一種結(jié)合熒光定量pcr技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法，本方法包括：熒光定量PCR、制備PCR產(chǎn)物單鏈模板、測(cè)序反應(yīng)及檢測(cè)共3個(gè)步驟。本方法采用熒光定量PCR代替?zhèn)鹘y(tǒng)的普通PCR加電泳的模式對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行擴(kuò)增和擴(kuò)增效果檢測(cè)，既縮短了檢測(cè)時(shí)間，又降低了假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)，非常適用于臨床檢測(cè)等醫(yī)療領(lǐng)域。同時(shí)，根據(jù)熒光定量PCR結(jié)果，易于精確判斷測(cè)序模板量，指導(dǎo)后續(xù)的基因測(cè)序，提高了檢測(cè)的靈敏度和基因測(cè)序的效率。
【專利說明】一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。【背景技術(shù)】
[0002]測(cè)序技術(shù)是序列分析和突變位點(diǎn)檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，通過測(cè)序可直觀的得到靶標(biāo)的核酸序列，為遺傳性疾病相關(guān)位點(diǎn)發(fā)現(xiàn)、耐藥位點(diǎn)分析等提供便利。核酸序列也是病原微生物分型的基礎(chǔ)，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)等病原微生物的亞型區(qū)分都是基于病毒的全基因組序列差異或部分區(qū)域的序列差異。
[0003]近年來，已有一些測(cè)序產(chǎn)品和解決方案用于臨床診斷領(lǐng)域，包括病毒亞型分析、用藥位點(diǎn)篩查、遺傳疾病監(jiān)測(cè)等。與傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)相比，焦磷酸測(cè)序技術(shù)更適合在臨床大規(guī)模運(yùn)用。主要在于:
[0004](I)焦磷酸測(cè)序整個(gè)流程步驟少，操作簡(jiǎn)便，且為實(shí)時(shí)檢測(cè)，即測(cè)序和檢測(cè)是同步進(jìn)行，免去測(cè)序產(chǎn)物純化步驟，因此耗時(shí)少，檢測(cè)過程僅需10分鐘左右，對(duì)于一個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目而言，從樣本處理至獲得測(cè)序結(jié)果，只需要6小時(shí)左右，基本當(dāng)天即可出報(bào)告，非常適合臨床使用，而傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序需要1.5-2個(gè)工作日左右；
[0005](2)焦磷酸測(cè)序的靈敏度可至5%，若結(jié)合一些突變富集技術(shù)，可至1%甚至更低，而傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序的靈敏度只有15-20%左右；
[0006](3)焦磷酸測(cè)序可進(jìn)行定量，即給出雜合子中不同基因型的比例，而傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序不能做到這點(diǎn)；
[0007](4)焦磷酸測(cè)序結(jié)果為軟件自動(dòng)判斷，而傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序需人工分析突變位點(diǎn)。
[0008]但無論傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序還是優(yōu)勢(shì)更為明顯的焦磷酸測(cè)序，都是基于普通PCR，對(duì)于臨床檢測(cè)，還存在一定的弊端，這些弊端包括:
[0009](I)耗時(shí)長(zhǎng):PCR_電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一般需要2_3個(gè)小時(shí)；
[0010](2)易污染:電泳、PCR產(chǎn)物純化(一般為切膠回收)等過程，均耗時(shí)長(zhǎng)，易產(chǎn)生大量PCR產(chǎn)物氣溶膠，引起假陽(yáng)性；
[0011](3)易漏檢:電泳檢測(cè)靈敏度低，易造成漏檢；
[0012](4)易損失:PCR產(chǎn)物純化過程中將損失一部分，影響低濃度模板的檢測(cè)效果；
[0013](5)難定量:PCR產(chǎn)物的量通過電泳只能粗略估計(jì)，產(chǎn)物過多將使測(cè)序引物過快消耗，影響檢測(cè)效果，與此同時(shí)，臨床上有些項(xiàng)目是有定量要求的，如乙型肝炎病毒定量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法，本發(fā)明一方面克服了焦磷 酸測(cè)序的現(xiàn)有弊端，提供一種適于臨床診斷領(lǐng)域的焦磷酸測(cè)序使用方法，另一方面提供基于上述方法在制備基因檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0015]本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下:一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法，包括:
[0016]I)熒光定量PCR:使用特異性的引物和帶熒光標(biāo)記的探針，對(duì)靶標(biāo)所在核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀予以實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后獲得靶標(biāo)的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物；
[0017]2)制備PCR產(chǎn)物單鏈模板:將PCR產(chǎn)物固定于鏈霉親和素瓊脂糖HP珠子上，并制備成單鏈狀態(tài)；
