一種納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê陀猛?br> 【專利摘要】本發(fā)明涉及基因?qū)搿炯夹g(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê陀猛?，該納米基因?qū)氩牧鲜怯蒀18V2+和氯鉑酸反應(yīng)制成的平均粒徑為100nm的PtNPs–C18V2+復(fù)合物，其與綠色熒光蛋白質(zhì)?；騪GFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成無(wú)機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，PtNPs–C18V2+復(fù)合物作為非病毒型轉(zhuǎn)染載體，表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞相容性，具有穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率。
【專利說(shuō)明】一種納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê陀猛?br> 【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因?qū)搿炯夹g(shù)領(lǐng)域】，特別是涉及一種納米基因?qū)氩牧霞捌渲苽浞椒ê陀猛尽?br> 【背景技術(shù)】
[0002]隨著人類基因圖譜測(cè)定的完成，我們對(duì)人類疾病發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)在基因水平上取得了突破性的進(jìn)展。目前研究表明，有許多疾病的發(fā)生及發(fā)展與基因密切相關(guān)。如果可以篩查出與疾病特異相關(guān)的基因片段或者基因突變，就可以有針對(duì)性地在基因水平上進(jìn)行特異治療，如通過(guò)導(dǎo)入相關(guān)缺失基因或沉默基因，以增強(qiáng)相關(guān)缺失功能或者沉默致病基因，從而達(dá)到徹底治療的目的。將目的基因安全有效地導(dǎo)入生物體內(nèi)是目前此研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵和難點(diǎn)。
[0003]基因?qū)胂到y(tǒng)或方法可以分為兩類:一類是病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，以逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒為載體；另一類是非病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)，其轉(zhuǎn)染方式如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉淀、陽(yáng)離子脂質(zhì)體法、以及新興的納米基因?qū)氩牧?。其中，病毒型基因?qū)胂到y(tǒng)存在許多嚴(yán)重的不足，如病毒轉(zhuǎn)染有可能激活原癌基因等，因此，非病毒型轉(zhuǎn)染方式是目前的研究熱點(diǎn)。
[0004]上述非病毒基因?qū)胂到y(tǒng)的幾種轉(zhuǎn)染方式中，顯微注射一次只能處理一個(gè)細(xì)胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉淀法結(jié)果不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)染效率受溫度、濃度、操作環(huán)境等眾多因素影響；陽(yáng)離子脂質(zhì)體法雖然表現(xiàn)了良好的轉(zhuǎn)染效率，但是過(guò)高的毒性又限制了它的應(yīng)用。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的之一在于避免現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種具有良好的生物相容性、穩(wěn)定且轉(zhuǎn)染效率高的納米基因?qū)氩牧稀?br> [0006]本發(fā)明的目的之二在于避免現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種反應(yīng)簡(jiǎn)單、容易操作、可重復(fù)性好的納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ā?br> [0007]本發(fā)明的目的之三在于避免現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種具有良好的生物相容性、穩(wěn)定且轉(zhuǎn)染效率高的納米基因?qū)氩牧系男掠猛尽?br> [0008]本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
