產(chǎn)卡那霉素b工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了高產(chǎn)卡那霉素B基因工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。本發(fā)明先對黑暗鏈霉菌中安普霉素生物合成基因aprD3-D4進行框內(nèi)敲除，然后進一步敲除氨甲酰轉(zhuǎn)移酶基因tobZ，得到大量積累卡那霉素B的生產(chǎn)菌株Streptomycestenebrarius314(△aprD3-D4+△tobZ)。本發(fā)明的菌株產(chǎn)量高，品質(zhì)好，組份單一，遺傳穩(wěn)定，可用于大規(guī)模生產(chǎn)卡那霉素B，解決了長期以來需要從卡那霉素A生產(chǎn)過程中的殘液，分離少量卡那霉素B的困局，實現(xiàn)了直接發(fā)酵生產(chǎn)卡那霉素B的獨特優(yōu)勢，達到了低成本，低能耗，不產(chǎn)生二次污染的潔凈生產(chǎn)目的，開創(chuàng)了全新的制備卡那霉素B新方法，解決了阿貝卡星及地貝卡星合成原料緊缺的難題，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】產(chǎn)卡那霉素B工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物制藥、基因工程與微生物分子遺傳學【技術(shù)領(lǐng)域】，針對產(chǎn)業(yè)化中的科學技術(shù)難題，引入交叉學科技術(shù)和微生物分子遺傳學技術(shù)，解決生產(chǎn)過程中的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，涉及一種主產(chǎn)卡那霉素B基因工程菌及其構(gòu)建和應(yīng)用，達到低耗，高產(chǎn)，穩(wěn)產(chǎn)，環(huán)保，潔凈和高質(zhì)的效果。
【背景技術(shù)】
[0002]卡那霉素B(Kanamycin B)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，具有很強的抑殺菌能力，且對金黃色葡萄球菌的作用明顯優(yōu)于頭孢菌素、四環(huán)素以及青霉素等抗生素。但其耳腎毒性較高，且易于被氨基糖苷類鈍化酶鈍化，從而限制了卡那霉素B在臨床上的應(yīng)用。為了克服這些缺陷，日本科學家梅澤等對卡那霉素B進行了結(jié)構(gòu)改造，脫去卡那霉素B中的3'位和4'位羥基，得到地貝卡星(Dibekacin，3'，4/ -雙去氧卡那霉素B)，地貝卡星不僅保留了卡那霉素B的抗菌活性，且抵制氨基糖苷類鈍化酶攻擊的能力明顯強于卡那霉素B，`在臨床上得到廣泛應(yīng)用。梅澤等人進一步在地貝卡星的Cl位氨基上引入α-氨基-Y-羥基丁酸側(cè)鏈，得到阿貝卡星(Arbekacin)。阿貝卡星的耐鈍化酶能力更強，耳腎毒性更低，對許多耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌有效。因此，卡那霉素B是制備半合成抗生素阿貝卡星及其中間體地貝卡星的重要原料(圖1)。
[0003]目前工業(yè)上使用的卡那霉素B主要從卡那鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到。但卡那鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的主要組分為卡那霉素A，卡那霉素B的含量較低，且這兩種組分結(jié)構(gòu)相似，導(dǎo)致卡那霉素B的提取精制十分困難，價格昂貴，無法大規(guī)模生產(chǎn)，從而大大束縛了阿貝卡星與地貝卡星的開發(fā)應(yīng)用?？敲顾谺也可通過氨甲酰卡那霉素B水解制得，氨甲酰卡那霉素B是黑暗鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物中的三種主要組分之一，但與其他兩種主要組分(安普霉素和氨甲酰妥布霉素)相比，氨甲酰卡那霉素B產(chǎn)量很低。從發(fā)酵調(diào)控提高氨甲酰卡那霉素B產(chǎn)量非常困難[Irina Borodina, Charlotte Sch0..ller, Anna Eliasson, and Jens Nielsen.Metabolic Network Analysis of Streptomyces tenebrarius, a 51 treptomycesSpecieswith an Active Entner-Doudoroff Pathway.Applied and environmental microbiology，May 2005, p.2294 - 2302]，因此，很難從發(fā)酵液中提取精制。此外，氨甲?？敲顾谺與氨甲酰妥布霉素的理化性質(zhì)也很相似，導(dǎo)致這兩種重要藥物的提取分離變得非常困難。因此，若從黑暗鏈霉菌發(fā)酵液中提取氨甲?？敲顾谺，將面臨著氨甲酰卡那霉素B含量過低與提取精制困難兩大難題。