[0018]3)測(cè)序反應(yīng)及檢測(cè):使用特異性的測(cè)序引物，在預(yù)先設(shè)置好的焦磷酸測(cè)序儀上，對(duì)PCR產(chǎn)物的單鏈模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測(cè)測(cè)序結(jié)果。
[0019]本發(fā)明還提供了一種基于上述方法的核酸檢測(cè)試劑盒，所述核酸檢測(cè)試劑盒包括:
[0020]I)用于熒光定量PCR的各種反應(yīng)試劑，例如:目的片段特異性的PCR引物、目的片段特異性的熒光探針、DNA聚合酶；
[0021]2)用于固定并制備PCR產(chǎn)物單鏈模板的試劑；
[0022]3)用于測(cè)序反應(yīng)的試劑，例如:目的片段特異性的測(cè)序引物。
[0023]在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。
[0024]進(jìn)一步 ，所述核酸檢測(cè)試劑盒還包括:PCR反應(yīng)液、測(cè)序反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)、dUTP。
[0025]由于采用了上述的技術(shù)方案，本發(fā)明提供的一種結(jié)合熒光定量PCR的焦磷酸測(cè)序方法，克服了普通PCR的弊端:
[0026](I)熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)間較普通PCR結(jié)合電泳檢測(cè)的模式，縮短1_2個(gè)小時(shí)；
[0027](2)無電泳、切膠純化等操作，最大限度減少了 PCR產(chǎn)物氣溶膠，降低了假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)；
[0028](3)熒光定量PCR的靈敏度高，一些電泳檢測(cè)沒有條帶或條帶模糊PCR產(chǎn)物，也能進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，降低了漏檢率；
[0029](4)無切膠純化等操作，避免PCR產(chǎn)物的大量損失；
[0030](5)通過熒光值判斷PCR產(chǎn)物的量，較電泳圖確認(rèn)準(zhǔn)確度更高，進(jìn)而提高測(cè)序峰圖的質(zhì)量。
[0031]總之，基于以上結(jié)合熒光定量PCR的焦磷酸測(cè)序方法制備的基因檢測(cè)試劑盒，能有效抑制PCR產(chǎn)物污染、減少假陽(yáng)性、提高檢測(cè)靈敏度、縮短檢測(cè)時(shí)間，該技術(shù)及基于該技術(shù)開發(fā)的相關(guān)產(chǎn)品非常適合在臨床診斷領(lǐng)域普及應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0032]圖1為樣本I和樣本2的熒光定量PCR圖；
[0033]圖2為樣本I焦磷酸測(cè)序圖；
[0034]圖3為樣本2焦磷酸測(cè)序圖；
【具體實(shí)施方式】
[0035]以下對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。[0036]以下實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第三版，科學(xué)出版社2002[美]J.薩姆布魯克，D.W拉塞爾著，黃培堂等譯)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0037]實(shí)施例1:設(shè)計(jì)并合成引物和探針
[0038]針對(duì)人KRAS基因12、13密碼子突變，設(shè)計(jì)特異性的PCR引物、熒光標(biāo)記探針和測(cè)序引物，序列如表1所示，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成和標(biāo)記。
[0039]表1
[0040]
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)合熒光定量PCR技術(shù)的焦磷酸測(cè)序方法，其特征在于，包括: O熒光定量PCR:使用特異性的引物和帶熒光標(biāo)記的探針，對(duì)靶標(biāo)所在核酸片段進(jìn)行擴(kuò)增，并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀予以實(shí)時(shí)檢測(cè)，最后獲得靶標(biāo)的定量結(jié)果和PCR產(chǎn)物； 2)制備PCR產(chǎn)物單鏈模板:將PCR產(chǎn)物固定于鏈霉親和素瓊脂糖HP珠子上，并制備成單鏈狀態(tài)； 3)測(cè)序反應(yīng)及檢測(cè):使用特異性的測(cè)序引物，在預(yù)先設(shè)置好的焦磷酸測(cè)序儀上，對(duì)PCR產(chǎn)物的單鏈模板進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，并實(shí)時(shí)檢測(cè)測(cè)序結(jié)果。
2.一種基于權(quán)利要求1所述方法的核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述核酸檢測(cè)試劑盒包括: O用于突光定量PCR的各種反應(yīng)試劑； 2)用于固定并制備PCR產(chǎn)物單鏈模板的試劑； 3)用于測(cè)序反應(yīng)的試劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的核酸檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述核酸檢測(cè)試劑盒還包括:PCR反應(yīng)液、測(cè)序反應(yīng)液、 陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量標(biāo)準(zhǔn)品、尿嘧啶-N-糖基化酶、dUTPo
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103602748SQ201310627109
【公開日】2014年2月26日 申請(qǐng)日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】王彤, 趙洪斌, 陳大方 申請(qǐng)人:瑞?；蚩萍迹ū本┕煞萦邢薰?br>