本發(fā)明的一種納米基因?qū)氩牧?，它是由C18V2+和氯鉬酸反應(yīng)制成的平均粒徑為IOOnm的PtNPs - C18V2+復(fù)合物，其中C18V2+和氯鉬酸用量的摩爾比為3:1;。
[0009]C18V2+和氯鉬酸反應(yīng)形成的PtNPs - C18V2+復(fù)合物由于其表面鉬離子的正電性，使其具備成為轉(zhuǎn)染材料的潛力，C18V2+可以控制生成的PtNPs - C18V2+復(fù)合物為球形顆粒，通過(guò)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的控制可以控制PtNPs - C18V2+復(fù)合物的平均粒徑在IOOnm左右，從而符合轉(zhuǎn)染要求。
[0010]本發(fā)明的一種納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ㄈ缦?1)用去離子水分別制備濃度為6mM的C18V2+溶液和濃度為2mM的氯鉬酸溶液；
2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加熱至110° C，然后滴加0.1ml所述氯鉬酸溶液,冷卻回流20min后，將所獲得的混合物在7000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，過(guò)濾后所得的沉淀物用去離子水和乙醇沖洗，最終產(chǎn)物分散在乙醇中，最后用超聲處理，超聲頻率為28kHz，處理時(shí)間3min。
[0011]本發(fā)明提供了一種納米基因?qū)氩牧系男掠猛?，所述PtNPs - C18V2+復(fù)合物與綠色熒光蛋白質(zhì)粒基因PGFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成無(wú)機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。
[0012]所述PtNPs - C18V2+復(fù)合物作為基因轉(zhuǎn)染材料在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。[0013]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明的納米基因?qū)氩牧?，是由C18V2+和氯鉬酸反應(yīng)制成的平均粒徑為IOOnm的PtNPs-C18V2+復(fù)合物，由于其表面鉬離子的正電性，使其具備成為轉(zhuǎn)染材料的潛力，PtNPs - C18V2+復(fù)合物作為非病毒型轉(zhuǎn)染載體，表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞相容性，具有穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率?，F(xiàn)有技術(shù)中雖然已有大量納米材料在轉(zhuǎn)染領(lǐng)域被測(cè)試，但是使用PtNPs -C18V2+復(fù)合物作為轉(zhuǎn)染材料尚屬首例(這是因?yàn)楸M管PtNPs - C18V2+復(fù)合物細(xì)胞相容性很好，但是其顆粒一般只能達(dá)到微米級(jí)，低尺度的很難做出來(lái)，我們通過(guò)對(duì)反應(yīng)時(shí)間的控制，可以將其平均粒徑控制在IOOnm左右，符合轉(zhuǎn)染要求)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的納米基因?qū)氩牧暇哂幸韵聝?yōu)點(diǎn):
1)具有較高的轉(zhuǎn)染效率，在人乳腺癌細(xì)胞中可以達(dá)到40%左右；
2)低毒性，因C18V2+和氯鉬酸具有良好的生物相容性，細(xì)胞生存率很高；
3)材料分散性良好，符合對(duì)轉(zhuǎn)染的要求；
4)制作成本極低，因C18V2+、二甲基甲酰胺、氯鉬酸都是常見(jiàn)易得的廉價(jià)試劑；
5)材料制備反應(yīng)簡(jiǎn)單，容易操作，可重復(fù)性好；
應(yīng)用前景良好，可以應(yīng)用于制備抗腫瘤藥物。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]利用附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但附圖中的內(nèi)容不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的任何限制。