[0004]此外，從氨甲酰卡那霉素B制備卡那霉素B，需要在堿性條件下經(jīng)過高溫熱水解，去掉氨甲?；?，才能得到卡那霉素B。由于水解過程存在化學反應(yīng)平衡問題，因此或多或少都存在部分氨甲酰卡那霉素B不能完全轉(zhuǎn)化為卡那霉素B，因此要制備符合藥品規(guī)定質(zhì)量標準的卡那霉素B就變得非常困難。此外，堿性(pHIO)高溫水解不僅是高能耗過程，而且屬危險性操作，還會破壞一定數(shù)量的卡那霉素B，產(chǎn)生二次副產(chǎn)物，給制備符合質(zhì)量標準的卡那霉素B添加了更多的副產(chǎn)物。因此，堿性水解也是產(chǎn)業(yè)化中的無奈之舉，成了生產(chǎn)過程的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸。如果能從發(fā)酵法直接獲得卡那霉素B，所有這些難題將迎刃而解。
[0005]長期以來，對制備卡那霉素B的研究，主要集中在對其產(chǎn)生菌一卡那鏈霉菌的發(fā)掘與選育，以及通過化學方法對其進行結(jié)構(gòu)修飾與改造。近年來，對卡那霉素生物合成基因的研究，雖然也取得了一定進展，卡那霉素生物合成途徑也逐漸被闡明，但卡那鏈霉菌的遺傳操作體系至今未取得突破，大大束縛了卡那鏈霉菌的遺傳改造。所幸的是，近年來隨著鏈霉菌分子生物學的發(fā)展，黑暗鏈霉菌中安普霉素、氨甲酰妥布霉素以及氨甲酰卡那霉素B的生物合成途徑逐步被闡明，且黑暗鏈霉菌遺傳操作體系也逐步建立[W.Hongand
S.Yan.Engineering Streptomyces tenebrarius to synthesize single componentof carbamoyl tobramycin.Letters in Applied Microbiology, 2012， April, pl_7 ；朱碧銀，洪文榮，李輝.黑暗鏈霉菌aprFG基因功能的研究.食品與生物技術(shù)學報，2011，31 (4)，P391-395.]。這為采用分子生物學技術(shù)改造黑暗鏈霉菌，阻斷安普霉素與氨甲酰妥布霉素的生物合成，達到定向合成氨甲?？敲顾谺或直接合成卡那霉素B奠定了基礎(chǔ)。推測的安普霉素生物合成途徑見圖2，推測的氨甲?？敲顾谺與氨甲酰妥布霉素的生物合成途徑見圖3。
[0006]黑暗鏈霉菌中安普霉素生物合成基因簇上的不僅是安普霉素生物合成過程中的關(guān)鍵基因，還參與了氨甲酰妥布霉素生物合成過程的3'-脫羥基反應(yīng)。在氨甲酰妥布霉素與氨甲?？敲顾谺的生物合成途徑中，先合成卡那霉素B，然后通過3'-脫羥基酶催化形成妥布霉素，妥布霉素與卡那霉素B最后在氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶TobZ的催化下，分別形成氨甲酰妥布霉素與氨甲酰卡那霉素B。理論上，敲除安普霉素生物合成基因aprD3-D4，將同時阻斷黑暗鏈霉菌中安普霉素與氨甲酰妥布霉素兩大生物合成代謝，使代謝流集中轉(zhuǎn)向氨甲?？敲顾谺，從而得到高產(chǎn)氨甲?？敲顾谺的基因工程菌。若在此基礎(chǔ)上進一步敲除氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)移酶基因tobΖ，將阻斷由卡那霉素B通過氨甲酰化作用轉(zhuǎn)化為氨甲?？敲顾谺的合成步驟，從而得到直接產(chǎn)生卡那霉素B的基因工程菌[專利:201110333833.6，一株產(chǎn)氨甲酰妥布霉素工程菌及其應(yīng)用，洪文榮，嚴紹德]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于解決長期困擾生產(chǎn)上的關(guān)鍵技術(shù)難題，利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)，現(xiàn)代分子遺傳學技術(shù)，實現(xiàn)規(guī)模化，低成本，低污染，高質(zhì)量制備卡那霉素B的現(xiàn)代化潔凈生產(chǎn)目標。提供高產(chǎn)卡那霉素B基因工程菌的構(gòu)建及其應(yīng)用，同時解決為合成抗耐藥菌藥物阿貝卡星及其中間體地貝卡星所需原料卡那霉素B的緊缺難題。
