6 μ L。所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司。
[0031]PCR擴增程序:95°C預(yù)變性3min ；40個循環(huán)反應(yīng):95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸Imin ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0032]2.電泳檢測
[0033]每個樣品取3 μ L擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0034]3.PCR擴增結(jié)果
[0035]從PCR擴增結(jié)果來看(圖1)，通過本發(fā)明的包括切割、裂解步驟的方法提取的6種線蟲的單條線蟲DNA在隨后的PCR擴增中成功率均為100%，且電泳條帶明亮，說明采用本發(fā)明的切割、裂解步驟提取單條線蟲DNA的效率很高，滿足后續(xù)PCR擴增等基于核酸的分子檢測的需求。
[0036]實施例2、“采用切割、凍融以及裂解步驟”提取單條線蟲基因組DNA的效果[0037]單條線蟲DNA提取方法:用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8 μ LddH20的PCR管中，瞬時離心，在PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，反復(fù)凍融2次(液氮處理lmin，65°C水浴2min)后，加入2μ L裂解液(所述裂解液為10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1), 10XPCR Buffer與20mg/mL蛋白酶K均購自TAKARA公司)，56°C保溫lh，95°C加熱lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0038]單條線蟲DNA提取效果評價:單條線蟲DNA提取效果通過PCR擴增線蟲核糖體28SrRNA上D2D3基因片段的效率進行評價。
[0039]1.PCR 擴增:
[0040]PCR 擴增引物:上游引物為 D2A(5' -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3')，下游引物為 D3B(5' -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3')；
[0041]PCR 擴增體系(50 μ L):10 X PCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mmol/L) 2 μ L，D2A (10 μ mol/L) I μ L, D3B (10 μ mol/L) I μ L, rTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，模板DNAlO μ L，ddH2030.6 μ L。所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司。
[0042]PCR擴增程序:95°C預(yù)變性3min ；40個循環(huán)反應(yīng):95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸Imin ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0043]2.電泳檢測
[0044]每個樣品取3 μ L擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0045]3.PCR擴增結(jié)果
[0046]從PCR擴增結(jié)果來看(圖2)，通過本發(fā)明的包括切割、凍融以及裂解步驟的方法提取的6種線蟲的單條線蟲DNA在隨后的PCR擴增中成功率均為100%，且電泳條帶明亮，說明本發(fā)明的方法提取單條線蟲DNA的效率很高，滿足后續(xù)PCR擴增等基于核酸的分子檢測的需求。同時，在根結(jié)線蟲DNA的提取中，非特異性擴增相對僅采用切割、裂解步驟稍有減弱，提取效果略有提高但不明顯(圖1-B，圖2-B)。
[0047]實施例3、“采用凍融、裂解步驟”提取單條線蟲基因組DNA的效果
[0048]單條線蟲DNA提取方法:用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8 μ LddH20的PCR管中，瞬時離心，反復(fù)凍融2次(液氮處理lmin，65°C水浴2min)后，加入2 μ L裂解液(所述裂解液為10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1), 10XPCR Buffer 與 20mg/mL 蛋白酶 K 均購自 TAKARA 公司)，56°C 保溫 lh，95°C 加熱lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0049]單條線蟲DNA提取效果評價:單條線蟲DNA提取效果通過PCR擴增線蟲核糖體28SrRNA上D2D3基因片段的效率進行評價。
[0050]1.PCR 擴增:
[0051]PCR 擴增引物:上游引物為 D2A(5' -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3')，下游引物為 D3B (5' -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3')；
[0052]PCR 擴增體系(50 μ L):10 X PCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mmol/L) 2 μ L，D2A (10 μ mol/L) I μ L, D3B (10 μ mol/L) I μ L, rTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，模板DNAlO μ L，ddH2030.6 μ L。所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司。
[0053]PCR擴增程序:95°C預(yù)變性3min ；40個循環(huán)反應(yīng):95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸lmin ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0054]2.電泳檢測
[0055]每個樣品取3 μ L擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0056]3.PCR擴增結(jié)果