[0015]圖1為本發(fā)明的納米基因?qū)氩牧螾tNPs-C18V2+的掃描電鏡圖片。
[0016]圖2為轉(zhuǎn)染后的倒置熒光顯微鏡下的熒光圖片。
[0017]圖3為轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率圖片。
[0018]圖4為轉(zhuǎn)染效率圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]結(jié)合以下實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0020]本發(fā)明的納米基因?qū)氩牧鲜怯蒀18V2+和氯鉬酸反應(yīng)制成的平均粒徑為IOOnm的PtNPs - C18V2+復(fù)合物，其制備方法如下:
1、材料的準(zhǔn)備:
分析純的C18V2+和氯鉬酸(Aldrich公司產(chǎn)品)；
所有的制備用玻璃器皿，均在乙醇中超聲5min，然后雙蒸水清洗，并用洗液Η20/ΗΝ03(濃度65%)/H2O2 (濃度35%) (I:1:l，v/v/v)清洗，之后再用雙蒸水、丙酮依次清洗，最后在空氣中晾干。
[0021]2、PtNPs - C18V2+ 復(fù)合物的制備:
1)用去離子水分別制備濃度為6mM的C18V2+溶液和濃度為2mM的氯鉬酸溶液；
2)取0.1ml上述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶劑，并加熱至110° C，然后滴加
0.1ml上述制備的氯鉬酸溶液，冷卻回流20min后，將所獲得的混合物在7000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，過(guò)濾后所得的沉淀物用去離子水和乙醇沖洗，最終產(chǎn)物分散在乙醇中，最后用超聲處理，超聲頻率為28kHz，處理時(shí)間3min。
[0022]PtNPs - C18V2+的掃描電鏡圖片如圖1所示。
[0023]以上制備的PtNPs - C18V2+復(fù)合物進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):
一、結(jié)合性能的測(cè)定
1、主要材料:
綠色熒光蛋白質(zhì)粒(pEGFP-Cl) ;HEPES平衡鹽溶液(自配)；電泳緩沖液(0.5XTBE，自配)；DNA上樣緩沖液；溴化乙啶(EB)。
[0024]2、主要方法:
取1μ I上述制備的PtNPs-C18V2+溶液(5mg PtNPs - C18V2+溶解在500 μ I雙蒸水中)與I P Id 的 pEGFP-Cl 水溶液(0.1yg /μ I)以及 8μ I 的雙蒸水(ρΗ=7.4 water)在 1.5ml 離心管中混合，置于室溫下30min讓其充分結(jié)合；
PtNPs - C18V2+ pEGFP-Cl 的質(zhì)量比分別采用 100:1，50:1，30:1，10:1，1:1 ;
在5000rpm的速度下離心5min，將沉淀物加載到1%的瓊脂糖(EB0.1yg /ml)在TAE的緩沖下，在100V電壓下跑40min，然后在320nm處觀察條帶。
[0025]3、結(jié)果:
結(jié)果觀察，有多種條帶出現(xiàn)，這是因?yàn)镻EGFP-Cl有多種構(gòu)型所致。在質(zhì)量比30:1，10:1,1:1處條帶清晰明顯，說(shuō)明在這些質(zhì)量比之下，DNA和納米顆粒結(jié)合不是很好，到了100:1，50:1條帶消失，說(shuō)明結(jié)合完全了。
[0026]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:帶正電荷的pEGFP-Cl和PtNPs-C18V2+有一個(gè)最佳的結(jié)合比，超出50:1以后過(guò)多的納米顆粒顯得不再重要，所以PtNPs - C18V2+和pEGFP-Cl的質(zhì)量比采用50:1進(jìn)行轉(zhuǎn)染。
[0027]二、轉(zhuǎn)染
1、主要材料:
人乳腺癌細(xì)胞；231@pEGFP-Cl聯(lián)合體(上述制備)；DMEM培養(yǎng)基；胎牛血清FBS ；6孔培養(yǎng)板。
[0028]2、主要方法:
O細(xì)胞的培養(yǎng):將人乳腺癌細(xì)胞用胰蛋白酶-EDTA消化下來(lái)，計(jì)數(shù)后加入到6孔板中(5X IO6/孔)，用含F(xiàn)BS10%的DMEM溶液并加轉(zhuǎn)染優(yōu)化試劑培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%~70%的
融合度；