[0008]本發(fā)明利用微生物分子遺傳學技術(shù)和基因工程技術(shù)，以工業(yè)化高產(chǎn)黑暗鏈霉菌Tt-49 (5: tenebrariusTt-AQ)作為出發(fā)菌株，敲除安普霉素生物合成基因簇上aprD3~aprQ~aprD4基因和氨甲酰妥布霉素生物合成基因簇上?οΑΖ基因的重要序列，從而阻斷安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素的生物合成，得到代謝流轉(zhuǎn)向合成卡那霉素B的工程菌,積累大量卡那霉素B。該菌株命名為tenebrarius DZ314(Δ aprD3~D4+ Δ tobZ)，于2013 年9月27日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC 8286。保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。[0009]本發(fā)明主要包括以下幾個步驟:
I)敲除基因aprD3-D4重組質(zhì)粒pBD5的構(gòu)建
重組質(zhì)粒PBD5的構(gòu)建是以溫敏型穿梭質(zhì)粒pKC1139為基礎(chǔ)，通過PCR擴增aprD3_D4上下游各約2000bp的片段作為同源交換臂，將兩者插入到PKC1139的多克隆位點，再在交換臂外側(cè)插入紅霉素抗性基因作為篩選標記。
[0010]2)重組質(zhì)粒PBD5轉(zhuǎn)化黑暗鏈霉菌
采用以萬.co7i ET12657(pUZ8002)介導(dǎo)的接合轉(zhuǎn)移技術(shù)。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化萬.ET12657后，經(jīng)接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入黑暗鏈霉菌，然后在紅霉素篩選壓力下，篩選通過其所攜帶的交換臂與黑暗鏈霉菌染色體上的同源區(qū)段發(fā)生重組，整合到染色體上的單交換接合子。
[0011]將單交換接合子在斜面上松弛傳代后分離單菌落，影印到添加紅霉素的抗性平板和不添加紅霉素的普通平板上，得到在普通平板上生長而在抗性平板上不生長的紅霉素敏感型(Erys)菌株，然后根據(jù)同源重組模型設(shè)計特定引物，利用PCR方法對Erys菌株進行篩選驗證和測序，最終確認篩選到的工程菌是目標突變株，專一性地合成卡那霉素B。
[0012]3)滅活aprD3_D4基因功能突變株的篩選與鑒定；
\)aprD3~D4突變株發(fā)酵與產(chǎn)物分析；
5)敲除基因?ΜΖ重組質(zhì)粒ρΒΖ5的構(gòu)建；
重組質(zhì)粒ΡΒΖ5的構(gòu)建采用與pBD5相似的構(gòu)建方法，同源交換臂為基因?ΜΖ兩端約2000bp的序列ο
[0013]6)滅活?ο從突變株的篩選與鑒定；
7)?ΜΖ阻斷突變株發(fā)酵與產(chǎn)物分析。
[0014]發(fā)酵液經(jīng)處理后，經(jīng)離子交換樹脂提取發(fā)酵代謝產(chǎn)物，然后采用TLC、生物顯影以及HPLC-MS對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行確認。
[0015]產(chǎn)卡那霉素B工程菌在卡那霉素B產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用，具體包括以下步驟:
(1)基因工程菌斜面培養(yǎng)；
(2)基因工程菌深層菌絲種子培養(yǎng)；
(3)基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng)，代謝產(chǎn)物分離提?。?br> (4)代謝產(chǎn)物分析檢測。
[0016]其中，所述培養(yǎng)基組成如下:
I)斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 24.0~36.0，蛋白胨 4.0~6.0，KCl，F(xiàn)eSO4.7H200.008~0.012，K2HPO4 0.8~1.2，MgSO4 0.4~0.6，瓊脂 16.0~24.0。
[0017]2)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4.0-6.0，玉米淀粉，黃豆餅粉12.(Tl8.0, KCl
0.8~1.2，MgSO4 4.0~6.0, KH2PO4 0.4~0.6，CaCl2 0.20~0.30。