[0057]從PCR擴增結(jié)果來看(圖3)，通過本發(fā)明的包括凍融、裂解步驟的方法提取的6種線蟲的單條線蟲DNA在隨后的PCR擴增中成功率存在明顯差異，以松材線蟲的提取效果最好，六線頭墊刃線蟲次之，穿刺短體線蟲的提取效果雖較好，但存在非特異性擴增問題，根結(jié)線蟲和擬松材線蟲效果不穩(wěn)定，而小環(huán)線蟲的提取效果最差，并且非特異性擴增明顯，可見線蟲切割對不同線蟲DNA提取的影響顯著。
[0058]實施例4、“采用裂解步驟”提取單條線蟲基因組DNA的效果
[0059]單條線蟲DNA提取方法:用雙蒸水將線蟲清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8 μ L雙蒸水的PCR管中，瞬時離心后，加入2μ L裂解液(所述裂解液為10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液(體積比10:9:1), 10XPCR Buffer與20mg/mL蛋白酶K均購自TAKARA公司)，56°C保溫lh，95°C加熱lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
[0060]單條線蟲DNA提取效果評價:單條線蟲DNA提取效果通過PCR擴增線蟲核糖體28SrRNA上D2D3基因片段的效率進行評價。
[0061]1.PCR 擴增:
[0062]PCR 擴增引物:上游引物為 D2A(5' -ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG-3')，下游引物為 D3B (5' -TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3')；
[0063]PCR 擴增體系(50 μ L):10 X PCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP (2.5mmol/L) 2 μ L，D2A (10 μ mol/L) 1μ L, D3B (10 μ mol/L) 1 μ L, rTaq DNA 聚合酶(5U/ μ L) 0.4 μ L，模板DNAlO μ L，ddH2030.6 μ L。所用試劑均購自寶生物(TAKARA)公司。
[0064]PCR擴增程序:95°C預(yù)變性3min ；40個循環(huán)反應(yīng):95°C變性40sec，55°C退火40sec，72°C延伸Imin ;最后72°C保溫5min，使反應(yīng)物充分延伸。
[0065]2.電泳檢測
[0066]每個樣品取3 μ L擴增產(chǎn)物，使用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，設(shè)置電壓160V，電泳30min后將凝膠放入EB染液中染色15min，隨后置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并拍照。
[0067]3.PCR擴增結(jié)果
[0068]從PCR擴增結(jié)果來看(圖4)，通過本發(fā)明的裂解步驟的方法提取的6種線蟲的單條線蟲DNA在隨后的PCR擴增的效果較凍融裂解法(實例3)更差，說明沒有凍融環(huán)節(jié)的直接裂解法提取DNA的效率更低且不夠穩(wěn)定，對根結(jié)線蟲和小環(huán)線蟲來說尤其如此。對于穿刺短體線蟲、擬松材線蟲和六線頭墊刃線蟲需56 °C保溫3小時以上才能檢測到PCR產(chǎn)物，而經(jīng)過BC培養(yǎng)的松材線蟲滯育蟲態(tài)甚至需要保溫4小時以上才能達到提取的目的。
[0069]本發(fā)明的一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法已經(jīng)通過具體的實例進行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本
【發(fā)明內(nèi)容】
，適當改變原料、工藝條件等環(huán)節(jié)來實現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的， 都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用管內(nèi)切蟲來提取單條植物線蟲基因組DNA的方法，所述方法包括如下步驟: 步驟一、預(yù)處理:將待提取的線蟲用雙蒸水清洗干凈，挑取單條線蟲放入含8 μ L雙蒸水的PCR管中，掌上離心機瞬時離心； 步驟二、切割裂解:在上述PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，隨后加入2 μ L裂解液，所述裂解液為體積比為10:9:1的10XPCR Buffer、雙蒸水與20mg/mL蛋白酶K的混合液；步驟三、后處理:將步驟二經(jīng)切割裂解的線蟲于56°C保溫Ih后，95°C加熱lOmin，瞬時離心后上清液可用于后續(xù)的分子檢測。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的提取方法，其特征在于:所述裂解液中的10XPCRBuffer和20mg/mL的蛋白酶K均為TAKARA公司生產(chǎn)，商品編號分別為ROOlB和9033。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的提取方法，其特征在于:在步驟二的切割步驟之后、裂解步驟之前，增加凍融步驟同樣適用，具體為:在上述PCR管內(nèi)用小型解剖刀將線蟲切開，反復(fù)凍融2次，所述凍融采用液氮凍融lmin，65°C水浴2min，隨后加入2 μ L裂解液，再進行步驟三的后處理步驟。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的提取方法，其特征在于:所述植物線蟲為穿刺短體線蟲(Pratylenchus penetrans)、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incognita)、松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)、擬松材線蟲(B.mucronatus)、六線頭墊刃線蟲(Cephalenchus hexal ineatus)或小環(huán)線蟲(Criconemella sp.)。
【文檔編號】C12N15/10GK103602668SQ201310618805
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】王金成, 林宇, 容萬韜, 張裕君, 黃國明, 廖芳 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心