2)細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn):將培養(yǎng)好的細(xì)胞上清除去，換新的培養(yǎng)液，并加入質(zhì)量比50:1的PtNPs - C18V2+@pEGFP-Cl聯(lián)合體，培養(yǎng)48h后分別對(duì)其熒光顯微鏡觀察(結(jié)果參見(jiàn)圖2、細(xì)胞存活率(碘化吡啶標(biāo)識(shí)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)——結(jié)果參見(jiàn)圖3)、以及轉(zhuǎn)染效率(流式細(xì)胞儀檢測(cè)——結(jié)果參見(jiàn)圖4)進(jìn)行測(cè)定。[0029]3、結(jié)果分析:
如圖2所示，熒光顯微鏡下觀察可以看出有明顯綠色熒光，并且覆蓋面比較大。
[0030]如圖3所示，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞生存率圖中分別為無(wú)添加物、PtNPs - C18V2+IgpEGFP-Cl聯(lián)合體、Iipofectamine 20000 pEGFP-Cl聯(lián)合體的生存率，可以看到PtNPs - C18V2+OpEGFP-Cl聯(lián)合體對(duì)細(xì)胞生存率的影響是很小的，比Iipofectamine 20000 pEGFP-Cl聯(lián)合體的影響小很多。
[0031]如圖4所示，轉(zhuǎn)染效率圖中可以看到PtNPs - C18V2+IgpEGFP-Cl聯(lián)合體可以達(dá)到約40%的轉(zhuǎn)染效率，這是在保證了細(xì)胞生存率的前提下達(dá)到了一個(gè)較高的轉(zhuǎn)染效率，其雖然不及Iipofectamine 2000高,但是其高細(xì)胞相容性是Iipofectamine 2000所無(wú)法比擬的，表現(xiàn)出了 PtNPs - C18V2+做為轉(zhuǎn)染試劑的巨大潛力。
[0032]由此，本發(fā)明所制備的平均粒徑為IOOnm的PtNPs - C18V2+復(fù)合物，表現(xiàn)出了良好的細(xì)胞相容性，具有穩(wěn)定且較高的轉(zhuǎn)染效率，符合轉(zhuǎn)染要求，能夠作為基因轉(zhuǎn)染材料用于抗腫瘤藥物的制備。
[0033]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)·方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種納米基因?qū)氩牧希涮卣髟谟?它是由C18V2+和氯鉬酸反應(yīng)制成的平均粒徑為IOOnm的PtNPs - C18V2+復(fù)合物，其中C18V2+和氯鉬酸用量的摩爾比為3:1; 所述PtNPs - C18V2+復(fù)合物的制備方法如下: 1)用去離子水分別制備濃度為6mM的C18V2+溶液和濃度為2mM的氯鉬酸溶液； 2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加熱至110° C，然后滴加0.1ml所述氯鉬酸溶液,冷卻回流20min后，將所獲得的混合物在7000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，過(guò)濾后所得的沉淀物用去離子水和乙醇沖洗，最終產(chǎn)物分散在乙醇中，最后用超聲處理。
2.—種納米基因?qū)氩牧系闹苽浞椒ǎ涮卣髟谟?包括以下步驟: 1)用去離子水分別制備濃度為6mM的C18V2+溶液和濃度為2mM的氯鉬酸溶液； 2)取0.1ml所述C18V2+溶液，加入5ml 二甲基甲酰胺溶液，并加熱至110° C，然后滴加0.1ml所述氯鉬酸溶液,冷卻回流20min后,將所獲得的混合物在7000rpm轉(zhuǎn)速下離心3min，過(guò)濾后所得的沉淀物用去離子水和乙醇沖洗，最終產(chǎn)物分散在乙醇中，最后用超聲處理，超聲頻率為28kHz，處理時(shí)間3min。
3.如權(quán)利要求1所述的一種納米基因?qū)氩牧系挠猛?，其特征在?所述PtNPs-C18V2+復(fù)合物與綠色熒光蛋白質(zhì)?；騊GFP以非共價(jià)方式結(jié)合，形成無(wú)機(jī)納米基因?qū)胂到y(tǒng)，用于基因轉(zhuǎn)染。
4.如權(quán)利要求3所述的一種納米基因?qū)氩牧系挠猛?，其特征在?所述PtNPs-C18V2+復(fù)合物作為基因轉(zhuǎn)染材料在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK103627719SQ201310620389
【公開(kāi)日】2014年3月12日 申請(qǐng)日期:2013年11月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月29日
【發(fā)明者】王深明, 徐安武, 張德元, 常光其, 周鴻雁, 李梓倫, 夏浩明, 張紅霞 申請(qǐng)人:中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院