[0018]3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0-18.0,玉米粉，黃豆餅粉28.0-42.0,玉米淀粉16.0~24.0,魚粉5.8~7.2，蠶蛹粉5.6~8.4，豆油8.0~12.0,淀粉酶0.4~0.6，(NH4)2SO4
5.6~8.4，MgSO4 8.8~13.2，CaCO3 5.6~8.4，ZnSO4 0.08~0.12，pH 7.0~7.2。
[0019]其中，所述培養(yǎng)基組成優(yōu)選如下:
I)斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖 30.0,蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO4.7H20 0.01, K2HPO4
1.0, MgSO4 0.5，瓊脂 20.0。
[0020]2)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黃豆餅粉15.0, KCl 1.0, MgSO45.0, KH2PO4 0.5，CaCl2 0.25。
[0021]3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黃豆餅粉35.0，玉米淀粉20.0，魚粉 6.0，蠶蛹粉 7.0，豆油 10.0，淀粉酶 0.5，(NH4)2SO4 7.0, MgSO4 11.0，CaCO3 7.0, ZnSO4
0.1，pH 7.0~7.2。
[0022]本發(fā)明利用黑暗鏈霉菌構(gòu)建工程菌，生產(chǎn)卡那霉素B，消除了安普霉素，氨甲酰卡那霉素，氨甲酰妥布霉素的形成。本發(fā)明的菌株產(chǎn)量高，品質(zhì)好，組份單一，遺傳穩(wěn)定，可用于大規(guī)模生產(chǎn)卡那霉素B，解決了長期以來需要從卡那霉素A生產(chǎn)過程中的殘液，分離少量卡那霉素B的困局，實現(xiàn)了直接發(fā)酵生產(chǎn)卡那霉素B的獨特優(yōu)勢，可以大大降低生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝，省略堿性高溫水解工序，消除污染，避免二次副產(chǎn)物的產(chǎn)生，徹底解決了產(chǎn)業(yè)化中的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸，起到一舉多得的良好效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1卡那霉素B、地貝卡星及阿貝卡星化學結(jié)構(gòu)。
[0024]圖2安普霉素的生物合成途徑。
[0025]圖3氨甲酰卡那霉素B與氨甲酰妥布霉素生物合成途徑。
[0026]圖4重組質(zhì)粒 pBD5構(gòu)建流程圖。
[0027]圖5重組質(zhì)粒pBZ5構(gòu)建流程圖。
[0028]圖6出發(fā)菌株5: tenebrariuslt-A9發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC-MS分析圖譜。
[0029]圖7基因aprD3_D4阻斷突變株5: tenebrarius312發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC-MS分析圖
-1'TfeP曰。
[0030]圖8基因tobZ阻斷突變株S.tenebrarius^發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC-MS分析圖譜?！揪唧w實施方式】
[0031]實施例1:重組質(zhì)粒pBD5的構(gòu)建
以S.tenebrariuslt-AQ染色體DNA為模板，利用引物TO1/PD2擴增約2000bp的上游交換臂BDl，該片段包括a/ττ似部分序列及其上游片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)及和油al酶切，連接到經(jīng)相同酶酶切的PKC1139載體上，得到中間質(zhì)粒pBD3。然后以Tt_49染色體DNA為模板，利用引物PD3/PD4擴增約2000bp的下游交換臂BD2，該片段包括部分序列及其下游片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)油al和歷./?(! III酶切后連接到經(jīng)相同酶酶切的pBD3上，得到中間質(zhì)粒PBD4。最后用及酶切含紅霉素抗性基因的質(zhì)粒pAGe，回收1746bp的片段連接到經(jīng)AcoTPI酶切并去磷酸化處理的pBD4上,得到重組質(zhì)粒pBD5。質(zhì)粒構(gòu)建均轉(zhuǎn)化于萬.coli DH5 α。為驗證PBD5構(gòu)建的成功與否，對其進行酶切驗證和序列測定，結(jié)果均與理論吻合，證明重組質(zhì)粒PBD5構(gòu)建正確，重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程見圖4。
[0032]實施例1的引物如下:
PDl: 5' -CCGGAATTCTGCACGTTCTCCGGGAACA-3' (SEQ ID N0.1),帶酶切位
占.PD2: 5' -CTAGTCT AGAGAACGCGATGACCAGGAACCT-3' (SEQ ID N0.2),帶油a I 酶切位
占.PD3: 5' -CTAGTCTAGAAGCGCCTGAACCTGGACACC-3' (SEQ ID N0.3)，帶油a I 酶切位點：
PD4: 5' -CCCAAGCTTAGCACCGGCAGGAACTCGT-3' (SEQ ID N0.4)，帶歷./?(! III 酶切位點。
[0033]實施例2:重組質(zhì)粒 pBD5 轉(zhuǎn)化 51 tenebrariusTt~49
將重組質(zhì)粒PBD5轉(zhuǎn)化E.coli ET12567 (pUZ8002)，得到含重組質(zhì)粒的供體菌萬.ET12567 (pUZ8002, pBD5)，過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接至30ml添加相應(yīng)抗生素(卡那霉素25μ g/ml，氯霉素25 μ g/ml，安普霉素50 μ g/ml)的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2_3 h使菌體進入對數(shù)生長期，8000 rpm離心5 min收集菌體,用等體積新鮮LB洗漆2次除去殘余的抗生素,懸浮于適量LB培養(yǎng)基中備用。同時，刮取適量成熟豐滿的義tenebrariusTt-AQ斜面孢子懸于2 X YT培養(yǎng)基中，50°C熱激10 min，冷卻至室溫。將孢子懸液和大腸桿菌懸液等比例混合，10倍梯度稀釋后涂布于MS平板，然后置于37°C培養(yǎng)18-24 h后，用含紅霉素(50 μ g/ml)與萘啶酸(25 μ g/ml)的水溶液覆蓋，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，待接合子長出。由于重組質(zhì)粒pBD5攜帶有溫度敏感型鏈霉菌復(fù)制子，只有重組質(zhì)粒PBD5通過其所攜帶的交換臂BDl或BD2與染色體上的同源區(qū)段發(fā)生重組而整合到染色體上的菌株才能生長。因此MS平板上長出的接合子即是單交換菌株。
[0034]實施例3:敲除aprD3_D4基因突變株的篩選
將單交換突菌株轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基，松弛培養(yǎng)5代后分離單菌落，影印到添加紅霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，培養(yǎng)后篩選到7株在普通平板上生長而在抗性平板上不生長的紅霉素敏感型(Erys)菌株。這些Erys菌株可能為aprD3_D4阻斷突變株，也可能回復(fù)突變株，為最終篩選到aprD3-D4阻斷突變株，通過PCR方法進行篩選驗證。
[0035]選擇D2菌株，提取染色體DNA，設(shè)計引物PD5/PD6和PD7/PD8對D2進行PCR驗證分析。利用PD5/PD6引物進行PCR，可擴增到一條2452bp的條帶，利用PD7/PD8理論上可擴增出一條6701bp的條帶，但實際上由于擴增片度過長，無法擴增出目標條帶；若BD2端發(fā)生同源單交換，利用PD7/PD8可擴增將得到一條2594bp的條帶，利用PD5/PD6理論上可擴增出一條6843bp的條帶,但同樣由于擴增片度過長,也無法擴增出目標條帶)。理論上,親株或回復(fù)突變株則可得到6701bp (Η)5/Η)6)和6843bp (PD7/PD8)的兩條帶，實際上亦擴增不到目標條帶。
[0036]電泳結(jié)果顯示，單交換菌株染色體DNA經(jīng)PD5/PD6擴增后得到了約2500bp的條帶，說明單交換菌株是在交換臂BDl端發(fā)生了同源重組；而D2經(jīng)TO5/PD6擴增后得到2500bp左右的條帶，經(jīng)TO7/PD8擴增后得到2600bp左右的條帶，因此D2為aprD3_D4被成功敲除的雙交換菌株，暫時命名為S.tenebrarius?>\2 ( Δ aprD3~D4)?
[0037]實施例3所涉及的引物如下:
PD5: 5' -TCCTGGTGTTCGTTCTGGCTCC-3' (SEQ ID N0.5);
PD6: 5' -TGAGGTTGAACTCGGTGTCGGC-3; (SEQ ID N0.6);
PD7: 5' -GGGAATGGGGAGGAACTCGT-3' (SEQ ID N0.7);
PD8: 5' -TACCGTGGCGACGAAGGTGTT-3' (SEQ ID N0.8);
實施例4:工程菌S.tenebrarius 312發(fā)酵與產(chǎn)物分析
1.黑暗鏈霉菌搖瓶發(fā)酵工藝
將突變株5: tenebrarius3l2轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，置37°C培養(yǎng)7天；待孢子成熟豐滿后，挖取IcmXlcm的斜面孢子接種至種子培養(yǎng)基，37 °C，320rpm振蕩培養(yǎng)16~18h，使菌體處于對數(shù)生長期；培養(yǎng)16~18小時后按10%的接種量(v/v)接種于裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，37°C，320 rpm搖床振蕩培養(yǎng)7天，發(fā)酵完畢。同時以出發(fā)菌株5:tenebrariuslt~AQ 作對照。
[0038]斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30.0,蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO4.7H20 0.01, K2HPO41.0, MgSO4 0.5,瓊脂 20.0, pH 自然。
[0039]種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黃豆餅粉15.0，KCl 1.0, MgSO4
5.0, KH2PO4 0.5，CaCl2 0.25，pH 自然。
[0040]發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黃豆餅粉35.0,玉米淀粉20.0，魚粉6.0，蠶蛹粉 7.0，豆油 10.0，淀粉酶 0.5，(MM)2SO4 7.0，MgSO4 11.0，CaCO3 7.0, ZnSO4 0.1,pH 7.0~7.2。
[0041]2.發(fā)酵產(chǎn)物的提取分離
發(fā)酵終止后，用10% (ν/ν)的自來水稀釋發(fā)酵液，然后加入濃硫酸酸化調(diào)節(jié)pH至
1.5~2.0，靜置30 min，然后用NaOH調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH至6.0~6.5。投入732_NH4+樹脂靜態(tài)吸附2小時，樹脂投放量按5萬u/ml左右計算。收集吸附飽和樹脂，用自來水漂洗干凈，直至無漂浮菌絲體為止。飽和樹脂裝柱后用0.1%氨水進行洗滌，當流出液pH達9.0以上時，改用5.0%的氨水進行洗脫，氨水用量為飽和樹脂體積的8~10倍，洗脫時間控制在8~10 h。收集含抗生素的解析液，解析液加熱濃縮后，用濃硫酸調(diào)pH至6.0，然后加入乙醇沉淀，去雜質(zhì)，得到抗生素結(jié)晶，最 后用無鹽水溶解成1000 μ g/ml左右的溶液，供HPLC-MS檢測。
[0042]3.發(fā)酵產(chǎn)物檢測
采用HPLC-MS對發(fā)酵產(chǎn)物進行分析檢測，液相條件:色譜柱Agilent SB-C18柱；流動相為0.2 mol/L三氟乙酸水溶液:甲醇(95:5);流速為0.6 ul/min ;柱溫30°C，進樣量Iul。
[0043]從圖6可知，出發(fā)菌株51.tenebrari usT t~49發(fā)酵產(chǎn)物中主要含安普霉素(分子量540.3)、氨甲酰妥布霉素(分子量511.3)以及少量妥布霉素(分子量468.3)。而
tenebrari us 312發(fā)酵產(chǎn)物中檢測不到安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素，但在出峰時間6.7min處出現(xiàn)了一個主峰，質(zhì)譜圖中對應(yīng)的分子量為527.3，與氨甲?？敲顾谺的分子量一致(圖7)，因此義發(fā)酵產(chǎn)生的主要組分為氨甲酰卡那霉素B。出發(fā)菌株Tt-49中由于氨甲?？敲顾谺的產(chǎn)量很低，通過HPLC-MS分析幾乎檢測不到，因此其HPLC-MS圖譜中沒有出現(xiàn)相應(yīng)的峰和對應(yīng)的分子量。但義tenebrarius3l2,電子aprD3_D4滅活后，流向妥布霉素的代謝流終止在卡那霉素B，導(dǎo)致生物合成代謝流轉(zhuǎn)向合成氨甲?？敲顾谺，因此義tenebrarius^ll發(fā)酵代謝產(chǎn)物，HPLC-MS檢測到了氨甲?？敲顾谺和少量卡那霉素B。
實施例5:重組質(zhì)粒pBZ5的構(gòu)建
以義tenebrarius?>\2染色體DNA為模板，利用弓丨物PZ1/PZ2擴增基因tobZ2022bp序列作為上游同源交換臂BZ1，PCR產(chǎn)物用及和油al酶切，連接到經(jīng)相同酶酶切的PZCl 139載體上，得到中間質(zhì)粒pBZ3。然后以義tenebrarius?,\2染色體DNA為模板，利用引物PZ3/PZ4擴增基因tobZ.2050bp的序列，作為下游同源交換臂BZ2，PCR產(chǎn)物經(jīng)油al和歷./?(! III酶切后連接到經(jīng)相同酶切的pBZ3上，得到中間質(zhì)粒pBZ4。最后及酶切含紅霉素抗性基因的質(zhì)粒pAGe，回收1746bp的片段連接到經(jīng)及酶切并去磷酸化處理的PBZ4上，得到重組質(zhì)粒pBZ5。重組質(zhì)粒構(gòu)建涉及宿主菌均為疋coli DH5 α。為驗證ρΒΖ5的正確性,對其進行酶切驗證和測序,結(jié)果均與預(yù)測一致,說明重組質(zhì)粒ρΒΖ5構(gòu)建正確，重組質(zhì)粒的構(gòu)建流程見圖5。
[0044]實施例5所涉及的弓丨物如下:
PZl: 5' -CCGGAATTCAGGTGCCGACGAGGTTCT-3' (SEQ ID N0.9),帶^boRI 酶切位點； ΡΖ2: 5' -CTAGTCTAGATAGGCCACCACGCGTCAA-3' (SEQ ID N0.10),帶油a I 酶切位
占.PZ3: 5' -CTAGTCTAGATGTCTCTACCTCCGATGGGGAAG-3' (SEQ ID N0.11),帶油a I 酶切位點；
PZ4: 5' -CCCAAGCTTCTGCGTTGTCCACTGTGGA -3' (SEQ ID N0.12),帶/ffnd III 酶切位點。
[0045]實施例6:工程菌51 tenebrariusYil 312突變株的篩選
重組質(zhì)粒PBZ5轉(zhuǎn)化萬.co7i ET12567(pUZ8002)后，通過接合轉(zhuǎn)移將重組質(zhì)粒導(dǎo)入S.tenebrarius?>\2受體菌,得到重組質(zhì)粒整合到51 tenebrarius?>\2染色體上的單交換突變株。將單交換菌株轉(zhuǎn)接斜面，松弛培養(yǎng)5代后分離單菌落，并影印到含50 μ g/ml紅霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上。在紅霉素平板上不生長而在對應(yīng)的普通平板上正常生長的Erys型菌落，可能為?ΜΖ阻斷突變株或回復(fù)突變株。
[0046]隨機挑選I株Erys型菌株，命名為Ζ2，提取染色體DNA為模板，利用雙交換篩選引物ΡΖ5/ΡΖ6進行PCR鑒定。根據(jù)同源重組原理，阻斷突變株可擴增得到約794bp的片段，回復(fù)突變株或出發(fā)菌株可擴增得到約2507bp的片段。從電泳結(jié)果可知Z2為阻斷突變株。為進一步確認Z2是?ΜΖ被成功敲除的雙交換突變株，利用ΡΖ7/ΡΖ8和ΡΖ9/ΡΖ10進行PCR擴增檢測。理論上，ΡΖ7/ΡΖ8可擴增到2606bp的目標條帶，PZ9/PZ10則可擴增到2545 bp的目標條帶。電泳結(jié)果顯示，Z2基因組DNA經(jīng)PZ7/PZ8與PZ9/PZ10擴增后均得到了與預(yù)期大小一致的片段，回收PCR產(chǎn)物并進行DNA測序，結(jié)果與預(yù)測一致。因此Z2即為?ΜΖ被成功阻斷的雙交換突變株，將其暫時命名為5: tenebrarius DZ314 ( Δ aprD3_D4— Δ tobZ)。
[0047]實施例6所涉及的引物如下:
PZ5: 5' -TTGTAGGCG GCGAAGTCCCT-3' (SEQ ID N0.13);
PZ6: 5' -TGCCTTGGTGAGGATGTCGG-3' (SEQ ID N0.14);
PZ7: 5' -ACCGACATCCTCACCAAGGC-3' (SEQ ID N0.15);
PZ8: 5' -TGGCTGGAGGAGAACTACGG-3' (SEQ ID N0.16);
PZ9: 5' -TTGTAGGCGGCGAAGTCCCT-3; (SEQ ID N0.17);
PZ10: 5' -GTCTCCAAGGGACTGGCCAA-3' (SEQ ID N0.18).實施例7:工程菌S.tenebrarius DZ314發(fā)酵產(chǎn)物分析
采用與實施例4相同的方法,對工程菌51 tenebrari us DZ314 ( Δ aprD3~D4^ Δ tobZ)進行發(fā)酵，提取代謝產(chǎn)物，并對發(fā)酵產(chǎn)物進行HPLC-MS檢測分析。結(jié)果見圖8，主峰分子量為484的是卡那霉素B，幾乎檢測不到氨甲?？敲顾谺、氨甲酰妥布霉素、妥布霉素和安普霉素。與 S tenebrari us 312 ( Δ aprD3-D4~)相比，工程菌 S.tenebrari usm?,U{/\aprD3-D4+ AtobZ)不再合成氨甲?？敲顾谺，主要合成卡那霉素B。發(fā)酵單位可達2000ug/mL以上，完全滿足產(chǎn)業(yè)化的需要，發(fā)酵條件優(yōu)化后，生產(chǎn)力將進一步大幅度提聞ο
[0048]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā) 明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.產(chǎn)卡那霉素B工程菌,其特征是:該菌株被命名為tenebrarius314(Δ aprD3-D牡Δ tobZ)，于2013年9月25日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心登記保藏，保藏編號為CGMCC 8286，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌，其特征是:在野生型黑暗鏈霉菌中敲除安普霉素生物合成基因簇中的基因aprD3-D4和tobZ的保守性序列，達到滅活目的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌，其特征是:所述的敲除基因后的黑暗鏈霉菌中安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素生物合成均被阻斷，氨甲?；虮粶缁?，最終只合成卡那霉素B。
4.如權(quán)利要求1、2所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌的構(gòu)建方法，其特征是主要包括以下步驟: 1)敲除aprD3-D4基因載體構(gòu)建； 2)im'aprD3-D4基因載體接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入黑暗鏈霉菌； 3)敲除aprD3-D4基因突變株的篩選； 4)敲除aprD3-D4基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分析； 5)敲除tobZ基因載體 構(gòu)建； 6)敲除?ΜΖ基因載體導(dǎo)入黑暗鏈霉菌； 7)敲除?ΜΖ基因突變株的篩選； 8)敲除?ΜΖ基因工程菌發(fā)酵產(chǎn)物分析。
5.如權(quán)利要求1~4所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌的應(yīng)用，其特征是:在卡那霉素B產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用，具體包括以下步驟: 1)基因工程菌斜面培養(yǎng)； 2)基因工程菌深層菌絲種子培養(yǎng)； 3)基因工程菌發(fā)酵培養(yǎng),代謝產(chǎn)物分離提?。? 4)代謝產(chǎn)物分析檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌的應(yīng)用，其特征在于:所述培養(yǎng)基組成如下: 1)斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖24.0~36.0，蛋白胨 4.0~6.0，KCl，F(xiàn)eSO4.7H200.008~0.012，K2HPO4 0.8~1.2，MgSO4 0.4~0.6，瓊脂 16.0~24.0 ； 2)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖4.0~6.0，玉米淀粉，黃豆餅粉12.0-18.0, KCl 0.8~1.2，MgSO4 4.0~6.0, KH2PO4 0.4~0.6，CaCl2 0.20~0.30 ； 3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖12.0-18.0,玉米粉，黃豆餅粉28.0-42.0,玉米淀粉16.0~24.0,魚粉 5.8~7.2，蠶蛹粉 5.6~8.4，豆油 8.0~12.0,淀粉酶 0.4~0.6，(NH4)2SO45.6~8.4，MgSO4 8.8~13.2，CaCO3 5.6~8.4，ZnSO4 0.08~0.12，pH 7.0~7.2。
7.根據(jù)權(quán)利要求5、6所述的產(chǎn)卡那霉素B工程菌的應(yīng)用，其特征在于:所述培養(yǎng)基組成優(yōu)選如下: 1)斜面培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30.0,蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO4.7H20 0.01, K2HPO4.1.0, MgSO4 0.5，瓊脂 20.0 ； 2)種子培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黃豆餅粉15.0, KCl 1.0，MgSO4 5.0，KH2PO4 0.5，CaCl2 0.25 ；.3)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黃豆餅粉35.0，玉米淀粉20.0，魚粉 .6.0，蠶蛹粉 7.0，豆油 10.0，淀粉酶 0.5，(MM)2SO4 7.0, MgSO4 11.0, CaCO3 7.0, ZnSO4 0.1，pH 7.0~7.2。
【文檔編號】C12N1/21GK103614330SQ201310621533
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月30日
【發(fā)明者】洪文榮 申請人:福州市鼓樓區(qū)榮德生物科技有限公司